双色光电联相显微镜用于观察线粒体和溶酶体之间的相互作用

摘要

该协议描述了一种使用相关光学和电子显微镜来可视化分别用 mEosEM 和 APEX2 标记的线粒体和溶酶体的相互作用的机制。

摘要

细胞器（如线粒体和溶酶体）显示动态结构。尽管用于结构分析的透射电子显微镜具有更高的分辨率，但光学显微镜对于通过靶标特异性标记对动态细胞器进行可视化至关重要。以下协议描述了一种结合双色相关光学和电子显微镜 （CLEM） 来观察线粒体和溶酶体之间相互作用的方法。在本研究中，线粒体用 mEosEM （Mito-mEosEM） 标记，溶酶体用 TMEM192-V5-APEX2 标记。从 CLEM 图像获得的结果使我们能够观察在外部压力条件下线粒体和溶酶体之间相互作用的变化。用抑制溶酶体功能的巴弗洛霉素 （BFA） 处理导致线粒体和溶酶体之间的接触增加，导致形成被困在溶酶体内的片段化线粒体。相反，用 U18666A 治疗会抑制胆固醇从溶酶体输出，导致溶酶体被线粒体包围，表明存在一种独特的相互作用形式。本研究提出了一种观察固定细胞中线粒体和溶酶体之间相互作用的有效方法。此外，使用双色探针的 CLEM 成像为未来研究细胞器动力学及其对细胞功能和病理学的影响提供了强大的工具。

引言

线粒体和溶酶体是维持细胞稳态所必需的主要膜结合细胞器。线粒体是受裂变和融合事件调节的高动态细胞器¹.通常，线粒体被称为细胞的动力源，并以其在氧化磷酸化、ATP 产生和代谢物储存（如 calcium^{2）中的重要作用而闻名}。除了在能量代谢中的作用外，线粒体还参与许多其他细胞信号传导过程，包括细胞凋亡^3，4、钙信号传导^5、6 和脂质代谢^7，8.同样，溶酶体是高度动态的细胞器，作为细胞回收中心发挥多种作用，通过蛋白质降解、自噬、内吞作用和吞噬作用来维持细胞清洁⁹。除了在降解中的作用外，溶酶体还在细胞生理学中发挥作用，例如营养感应、稳态¹⁰、脂质代谢¹¹ 和细胞去分化¹²。

尽管存在大量关于单个细胞器功能的研究，但我们最近的研究集中在线粒体和溶酶体之间鲜为人知的串扰上，这已被证明会影响细胞生理学和病理学。线粒体和溶酶体之间的接触已在多种细胞类型中观察到，包括癌细胞、神经元和诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的细胞¹³，它们主要在细胞应激下或神经退行性疾病中观察到，例如帕金森病^13，14 和腓骨肌萎缩症¹⁵.线粒体和溶酶体之间的接触通过两个细胞器之间的离子交换（例如 Ca²⁺）¹⁶、胆固醇¹⁷ 和 iron^{18 在维持代谢稳态中起着重要作用}。此外，线粒体和溶酶体之间的接触在细胞器的质量控制中起着至关重要的作用。例如，受损的线粒体可以通过线粒体自噬过程成为降解目标，在此过程中，它们被自噬体吞噬并递送到溶酶体进行降解。因此，可以在功能失调的线粒体对细胞或正常线粒体造成进一步损害之前促进线粒体的去除。线粒体和溶酶体之间的这种相互作用对于维持细胞稳态和防止功能失调的细胞器积累至关重要。因此，只有受损的线粒体才会被选择性地去除，从而使健康的线粒体在细胞内发挥最佳功能。

光电联用显微镜 （CLEM） 是一种成像技术，它结合了光学显微镜 （LM） 和电子显微镜 （EM） 的优势，在不同尺度上提供详细的结构信息，最近作为一种研究方法而受到关注。在 CLEM 中，首先使用 LM 对样品进行成像以识别特定的感兴趣区域，然后进行 EM 样品制备步骤，例如固定、脱水和包埋。然后在电子显微镜下观察相同的样品。尽管最近报道了活细胞CLEM方法^{19，20，21，22}，但将高动态生物样品的光学图像与固定细胞的电子显微镜图像准确地结合到一个平面中仍然具有挑战性。对于线粒体和溶酶体等高动态细胞器，它们的精确定位会随着在光学显微镜下实时观察而发生变化，即使在固定所需的短延迟时间内，它们也会继续移动。

因此，在该方案中，采用了两种即使在固定溶液中仍然保持活性的不同分子标签来可视化线粒体和溶酶体之间的相互作用，它们在通过离子交换（例如，Ca²⁺）¹⁶、胆固醇¹⁷ 和铁¹⁸在这些细胞器之间。构建体 TMEM192-V5-APEX2 和 Mito-mEosEM 用于观察培养细胞中线粒体和溶酶体在 EM 和 LM 水平的相互作用。对于线粒体，选择 mEosEM 标签是因为它能够在固定液中制备 EM 样品期间保留荧光信号和 OsO₄²³。对于溶酶体，APEX2 标签（一种约 28 kDa 的蛋白质）用于研究特定蛋白质在 EM 和 LM 水平的定位²⁴。在过氧化氢存在下，APEX2 的底物 Amplex-Red 形成不溶性聚合物，可以通过共聚焦显微镜在标签靶向位置观察到。在该方案中，双色 CLEM 用于可视化固定细胞中溶酶体和线粒体之间相互作用的结构。

方案

样品制备的分步工作流程如 图 1 所示。

1. 细胞培养和转染

在
1. 37 °C 下，以 1 × 10⁵ 细胞的密度在 35 mm 玻璃网格底培养皿中培养 HeLa 细胞，培养皿中含有 DMEM、10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素和链霉素。
2. 接种细胞后第二天，根据制造商的说明，使用转染试剂（TMEM192-V5-APEX2 和 Mito-mEosEM 质粒各 1 μg，含 3 μL 转染试剂），使用 TMEM192-V5-APEX2 和 Mito-mEosEM 质粒 DNA 以 30%-40% 汇合度共转染细胞。转染后，用 DMSO 或 U18666A （2 μg/mL） 和巴弗洛霉素 A1 （100 nM） 处理细胞 18 小时。

2. 共聚焦显微成像

1. 用巴弗洛霉素和U18666A处理细胞 18 小时后，去除培养基并立即加入 250 μL 温热 （30 °C-37 °C） 固定液（2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛在 0.1 M 二甲胂酸钠溶液 [pH 7.0] 中通过轻轻移液。立即去除固定剂，用 1.5 mL 新鲜固定剂更换，并在冰上孵育 30 分钟。然后，在 1 mL 冰冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中洗涤细胞 3 x 10 分钟><。 注意：醛类烟雾有毒。所有实验均应在通风通风橱中进行。
2. 加入 1 mL 冷的 20 mM 甘氨酸溶液以淬灭醛，并在冰上孵育 10 分钟。在冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中洗涤 3 x 10 分钟。
3. 通过将 10 mM H₂O₂ 添加到 0.1 M 二甲胂酸盐溶液中，制备含有 300 μM Amplex-Red 的新鲜溶液。向样品皿中加入 500 μL Amplex-Red 溶液，并在冰上孵育 5 分钟。
4. 取出 Amplex-Red 溶液，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗 3 x 10 分钟。
5. Amplex-Red 染色后，使用共聚焦显微镜以 3 x 3 平铺扫描模式对感兴趣细胞周围的区域进行成像。使用 40 倍（或 60 倍）物镜捕获微分干涉对比 （DIC） 和荧光信号，以识别和记录网格培养皿上的网格和字母。
   注：这些概览图像用作识别塑料包埋标本中特定目标细胞的地图。
6. 使用 40 倍（或 60 倍）物镜以高放大倍率对目标细胞进行成像><，并获取 Z 堆栈图像。 注：此高放大倍率图像叠加在电子显微镜图像上以创建相关图像。

3. EM 阻滞的样品制备

1. LM 成像后，加入 1 mL 1% 还原的四氧化锇（通过在 0.3 M 二甲胂酸盐缓冲液中加入 3% 亚铁氰化钾和等体积的 2% 四氧化锇水溶液制备）在 4 °C 下后固定 1 小时，然后用蒸馏水在 4 °C 下冲洗 3 x 10 分钟><。 注意：四氧化锇烟雾有毒。所有实验均应在通风通风橱中进行。
2. 在室温下用蒸馏水冲洗 3 x 10 分钟，然后在分级乙醇系列中脱水 15 分钟，每次在室温下脱水 15 分钟（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 和 100%）。
将
3. 乙醇与环氧树脂以 3：1、1：1 和 1：3 的体积比混合，每种混合物总共制备 300 μL。将每种环氧树脂倒入培养皿中，使其在室温下孵育 1 小时。然后，使用 100% 环氧树脂进行过夜浸渍。
4. 用新鲜的环氧树脂填充包埋胶囊或 PCR 管，将管或胶囊倒置在感兴趣的区域，并将其置于 60 °C 的烘箱中 48 小时以聚合。

4. 切片和 TEM 成像

1. 环氧树脂完全聚合后，将底部玻璃浸入液氮中，将其与聚合物块分离。
2. 将标本块放入超薄切片机的样品架中，并将其放在修整块中。使用剃须刀片将树脂修剪成目标对象周围的梯形或矩形。
3. 将修剪过的标本块放入样品架中，并调整金刚石刀片。确保试样块的前缘与金刚石刀片的边缘完全平行。
4. 使用超薄切片机，从平包埋的细胞中切割约 60-70 nm 的超薄切片。将序列切片收集在 formvar 涂层的槽网格上，并在热板上干燥。
5. 用造影剂染色切片 2 分钟，柠檬酸铅 1 分钟。
6. 将网格放入 TEM 样品架中进行观察。根据光学显微镜的 DIC 图像识别感兴趣的目标细胞。使用平铺的重叠图像以 1,700 倍的放大倍率对整个细胞区域进行成像。

5. 使用 imageJ Fiji 进行图像拼接。

1. 要开始图像拼接，请启动 imageJ Fiji²⁵，然后单击"文件"|"新品 |TrakEM2 （空白） |选择存储文件夹以创建新的 TrakEM2²⁶ 项目（图 2A1）。
2. 通过将原始瓦片图像数据拖放到工作区中来打开瓦片图像数据集（图 2A2）。
3. 单击鼠标右键，然后选择 Align |此图层中的所有图像蒙太奇 |elastic （非线性块对应）），然后单击 OK 接受默认值其余参数 （图 2A3）。
4. 单击鼠标右键，然后选择 Export |制作平面图像以创建拼接图像，然后单击 文件 |Save As 以保存图像。

6. 调整荧光图像的大小

1. 打开照片放大软件（请参阅材料表）。单击 File |打开并选择荧光图像。
2. 输入与电子显微镜图像相同的宽度和高度，然后选择要在调整大小方法中应用的算法（图 2B1）。
3. 单击 File |Save AS 以保存调整大小后的图像。

7. 使用 Big Warp 插件进行基于地标的图像配准

1. 打开 ImageJ Fiji 并拖放调整大小的荧光显微照片（FM 图像）和拼接的电子显微照片（EM 图像）。
2. 点击 插件 |大数据查看器 |Big Wrap 开始注册，然后单击下拉菜单以选择 FM 图像作为移动图像，选择 EM 图像作为目标图像（图 2C1）.
   注意：每个 FM 和 EM 图像都将有三个新的弹出窗口（BigWrap 移动图像、BigWrap 固定图像和地标）来显示地标。
3. 使用缩放（鼠标滚轮）、图像旋转（按住左键的同时移动鼠标）和移动（按住右键的同时移动鼠标）等功能比较 FM 和 EM 图像，然后按键盘上的空格键打开路标模式，并按鼠标左键标记 FM 和 EM 图像中识别的至少三个地标（图 2C2，粉红色的点和红色的箭头）。
4. 标记所有已识别的特征点后，转到 File |导出动态影像 |好了，将出现一个新的弹出窗口，其中包含转换后的 FM 图像 （Figure 2C3）.
   注意：新创建的弹出窗口是基于地标转换的 FM 图像。查看对齐情况，并在必要时通过添加或修改地标并重新计算变换来进行调整。
5. 单击 File |"另存为"以保存转换后的 FM 图像。

8. CLEM 图像的叠加

1. 在 ImageJ 中，拖放转换后的 FM 图像和拼接的 EM 图像。
2. 点击图片 |类型 |8-Bit Color 为中等值和 EM 值图像设置相同的图像类型 （Figure 2D1）.
   注意：EM 图像必须按以下顺序转换两次：8 位 -> RGB 颜色 -> 8 位颜色。
3. 点击图片 |颜色 >|Merge Channels 通过从下拉菜单中分别选择 FM 和 EM 图像，将图像组合成一个合成图像 （图 2D2）。
4. 单击 File |另存为以保存 CLEM 映像。

结果

为了使用这种双色 CLEM 方案可视化线粒体和溶酶体之间的相互作用，我们采用了 Mito-mEosEM 和 TMEM192-V5-APEX2。首先使用光学显微镜对固定细胞进行成像，然后进行 EM 采样和成像。相关图像的结果显示在 图 3A，B 和 图 4A 中。按照上述方案，我们检查了在外部压力下我们是否可以观察到线粒体和溶酶体之间相互作用的变化。

用溶酶体 V-ATP 酶抑制剂 BFA 处理细胞会抑制自噬，导致线粒体质量降低并增加线粒体与溶酶体之间的相互作用²⁷。在 BFA 处理的细胞中，我们观察到线粒体被困在溶酶体中 （图 3B），与 DMSO 处理的对照细胞 （图 3A） 相比。虽然仅在电子显微照片中很难区分溶酶体内的碎片化电子密集线粒体和细胞区室，但它们可以在相关图像中轻松区分（图 3B1，B2）。在 DMSO 处理细胞的线粒体中观察到的线粒体破坏结构（图 3A1，A2;蓝色箭头）与溶酶体无关，荧光图像中似乎是被困在大线粒体内的溶酶体的结构是线粒体围绕溶酶体的结构（图 3A2;红色箭头）。

接下来，我们测试了 U18666A （2 μg/mL，持续 18 小时） 的效果，这是一种众所周知的 NPC1 抑制剂，可阻止胆固醇从溶酶体中移动²⁸。用 U18666A 处理的细胞显示线粒体和溶酶体之间的直接相互作用增加 （图 4）。此外，U18666A处理样品中线粒体和溶酶体之间的接触与 BFA 处理样品中的接触不同。在用 BFA 处理的 HeLa 细胞中，片段化的线粒体完全被困在溶酶体中，这是先前报道的线粒体自噬形态^12，29。然而，在 U18666A 处理组中，一些TMEM192阳性溶酶体似乎被线粒体吞噬（图 4D，E）^30，31。

图 1：使用基因标记荧光探针的基于 TEM 的 CLEM 示意图。（A） HeLa 细胞在 35 mm 玻璃网格底培养皿中生长。（B） 用 APEX2 蛋白的 Amplex-Red 标记固定细胞。（C） 使用共聚焦显微镜获取荧光图像。使用电动载物台和平铺扫描功能来捕获目标细胞的大型概览图像和高分辨率图像。大图像用作导航图，用于识别塑料包埋标本中目标细胞的位置。（D） 进行固定后和脱水包埋。（E） 使用填充有树脂的 PCR 管或 BEEM 胶囊在盖玻片上的目标细胞上进行包埋。（F） 树脂聚合后，去除盖玻片，在块的底面上留下印记网格图案。（G） 通过树脂表面的印记图案鉴定靶细胞，并使用超薄切片机以大约 60 nm 的厚度对靶细胞进行切片。（H） 将序列切片收集在 formvar 涂层的铜槽网格上。（I） 使用透射电子显微镜对网格进行成像。缩写： TEM = 透射电子显微镜;CLEM = 光电联用显微镜;ROI = 感兴趣区域。请点击这里查看此图的较大版本。

图 2：使用 imageJ Fiji 进行图像处理和生成 CLEM 图像。（A1） 斐济和 TrakEM2 的主 GUI。（答 2）导入使用 TEM 以 1,700 倍放大倍率采集的瓦片图像数据集。（答 3）使用 TrakeEM2 的图像对齐方法拼接图像的对齐和示例。（B1-B3）使用照片放大软件将小光显微照片转换为大型高质量图像。（C1-C3）使用 Big Wrap 插件软件在光学显微镜图像和电子显微镜图像之间配准的工作流程。（D1-D3）将转换后的 FM 图像与 EM 图像叠加以合成相关显微镜图像的过程。缩写： TEM = 透射电子显微镜;CLEM = 光电联用显微镜;FM = 荧光显微镜。请点击这里查看此图的较大版本。

图 3：用或不用巴弗洛霉素 A1 处理的线粒体和溶酶体接触位点的 CLEM 图像。HeLa 细胞与 Mito-mEosEM （线粒体;绿色） 和 TMEM192-APEX2 （溶酶体;红色）共转染，然后用 Amplex-Red 染料染色。（A） 未经处理的 HeLa 细胞。来自荧光信号的分子信息（左图）和通过 TEM 获得的超微结构信息（中图）根据线粒体信号和形态叠加（右图）。（答 1、答 2）在未经处理的 HeLa 细胞中，线粒体内膜被破坏（蓝色箭头），或者线粒体和溶酶体彼此非常接近（红色箭头）。（B1、B2）在用巴弗洛霉素 A1 处理 18 小时的 HeLa 细胞中，观察到线粒体自噬，其特征是未降解的线粒体在溶酶体中被捕获（绿色箭头）。比例尺 = 1 μm （A1，A2，B1，B2）。请点击这里查看此图的较大版本。

图 4：U18666A处理的线粒体和溶酶体接触位点的 CLEM 图像 （A） U18666A处理下 Mito-mEosEM 和 TMEM192-V5-APEX2 （Amplex-Red 标记） 表达的 HeLa 细胞的双色 CLEM 图像 （2 μg/mL，持续 18 小时）。（答 1、答 2）红色箭头表示线粒体和溶酶体之间的接触位点。比例尺 = 1 μm。（B1-B3，C1-C3） 红色箭头表示通过连续图像显示线粒体和溶酶体之间细胞器间融合的出现。比例尺 = 500 nm （B1-B3）。 比例尺 = 1 μm （C1-C3）。（D，E） 线粒体和溶酶体之间融合位点的高放大倍率 TEM 图像。伪彩用于区分线粒体（绿色）和溶酶体（红色）。比例尺 = 100 nm。请点击这里查看这个数字的放大版本。

讨论

该协议描述了双色CLEM，以使用基因编码的mEosEM和APEX2标签观察固定细胞中线粒体和溶酶体的相互作用。在过去的几十年里，显微镜的进步极大地提高了观察细胞器网络变化的能力^32,33，细胞器相互作用的研究变得越来越有趣。超分辨率显微镜已被用于观察线粒体和溶酶体之间高动态接触的变化 34,35,36。然而，尽管使用了超分辨率显微镜，但很难区分线粒体内膜和外膜（约22nm）和嵴交界处（约28nm）的厚度变化³⁷。透射电子显微镜的优点是能够以非常高的分辨率观察生物样品的结构，但缺点是图像只能以黑白形式观看，难以区分复杂图像中的细胞器。在我们的协议中，我们使用了一种CLEM方法，该方法结合了光学和电子显微镜的优点，通过用不同的颜色染色来监测两个不同细胞器的相互作用。特别是，双色 CLEM 是观察和分析线粒体自噬（溶酶体内线粒体降解过程）的宝贵工具，如图 3 所示。

活细胞成像通常在生理条件下进行，使研究人员能够实时观察动态细胞过程。然而，电子显微镜技术通常需要耗时的样品制备程序，包括固定和染色。活细胞成像和电子显微镜样品制备之间的时间延迟限制了该技术的时间分辨率，并可能导致可能遗漏动态细胞事件。为了克服活细胞CLEM的局限性，我们开发了一种双色CLEM方法，其中mEosEM探针²³ 和化学染料（Amplex-Red）被APEX2邻近标记酶³⁸ 染色，即使在恶劣的固定环境中也不会丢失荧光信号。在之前的活细胞 CLEM 研究³⁹ 中，由于活细胞成像后 TEM 采样的时间分辨率问题和样品制备的技术限制，在荧光信号和 EM 图像之间发现了差异。然而，通过获取足够时间的固定细胞的荧光图像（高放大倍率对整个细胞进行z堆栈成像），我们可以解决时间分辨率问题，并改善LM和EM图像之间的相关性（图3 和 图4）。

成功的 CLEM 结果的另一个关键因素是如何准确地将 LM 图像与 EM 图像配准。为此，我们首先在光学显微镜成像期间结合使用 DIC 和荧光成像模式，以创建靶细胞周围的导航图。使用该导航图，我们可以轻松识别超切片机和 TEM 上感兴趣的细胞。其次，通过获取高放大倍率的全细胞的TEM图块图像，我们能够获得许多可用于图像配准的标志。根据我们的经验，地标数量越多，Big Warp 插件中 LM 和 EM 图像的对齐精度就越高。

在这项研究中，我们展示了溶酶体和线粒体的相互作用结构域，并获得了高分辨率的 CLEM 结果。此外，双色探针可以精确区分线粒体和溶酶体。但是，这种方法有一些局限性。首先，如果APEX2酶对Amplex-Red进行近端标记期间的反应时间过长，则Amplex-Red将扩散并染色比目标蛋白位置³⁸更宽。其次，溶酶体被线粒体吞噬的区域的厚度（z轴体积）非常小，因此无法在50nm厚的连续切片中确定两个细胞器膜的融合。此外，通过光学显微镜精确对齐光学切片的 z 轴和通过超切片机精确对齐机械切片的 z 轴是一项重大挑战。为了克服这些限制，双色CLEM可以与传统的电子断层扫描⁴⁰ 或连续切片体积CLEM⁴¹结合使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>化学品和试剂
25% 戊二醛	显微镜科学	16200	醛烟雾具有剧毒。仅在通风橱中使用。
30% 过氧化氢溶液	Merck	107210
4% 多聚甲醛溶液	Biosesang	PC2031-100-00	ldehyde 烟雾具有剧毒。仅在通风橱中使用。
Amplex Red	ThermoFisher	A12222
Epon 812	电子显微镜科学	14120
乙醇	默克	100983
Fugene HD	Promega	E2311	质粒转染
甘氨酸	SIGMA	G8898
柠檬酸铅 3%	电子显微镜科学	22410
四氧化锇 4 % 水溶液	电子显微镜科学	16320	剧毒。仅在通风橱中使用。
六氰基铁酸钾 （II） 三水合物	SIGMA	P3289
二甲胂酸钠三水合	物 Sigma-Aldrich	C0250-500G
乙酸铀酰	显微镜科学	22400
UranyLess EM 染色	电子显微镜科学	22409
质粒构建
Mito-mEosEM	addgene	132706	DOI： 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2	Sharma N.  等人。	N/A	DOI： 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um 注射器过滤器	Sartorius	16534
35 mm 网格盖玻片皿	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
BEEM 包埋胶囊	Ted Pella	130
Formvar 支持单槽铜网格	Ted Pella	01705
金刚石刀	DiATOME	DU4530
超切片机	徕卡	ARTOS 3D
显微镜
置共聚焦显微镜	尼康	A1 Rsi/Ti-E
透射电子显微镜	FEI	Tecnai G2
Software 和算法
斐济/Image J	NIH / 开源		https://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp 软件包	NIH / 开源
https://imagej.net/plugins/bigwarp Photozoom Pro 8	BenVista		https://www.benvista.com/photozoompro 替代软件 图像调整器 ：https://imageresizer.com/ Gigapixel AI：https://www.topazlabs.com/gigapixel ON1 调整大小 ：https://www.on1.com/products/resize-ai/