结合成像与电生理技术在小鼠中可视化并记录扩散性去极化

摘要

本方案展示了成像与电生理学技术的结合，可可靠地检测成年小鼠在轻度创伤性脑损伤后出现的扩散性去极化。

摘要

扩布性去极化（Spreading Depolarizations, SDs）是大脑中发生的剧烈事件，由于其在灰质中传播速度缓慢，常难以被察觉。由于SD的检测具有挑战性，因此最好通过多种方法联合确认。本实验方案描述了结合成像与电生理学技术来检测SD的方法，该方法可被大多数实验室可靠且便捷地采用。SD常继发于创伤性脑损伤、脑卒中、蛛网膜下腔出血、缺血以及偏头痛先兆等病理状态。传统上，SD通过直流（DC）放大器记录，因其可分辨缓慢的细胞外电位偏移以及高频电活动的抑制。然而，直流放大器几乎无法用于长期的in vivo记录。本方案采用常规的交流（AC）放大器进行in vivo电生理记录，以确认高频电活动的抑制，同时结合非侵入性成像技术，以检测SD的传播波。这些方法可被大多数实验研究可靠地采用或适当修改，用于确认脑损伤后是否存在SD。

引言

扩布性去极化（spreading depolarizations, SDs）与多种神经系统疾病相关，包括创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中、蛛网膜下腔出血、缺血以及偏头痛先兆¹。研究表明，SDs 参与了脑卒中和 TBI 中组织损伤的进展过程²。然而，组织损伤进展的具体机制仍不明确^3,4。当神经元的代谢需求无法获得足够的氧气和葡萄糖满足时，便可能发生 SDs，此时依赖 ATP 的钠钾泵功能不足以维持正常的离子梯度。为了深入理解 SDs 在组织损伤中的作用，需要采用精确的技术对其进行测量和研究，这对于推动科学认知至关重要。SDs 是重要的神经电生理事件，但由于实验设计和/或仪器设备的局限性，这类事件常常难以被检测到。

扩散的作用 去极化（SDs）在损伤进展中的作用 目前正在被阐明，但它们的作用 轻度创伤性脑损伤（mTBIs） 尚不明确。 最近利用本手稿所述技术开展的研究表明，在闭合性颅脑轻度创伤小鼠模型中，即使没有明显的组织损伤或出血，也会引发扩散性去极化（SDs）。^5,6这些研究表明，扩布性去极化（SDs）可能与急性神经功能障碍和神经炎症有关。此外，轻度创伤性脑损伤（mTBI）诱发的扩布性去极化与急性行为缺陷密切相关。^6,7因此，很可能在所有创伤性脑损伤模型中都会引发去极化波（SDs），但在未得到证实的情况下，其作用仍难以确定。确认去极化波的存在对于准确评估轻度创伤性脑损伤（mTBIs）的结果至关重要。

扩布性去极化（SDs）的特征是细胞外电位显著下降，即所谓的"直流偏移"，并伴有高频活动的抑制⁸。该"直流偏移"通常需要数秒才能恢复（约10 s）⁹。为了记录"直流偏移"，需要使用直流放大器和银丝电极。然而，体内电生理记录通常采用交流放大器，其设计目的是滤除低频信号以减少运动伪迹。不幸的是，这种低频滤波也会消除"直流偏移"。此外，银具有毒性，不适合长期记录。常用的交流放大器能够检测到高频活动的抑制，但在缺乏伴随的"直流偏移"的情况下，确认SD的存在具有挑战性。

去极化扩散（SDs）也可通过多种成像技术进行检测。最常用的方法是激光散斑对比成像，该技术可透过完整的颅骨测量脑血流量¹⁰。SDs 对脑血管系统和血流具有显著影响。在除小鼠外的大多数物种中，SDs 会引发伴随其前缘传播的高灌注波¹¹。SDs 也可利用钙离子或谷氨酸荧光探针进行成像¹²，但该方法需将组织负载染料或基因编码的荧光指示剂^12,13。有趣的是，由于与 SD 相关的内在光学信号（iOS），SDs 可通过肉眼直接观察¹⁴。iOS 是由内源性荧光分子（如 NAD(P)H 和 FADH^15,16）、组织肿胀¹⁷以及脑血流的潜在变化等共同构成的复杂信号。尽管其机制复杂，iOS 信号仍具有良好的可靠性，可在野生型小鼠中被成功捕获¹⁸。本实验方案描述了 iOS 成像的方法，因为该技术无需使用特殊病毒或转基因动物，可在任何实验室中实施。

本方法的总体目标是通过同时进行成像和电生理记录，实验性地确认轻度创伤性脑损伤（mTBI）后是否存在传播性去极化（SD）。In vivo 电生理技术借助先进的放大器，是一种常用的研究手段。然而，这些放大器无法检测到特征性的"DC偏移"。因此，需采用本方案中所述的成像技术，以可靠地确认SD的存在或缺失。结合成像与电生理技术的优势在于：成像能够检测SD的传播过程，而电生理则可识别与之相关的高频抑制现象。

总体而言，该方法适用于研究创伤性脑损伤（TBI）后去极化扩布（SDs）的发生情况。该方法的应用有助于加深对TBI后皮层网络功能及去极化扩布（SDs）的理解。本方案可从闭合性颅脑撞击模型推广至其他模型，例如可控性皮层撞击、液体冲击损伤或自由落体撞击模型。在多个实验室中实施本方案，将有助于阐明去极化扩布在不同严重程度TBI中的作用。任何已确立的TBI模型均可使用，随后进行本方案中描述的iOS成像与电生理学检测步骤。

方案

所有操作均按照新墨西哥大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。C57BL/6J小鼠购自商业来源。实验使用了相同数量的雄性和雌性小鼠，年龄范围为8至14周。所有小鼠体重约为20 g。本研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息列于材料表中。补充文件1包含缩略语列表。

1. 为成像和电生理记录准备颅骨

1. 将动物置于异氟烷诱导箱中，使用100%氧气混合2%-3%异氟烷进行麻醉，并通过脚掌夹捏测试确认麻醉深度，确保无反应。
2. 在将动物固定于立体定位仪之前，给予术前镇痛药物（缓释布托啡诺，3.25 mg/kg，皮下注射），并维持麻醉状态（2%异氟烷）。
3. 涂抹眼用软膏，并使用具有体温反馈功能的加热垫维持动物体温。
4. 剃除颅骨上方将要切口区域的毛发，从眼裂至人字缝沿中线剃净。
5. 在使用抗菌消毒剂清洗和溶液消毒皮肤前，清除已剪除的毛发。最后用70%乙醇处理，重复三次，以确保手术部位无菌。
6. 使用#10手术刀片从头侧到尾侧沿中线做切口，紧接着在切口处涂抹医用级 氰基丙烯酸酯胶水。将皮肤向两侧拉开，暴露颅骨。
7. 在颅骨上再滴加一至两滴氰基丙烯酸酯胶水，以提供额外保护。
   注意：胶水的涂抹具有时间敏感性，因为颅骨暴露在空气中超过10秒后会开始变浑浊，这将影响通过成像方法对扩散性去极化（SD）的观察。
8. 在胶水干燥期间，使用无菌手术剪扩大小脑区域的切口。待胶水固化后，开始植入颅骨螺钉电极。
   1. 植入前使用玻璃珠灭菌器对颅骨螺钉进行20-30秒的灭菌处理 。
   2. 将颅骨螺钉放置在远离SD起始部位的区域，以保持开放的视觉窗口。
      注意：对于初级视皮层的长期记录，使用三个颅骨螺钉。第一个螺钉置于前囟后约y = -6.00 mm处的小脑区域，作为参考电极。记录电极则置于前囟后y = -2.79 mm、距中线x = ±2.5 mm处，分别位于左右半球。
   3. 使用0.8 mm钻头在颅骨上钻导向孔。为确保不损伤下方组织，建议Z轴深度为-0.5 mm。使用预先焊接到金针上的不锈钢导线#00-90螺钉。
   4. 将螺钉旋入颅骨，1.5-2整圈即可使螺钉穿透颅骨并与皮层表面接触。
   5. 将多余导线缠绕在螺钉上，预留一定松弛度以便后续安装头端连接器。
   6. 采用相同操作步骤安装其余颅骨螺钉。
   7. 所有颅骨螺钉就位后，将金针插入所需头端连接器中。使用立体定位臂固定连接器，并使连接器引脚紧靠螺钉头部上方，同时确保导线之间不相互接触。
   8. 用氰基丙烯酸酯胶水密封整个区域，注意不要遮盖螺钉前方的成像区域。
   9. 在金针基部周围构建牙科水泥，确保颅骨螺钉的金针与头端连接器中的金针彼此绝缘。
   10. 待牙科水泥完全固化后，再移除头端连接器。
   11. 将动物从立体定位仪中取出，放回饲养笼中恢复。遵循标准术后护理程序，并在麻醉恢复期间将其置于加热垫上。
       注意：术后动物应单笼饲养，并每日监测疼痛情况。遵循当地机构关于镇痛的指导原则。若使用缓释布托啡诺，需监测疼痛状况，并在必要时于72小时追加一次剂量。
9. 移除可能勾住电极的任何物品，包括笼内设施和丰富化物品。使用标准垫料，并保证食物和水ad libium供应。
   注意：手术后应给予两天恢复期，之后再开始记录。

2. 利用内源性光学信号（iOS）成像和交流电生理学检测扩散性去极化

1. 使用100%氧气中的2%异氟烷对动物进行麻醉。
   注意：该步骤的成像部分应耗时约5分钟，且异氟烷暴露量应保持一致。
2. 将动物放入立体定位仪中，通过鼻罩持续给予1%-2%异氟烷与氧气混合气体。
   注意：必须维持适当的麻醉深度，因为异氟烷已知会减少扩散性去极化（SDs）。建议在整个实验过程中将呼吸频率维持在60–70次/分钟。
3. 将动物置于相机下方，通过调节调焦环使相机对准皮层表面并确保成像清晰。
4. 在成像区域滴加矿物油以提高透明度。
5. 打开计算机、LED 面板板和电生理设备。
   注意：在关闭室内顶灯的情况下，将LED面板置于动物前方以照射成像窗口时效果最佳。光照强度设定为约2,400 lux（功率95%），色温设置为4000K的冷光模式。
6. 使用 iOS 的加载设置 Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. 按压 实时 在摄像头下观察小鼠，并将动物的颅骨置于摄像头正下方中心位置。关闭 "活体" 窗口
   2. 按压 多维采集.
   3. 在 多维采集 窗口中，选择所需的时间点。
      注意：建议以250 ms的间隔采集750张图像。
   4. 将图像保存至指定的文件路径并设置名称前缀。
7. 将动物身上的金针连接到头端连接器，然后连接至头端装置。
8. Intan 软件的加载设置
   1. 点击 选择文件格式 图标，然后在弹出窗口中选择 单信号类型单文件格式。这会将文件保存为 ".dat" 供在 MATLAB 中进一步使用。
   2. 在 BW 标签下方 硬件带宽选择放大器带宽为0.13–500 Hz。
   3. 滤膜下方 显示选择器，选择 WIDE 以覆盖 最广泛的信号范围
   4. 要选择保存的目标文件路径，请点击 选择文件名 图标。
9. 使用电磁冲击器进行冲击。
   注意：撞击器设置为 4 m/s 撞击速度和 5 毫米偏转。
   1. 打开撞击器，并通过拨动三通开关使针头回缩和伸出，以确保针头能够正常伸缩。在将动物放置于针头下方之前，应确保针头处于伸出状态。
   2. 迅速地将动物放在泡沫垫上，并将垫子滑至尖端下方。
   3. 将撞击器尖端对准中线，并置于前囟前方1 mm处。
   4. 将撞击器的探头下移，直至其牢固地接触动物头部的顶部。
      注意：切勿将尖端向下压入头部。
   5. 推动杠杆以缩回撞击头，然后手动将其降低5 mm，再启动撞击杠杆。
   6. 立即将动物从泡沫床上取下，并在冲击发生后的5秒内将其置于相机下进行成像，因为睡眠剥夺（SD）从冲击开始时即已启动。
10. 点击开始 iOS 成像 获取！ 在 多维采集 窗口成像4分钟以捕获整个SD。
11. 通过点击开始电生理记录 记录 Intan 软件上的图标。
12. 将动物从泡沫垫上移开，置于开放区域或饲养笼中使其恢复。
    注意：建议至少记录1小时的电生理信号，以使皮层网络功能得以恢复。
13. 记录完成后，将动物从前置放大器和连接器上断开，并将其放回笼中。
    注意：建议每次撞击与记录之间间隔24小时。在非记录时段，动物可一直饲养于其原笼中。

3. iOS 图像可视化与定量分析

1. 在 ImageJ^19,20,21,22 中，通过点击 文件 > 导入 > 图像序列 打开图像堆栈。
2. 手动滚动浏览图像，确保无运动或其他伪影。
3. 为生成标准差（SD）曲线图，使用光标绘制一个正方形以创建感兴趣区域（ROI）。
   注意：建议使用 30 × 30 像素的正方形。可使用任意形状或大小，但需确保不同动物之间的 ROI 大小保持一致。
4. 通过点击 图像 > 堆栈 > 绘制 Z 轴剖面图 生成曲线图。在新生成的图表上，点击 实时 按钮。返回 SD 图像堆栈并移动 ROI，直到图表显示 SD 曲线。该曲线应呈正弦波形，初始上升后下降至基线以下，并在数分钟内缓慢恢复至基线水平。
   注意：曲线图可表示为任意单位（AU），或使用前几幅图像的平均值作为基线，转换为相对于基线的百分比。
5. 在生成的曲线图上，点击“列表”（List）以生成一组数值，可用于其他绘图软件或 Matlab 进行作图。
6. 为便于可视化，通过 图像 > 查找表 > 火焰（Fire） 将灰度图像转换为查找表颜色模式。

4. 电生理学分析

注意：建议充分利用Buzsaki实验室及其基于MATLAB生成的代码来可视化和分析电生理数据。该分析需要下载配备机构激活码的MATLAB软件，以及Buzsaki实验室的 "Buzcode" 压缩文件 通过 GitHub（https://github.com/buzsakilab/buzcode）

1. 在 Intan 电生理学软件中，确保导出的原始数据以 ".dat" 格式保存。
   注意：Matlab 可从 MathWorks 官网安装。购买和使用 Matlab 需要机构或个人激活码。执行本分析需具备一定的 Matlab 代码运行经验。
2. 使用 Buzsaki 代码中的 bz_LoadBinary 函数将数据加载到 Matlab 中。
   注意：示例 "'data' = bz_LoadBinary ('完整数据文件路径', 'frequency', 采样频率, nChannels, 通道数);
3. 使用中心频率为 60 Hz 的陷波滤波器滤除交流噪声。
   注意：示例 notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, data);
4. 根据 COSBID 小组关于分析和可视化扩布性去极化（SDs）的建议，使用 0.5–100 Hz 范围的带通滤波器分离高频活动。
5. 使用 MatLab 中的 pspectrum 命令计算功率谱图。
6. 为进行可视化，将高频信号和功率谱图在同一时间尺度下并以单列形式绘制。
   注意：从图中可见，高频抑制范围延长且功率下降。

结果

图1 展示了实验装置的示意图。记录用的颅骨螺钉置于初级视觉皮层，另一枚颅骨螺钉电极置于小脑蚓部作为接地电极。颅骨螺钉和金针通过氰基丙烯酸酯胶水和牙科水泥固定于颅骨上。必须将牙科水泥限制在颅骨的尾侧部分，以留出冲击和成像的空间。冲击位置位于中线，大约在前囟前方1 mm处，如图1所示。

典型的内在光学信号（iOS）图像如图2A所示。灰度图像通过“火焰”查找表（Fire Lookup Table）进行转换，以增强对扩散性去极化（SDs）的可视化效果。iOS包含多种信号，如NAD(P)H、FADH以及组织反射率，这使得这些信号的解读和比较具有挑战性。通过氰基丙烯酸酯胶水窗口应能清晰观察到大血管（以箭头标示），而图2A中的虚线则标示了SD的传播波。尽管SD在实时观察中难以察觉，但在加快图像播放速度后会变得更加明显（见补充视频1）。由于血管收缩，一些小的血管分支可能看起来“消失”（图2A）。从图像序列中提取的一个小的兴趣区域（ROI）应生成与图2B相似的Z轴曲线图。从电生理记录中提取的高频信号应与图2C、D的上部图谱相似。这些记录在轻度创伤性脑损伤（mTBI）后立即开始，动物在4分钟的iOS成像期间持续维持异氟烷麻醉。当撤除异氟烷后，假手术动物的高频活动应在一分钟内迅速恢复，如图2C（红框）所示。相反，如果发生了SD，高频活动将在数分钟内持续受到抑制，之后才恢复（图2D，红框）。图2C、D的下部图谱显示了各高频信号计算得到的功率（V²）。这些功率图谱有助于识别高频活动的抑制与恢复，表现为功率的快速上升（由红框右边缘指示）。

图1：实验装置及冲击位置与颅骨螺钉位置。 通过皮肤切口暴露颅骨背侧表面。使用氰基丙烯酸酯胶将颅骨和皮肤密封以增强透明度。在前囟后方 y = -6.00、x = 0 处钻孔作为接地孔。记录电极的钻孔位置位于前囟后方 y = -2.79、x = ±2.5 处。将不锈钢螺钉旋入颅骨，并通过未包被的不锈钢导线焊接到金针上。需注意避免牙科水泥过度覆盖颅骨表面，以确保冲击和成像时有足够的空间。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：典型的iOS图像与AC记录。（A）典型的iOS图像，箭头指示血管。灰度图像在ImageJ中转换为Fire查找表，以增强可视化效果。黑色虚线表示传播性去极化（SD），在iOS中表现为强度增加的波状信号。快速浏览整个图像序列时，SD清晰可见。iOS信号反映了与SD相关的多种生理和代谢变化，包括线粒体产生的NAD(P)H和FADH以及神经元水肿。黑色方框标示了用于生成（B）中曲线的感兴趣区域（ROI）。比例尺：1 mm。（B）以基线百分比表示的iOS SD典型曲线。iOS信号在约60秒内上升并恢复至接近基线水平。尽管iOS信号的变化较小（约10%），但已足以识别SD。在假手术（C）和SD（D）动物的AC记录中，上方曲线显示高频活动，下方曲线表示功率（V²）。蓝色方框表示异氟烷麻醉期，红色方框表示从异氟烷和SD中恢复高频活动的时期。SD引起的长时间抑制与单独异氟烷作用后活动的快速恢复形成对比。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：传播波的可视化。 该视频已加速至约 8 倍速，以便于观察传播波的动态过程。灰度图像已转换为 Fire 查找表，并在 ImageJ 中保存为 .AVI 文件。请点击此处下载该文件。

补充文件1：缩写列表。 请点击此处下载该文件。

讨论

扩散性去极化在多种疾病模型中具有重要作用，包括创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中和偏头痛¹。准确检测去极化事件（SDs）对于理解其在轻度创伤性脑损伤（mTBIs）后急性行为缺陷和/或神经免疫系统激活中的作用至关重要^23,24。为降低使用单一方法时漏检SDs的风险，必须采用多方法联合策略，以有效可视化并记录SDs。

尽管结合多种技术能够确认扩布性去极化（spreading depolarizations, SDs），但每种技术都可能存在潜在的局限性。本方案中描述的成像技术适用于大多数实验室，相关细节可参见Zepeda及其同事的研究²⁵。颅窗制备至关重要，因为不透明的颅窗可能导致图像结果不明确²⁶。为减少此类问题，应在使用氰基丙烯酸酯胶水前尽量减少颅骨暴露于空气中的时间。此外，在成像前滴加一滴矿物油可提高颅窗的透明度。运动伪影也可能影响对SD的准确判定，因此为获得清晰的视频图像，必须尽可能减少此类伪影。为此，在整个成像过程中应持续维持动物处于异氟烷麻醉状态²⁷。使用鼻罩有助于在撞击装置与记录系统之间高效转移动物。撞击后应迅速将动物重新置于鼻罩下，以尽可能完整地捕捉SD的传播过程。在这种轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型中，通常记录约4分钟即可完整捕获整个SD过程。然而，在更严重的TBI中，组织损伤可能诱发自发性SDs²⁸。连续成像可检测到这些自发性SDs，但长时间的异氟烷麻醉可能使高频活动抑制难以观察。通过电生理学方法，可在高频活动的额外抑制中发现自发性SDs，但在缺乏成像支持的情况下，确认抑制与SD之间的关系较为困难。

随着Open-Ephys和Intan放大器的发展，体内电生理学研究现已为许多实验室所能够开展。所有电生理记录均需要植入颅骨螺钉和/或电极。本方案中，颅骨螺钉植入与记录之间设有两天的间隔期，以支持动物恢复。尽管该时间段可能不足以使大脑完全从植入操作中恢复，但由于颅骨螺钉不穿透脑组织，因此造成的损伤应最小化。此外，氰基丙烯酸酯封固的颅骨透明度会随时间推移而降低，因此应尽快进行成像以获得最佳透明度。对于电生理记录而言，关键是要尽量减少60 Hz噪声。确保实验区域与交流电源隔离，并正确连接至Intan放大器的接地。尽管运动伪迹无法完全消除，但头戴式加速度计可在后期处理中帮助识别并剔除运动期间的数据段。总体而言，这些技术可为轻度创伤性脑损伤（mTBIs）后SD恢复及皮层网络功能提供有价值的见解。

这些技术的一个局限性在于，动物在成像过程中处于麻醉状态。然而，大多数创伤性脑损伤（TBI）模型都需要使用麻醉，且长时间的麻醉不太可能对实验设计产生显著影响。异氟烷会显著降低高频活动²⁷。如果异氟烷暴露时间超过成像期，可能会干扰损伤后去极化（SD）过程中高频活动恢复的检测。因此，在实验设计中必须包含假手术组或仅使用异氟烷的对照组，以比较高频活动的恢复情况，如图2所示。另一个局限性是电生理记录无法检测到直流（DC）偏移。DC偏移的幅度和持续时间是反映组织健康状况及SD后恢复情况的重要指标²⁸。尽管如此，使用这些技术确认SD仍能为TBI研究提供有价值的见解。

所有创伤性脑损伤（TBI）研究人员都将从本文所述技术中受益，因为几乎所有TBI模型都会产生扩散性去极化（spreading depolarizations, SDs）。深入了解SDs在损伤、损伤进展、神经免疫激活及恢复过程中的作用，将极大地推动TBI领域的发展。近期研究表明，SDs可导致行为功能缺陷，并可能是神经系统功能障碍的潜在机制^5,7。本实验方案中概述的技术将有助于阐明TBI与SD之间的关联。这些技术的未来应用还可拓展至其他研究领域，包括中风、癫痫和偏头痛。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#00-90 x .118 机用螺钉	US Micro Screw	00.90-118-M-SS-P，Amazon
0.8 mm 直径钻头	PCB 钻头	WYTP21，Amazon
16-A 头戴式放大器	Intan	C3335
2.1 mm 球形微钻头	精细科学工具公司	19007-21
交流放大器	Intan	RHD 记录系统
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	Jax#000664
CCD 相机	Mightex	TCE-1304-U
延长镜头	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR（缓释丁丙诺啡）	Midwest Veterinary Supply	产品编号 267.10000.3
金质连接插针（母头）	A-M Systems	520100
金质连接插针（公头）	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
LED 面板板	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	机构或个人激活码
医用级氰基丙烯酸酯胶水	MasterBond	MB287
Micro-Manager 相机软件	Image J	NA
指甲钻/抛光器	Makartt 电动指甲钻文件	JD700
Omnetic 连接器	Omnetics	A79014-001
RHX 数据采集软件	Intan	NA
不锈钢未涂层导线（0.005"）	A-M Systems	792800
立体定位仪	Kopf Instruments	1923-B
Teets“冷固化”牙科水泥	A-M Systems	525000，526000
XLR 相机镜头	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16