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方法文章

结合成像与电生理技术在小鼠中可视化并记录扩散性去极化

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DOI：

10.3791/67032

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences and The Center for Brain Recovery and Repair, University of New Mexico School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案展示了成像与电生理学技术的结合，可可靠地检测成年小鼠在轻度创伤性脑损伤后出现的扩散性去极化。

摘要

扩布性去极化（Spreading Depolarizations, SDs）是大脑中发生的剧烈事件，由于其在灰质中传播速度缓慢，常难以被察觉。由于SD的检测具有挑战性，因此最好通过多种方法联合确认。本实验方案描述了结合成像与电生理学技术来检测SD的方法，该方法可被大多数实验室可靠且便捷地采用。SD常继发于创伤性脑损伤、脑卒中、蛛网膜下腔出血、缺血以及偏头痛先兆等病理状态。传统上，SD通过直流（DC）放大器记录，因其可分辨缓慢的细胞外电位偏移以及高频电活动的抑制。然而，直流放大器几乎无法用于长期的in vivo记录。本方案采用常规的交流（AC）放大器进行in vivo电生理记录，以确认高频电活动的抑制，同时结合非侵入性成像技术，以检测SD的传播波。这些方法可被大多数实验研究可靠地采用或适当修改，用于确认脑损伤后是否存在SD。

引言

扩布性去极化（spreading depolarizations, SDs）与多种神经系统疾病相关，包括创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中、蛛网膜下腔出血、缺血以及偏头痛先兆1。研究表明，SDs 参与了脑卒中和 TBI 中组织损伤的进展过程2。然而，组织损伤进展的具体机制仍不明确3,4。当神经元的代谢需求无法获得足够的氧气和葡萄糖满足时，便可能发生 SDs，此时依赖 ATP 的钠钾泵功能不足以维持正常的离子梯度。为了深入理解 SDs 在组织损伤中的作用，需要采用精确的技术对其进行测量和研究，这对于推动科学认知至关重要。SDs 是重要的神经电生理事件，但由于实验设计和/或仪器设备的局限性，这类事件常常难以被检测到。

扩散的作用 去极化（SDs）在损伤进展中的作用 目前正在被阐明，但它们的作用 轻度创伤性脑损伤（mTBIs） 尚不明确。 最近利用本手稿所述技术开展的研究表明，在闭合性颅脑轻度创伤小鼠模型中，即使没有明显的组织损伤或出血，也会引发扩散性去极化（SDs）。5,6这些研究表明，扩布性去极化（SDs）可能与急性神经功能障碍和神经炎症有关。此外，轻度创伤性脑损伤（mTBI）诱发的扩布性去极化与急性行为缺陷密切相关。6,7因此，很可能在所有创伤性脑损伤模型中都会引发去极化波（SDs），但在未得到证实的情况下，其作用仍难以确定。确认去极化波的存在对于准确评估轻度创伤性脑损伤（mTBIs）的结果至关重要。

扩布性去极化（SDs）的特征是细胞外电位显著下降，即所谓的"直流偏移"，并伴有高频活动的抑制8。该"直流偏移"通常需要数秒才能恢复（约10 s）9。为了记录"直流偏移"，需要使用直流放大器和银丝电极。然而，体内电生理记录通常采用交流放大器，其设计目的是滤除低频信号以减少运动伪迹。不幸的是，这种低频滤波也会消除"直流偏移"。此外，银具有毒性，不适合长期记录。常用的交流放大器能够检测到高频活动的抑制，但在缺乏伴随的"直流偏移"的情况下，确认SD的存在具有挑战性。

去极化扩散（SDs）也可通过多种成像技术进行检测。最常用的方法是激光散斑对比成像，该技术可透过完整的颅骨测量脑血流量10。SDs 对脑血管系统和血流具有显著影响。在除小鼠外的大多数物种中，SDs 会引发伴随其前缘传播的高灌注波11。SDs 也可利用钙离子或谷氨酸荧光探针进行成像12，但该方法需将组织负载染料或基因编码的荧光指示剂12,13。有趣的是，由于与 SD 相关的内在光学信号（iOS），SDs 可通过肉眼直接观察14。iOS 是由内源性荧光分子（如 NAD(P)H 和 FADH15,16）、组织肿胀17以及脑血流的潜在变化等共同构成的复杂信号。尽管其机制复杂，iOS 信号仍具有良好的可靠性，可在野生型小鼠中被成功捕获18。本实验方案描述了 iOS 成像的方法，因为该技术无需使用特殊病毒或转基因动物，可在任何实验室中实施。

本方法的总体目标是通过同时进行成像和电生理记录，实验性地确认轻度创伤性脑损伤（mTBI）后是否存在传播性去极化（SD）。In vivo 电生理技术借助先进的放大器，是一种常用的研究手段。然而，这些放大器无法检测到特征性的"DC偏移"。因此，需采用本方案中所述的成像技术，以可靠地确认SD的存在或缺失。结合成像与电生理技术的优势在于：成像能够检测SD的传播过程，而电生理则可识别与之相关的高频抑制现象。

总体而言，该方法适用于研究创伤性脑损伤（TBI）后去极化扩布（SDs）的发生情况。该方法的应用有助于加深对TBI后皮层网络功能及去极化扩布（SDs）的理解。本方案可从闭合性颅脑撞击模型推广至其他模型，例如可控性皮层撞击、液体冲击损伤或自由落体撞击模型。在多个实验室中实施本方案，将有助于阐明去极化扩布在不同严重程度TBI中的作用。任何已确立的TBI模型均可使用，随后进行本方案中描述的iOS成像与电生理学检测步骤。

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方案

所有操作均按照新墨西哥大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。C57BL/6J小鼠购自商业来源。实验使用了相同数量的雄性和雌性小鼠，年龄范围为8至14周。所有小鼠体重约为20 g。本研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息列于材料表中。补充文件1包含缩略语列表。

1. 为成像和电生理记录准备颅骨

  1. 将动物置于异氟烷诱导箱中，使用100%氧气混合2%-3%异氟烷进行麻醉，并通过脚掌夹捏测试确认麻醉深度，确保无反应。
  2. 在将动物固定于立体定位仪之前，给予术前镇痛药物（缓释布托啡诺，3.25 mg/kg，皮下注射），并维持麻醉状态（2%异氟烷）。
  3. 涂抹眼用软膏，并使用具有体温反馈功能的加热垫维持动物体温。
  4. 剃除颅骨上方将要切口区域的毛发，从眼裂至人字缝沿中线剃净。
  5. 在使用抗菌消毒剂清洗和溶液消毒皮肤前，清除已剪除的毛发。最后用70%乙醇处理，重复三次，以确保手术部位无菌。
  6. 使用#10手术刀片从头侧到尾侧沿中线做切口，紧接着在切口处涂抹医用级 氰基丙烯酸酯胶水。将皮肤向两侧拉开，暴露颅骨。
  7. 在颅骨上再滴加一至两滴氰基丙烯酸酯胶水，以提供额外保护。
    注意：胶水的涂抹具有时间敏感性，因为颅骨暴露在空气中超过10秒后会开始变浑浊，这将影响通过成像方法对扩散性去极化（SD）的观察。
  8. 在胶水干燥期间，使用无菌手术剪扩大小脑区域的切口。待胶水固化后，开始植入颅骨螺钉电极。
    1. 植入前使用玻璃珠灭菌器对颅骨螺钉进行20-30秒的灭菌处理 。
    2. 将颅骨螺钉放置在远离SD起始部位的区域，以保持开放的视觉窗口。
      注意：对于初级视皮层的长期记录，使用三个颅骨螺钉。第一个螺钉置于前囟后约y = -6.00 mm处的小脑区域，作为参考电极。记录电极则置于前囟后y = -2.79 mm、距中线x = ±2.5 mm处，分别位于左右半球。
    3. 使用0.8 mm钻头在颅骨上钻导向孔。为确保不损伤下方组织，建议Z轴深度为-0.5 mm。使用预先焊接到金针上的不锈钢导线#00-90螺钉。
    4. 将螺钉旋入颅骨，1.5-2整圈即可使螺钉穿透颅骨并与皮层表面接触。
    5. 将多余导线缠绕在螺钉上，预留一定松弛度以便后续安装头端连接器。
    6. 采用相同操作步骤安装其余颅骨螺钉。
    7. 所有颅骨螺钉就位后，将金针插入所需头端连接器中。使用立体定位臂固定连接器，并使连接器引脚紧靠螺钉头部上方，同时确保导线之间不相互接触。
    8. 用氰基丙烯酸酯胶水密封整个区域，注意不要遮盖螺钉前方的成像区域。
    9. 在金针基部周围构建牙科水泥，确保颅骨螺钉的金针与头端连接器中的金针彼此绝缘。
    10. 待牙科水泥完全固化后，再移除头端连接器。
    11. 将动物从立体定位仪中取出，放回饲养笼中恢复。遵循标准术后护理程序，并在麻醉恢复期间将其置于加热垫上。
      注意：术后动物应单笼饲养，并每日监测疼痛情况。遵循当地机构关于镇痛的指导原则。若使用缓释布托啡诺，需监测疼痛状况，并在必要时于72小时追加一次剂量。
  9. 移除可能勾住电极的任何物品，包括笼内设施和丰富化物品。使用标准垫料，并保证食物和水ad libium供应。
    注意：手术后应给予两天恢复期，之后再开始记录。

2. 利用内源性光学信号（iOS）成像和交流电生理学检测扩散性去极化

  1. 使用100%氧气中的2%异氟烷对动物进行麻醉。
    注意：该步骤的成像部分应耗时约5分钟，且异氟烷暴露量应保持一致。
  2. 将动物放入立体定位仪中，通过鼻罩持续给予1%-2%异氟烷与氧气混合气体。
    注意：必须维持适当的麻醉深度，因为异氟烷已知会减少扩散性去极化（SDs）。建议在整个实验过程中将呼吸频率维持在60–70次/分钟。
  3. 将动物置于相机下方，通过调节调焦环使相机对准皮层表面并确保成像清晰。
  4. 在成像区域滴加矿物油以提高透明度。
  5. 打开计算机、LED 面板板和电生理设备。
    注意：在关闭室内顶灯的情况下，将LED面板置于动物前方以照射成像窗口时效果最佳。光照强度设定为约2,400 lux（功率95%），色温设置为4000K的冷光模式。
  6. 使用 iOS 的加载设置 Micro-Manager19,20,21,22.
    1. 按压 实时 在摄像头下观察小鼠，并将动物的颅骨置于摄像头正下方中心位置。关闭 "活体" 窗口
    2. 按压 多维采集.
    3. 在 多维采集 窗口中，选择所需的时间点。
      注意：建议以250 ms的间隔采集750张图像。
    4. 将图像保存至指定的文件路径并设置名称前缀。
  7. 将动物身上的金针连接到头端连接器，然后连接至头端装置。
  8. Intan 软件的加载设置
    1. 点击 选择文件格式 图标，然后在弹出窗口中选择 单信号类型单文件格式。这会将文件保存为 ".dat" 供在 MATLAB 中进一步使用。
    2. 在 BW 标签下方 硬件带宽选择放大器带宽为0.13–500 Hz。
    3. 滤膜下方 显示选择器，选择 WIDE 以覆盖 最广泛的信号范围
    4. 要选择保存的目标文件路径，请点击 选择文件名 图标。
  9. 使用电磁冲击器进行冲击。
    注意：撞击器设置为 4 m/s 撞击速度和 5 毫米偏转。
    1. 打开撞击器，并通过拨动三通开关使针头回缩和伸出，以确保针头能够正常伸缩。在将动物放置于针头下方之前，应确保针头处于伸出状态。
    2. 迅速地将动物放在泡沫垫上，并将垫子滑至尖端下方。
    3. 将撞击器尖端对准中线，并置于前囟前方1 mm处。
    4. 将撞击器的探头下移，直至其牢固地接触动物头部的顶部。
      注意：切勿将尖端向下压入头部。
    5. 推动杠杆以缩回撞击头，然后手动将其降低5 mm，再启动撞击杠杆。
    6. 立即将动物从泡沫床上取下，并在冲击发生后的5秒内将其置于相机下进行成像，因为睡眠剥夺（SD）从冲击开始时即已启动。
  10. 点击开始 iOS 成像 获取！ 在 多维采集 窗口成像4分钟以捕获整个SD。
  11. 通过点击开始电生理记录 记录 Intan 软件上的图标。
  12. 将动物从泡沫垫上移开，置于开放区域或饲养笼中使其恢复。
    注意：建议至少记录1小时的电生理信号，以使皮层网络功能得以恢复。
  13. 记录完成后，将动物从前置放大器和连接器上断开，并将其放回笼中。
    注意：建议每次撞击与记录之间间隔24小时。在非记录时段，动物可一直饲养于其原笼中。

3. iOS 图像可视化与定量分析

  1. 在 ImageJ19,20,21,22 中，通过点击 文件 > 导入 > 图像序列 打开图像堆栈。
  2. 手动滚动浏览图像，确保无运动或其他伪影。
  3. 为生成标准差（SD）曲线图，使用光标绘制一个正方形以创建感兴趣区域（ROI）。
    注意：建议使用 30 × 30 像素的正方形。可使用任意形状或大小，但需确保不同动物之间的 ROI 大小保持一致。
  4. 通过点击 图像 > 堆栈 > 绘制 Z 轴剖面图 生成曲线图。在新生成的图表上，点击 实时 按钮。返回 SD 图像堆栈并移动 ROI，直到图表显示 SD 曲线。该曲线应呈正弦波形，初始上升后下降至基线以下，并在数分钟内缓慢恢复至基线水平。
    注意：曲线图可表示为任意单位（AU），或使用前几幅图像的平均值作为基线，转换为相对于基线的百分比。
  5. 在生成的曲线图上，点击“列表”（List）以生成一组数值，可用于其他绘图软件或 Matlab 进行作图。
  6. 为便于可视化，通过 图像 > 查找表 > 火焰（Fire） 将灰度图像转换为查找表颜色模式。

4. 电生理学分析

注意：建议充分利用Buzsaki实验室及其基于MATLAB生成的代码来可视化和分析电生理数据。该分析需要下载配备机构激活码的MATLAB软件，以及Buzsaki实验室的 "Buzcode" 压缩文件 通过 GitHub（https://github.com/buzsakilab/buzcode）

  1. 在 Intan 电生理学软件中，确保导出的原始数据以 ".dat" 格式保存。
    注意：Matlab 可从 MathWorks 官网安装。购买和使用 Matlab 需要机构或个人激活码。执行本分析需具备一定的 Matlab 代码运行经验。
  2. 使用 Buzsaki 代码中的 bz_LoadBinary 函数将数据加载到 Matlab 中。
    注意：示例 "'data' = bz_LoadBinary ('完整数据文件路径', 'frequency', 采样频率, nChannels, 通道数);
  3. 使用中心频率为 60 Hz 的陷波滤波器滤除交流噪声。
    注意：示例 notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, data);
  4. 根据 COSBID 小组关于分析和可视化扩布性去极化（SDs）的建议，使用 0.5–100 Hz 范围的带通滤波器分离高频活动。
  5. 使用 MatLab 中的 pspectrum 命令计算功率谱图。
  6. 为进行可视化，将高频信号和功率谱图在同一时间尺度下并以单列形式绘制。
    注意：从图中可见，高频抑制范围延长且功率下降。

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结果

图1 展示了实验装置的示意图。记录用的颅骨螺钉置于初级视觉皮层，另一枚颅骨螺钉电极置于小脑蚓部作为接地电极。颅骨螺钉和金针通过氰基丙烯酸酯胶水和牙科水泥固定在颅骨上。关键是要将牙科水泥限制在颅骨的尾侧部分，以留出用于撞击和成像的空间。撞击位置位于中线，大约在前囟前方1 mm处，如图1所示。

典型的内在光学信号（iOS）图像如图2A所示。灰度图像通过“火焰”查找表（Fire Lookup Table）进行转换，以增强对扩散性去极化（SDs）的可视化效果。iOS包含多种信号，如NAD(P)H、FADH以及组织反射率，这使得这些信号的解读和比较具有挑战性。通过氰基丙烯酸酯胶水窗口应能清晰观察到大血管（以箭头标示），而图2A中的虚线则标记了SD的传播波。尽管SD在实时观察中难以察觉，但在加快图像播放速度后会变得更加明显（见补充视频1

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讨论

扩散性去极化在多种疾病模型中具有重要作用，包括创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中和偏头痛1。准确检测去极化事件（SDs）对于理解其在轻度创伤性脑损伤（mTBIs）后急性行为缺陷和/或神经免疫系统激活中的作用至关重要23,24。为降低使用单一方法时漏检SDs的风险，必须采用多方法联合策略，以有效可视化并记录SDs。

尽管结合多种技术能够确认扩布性去极化（spreading depolarizations, SDs），但每种技术都可能存在潜在的局限性。本方案中描述的成像技术适用于大多数实验室，相关细节可参见Zepeda及其同事的研究25。颅窗制备至关重要，因为不透明的颅窗可能导致图像结果不明确26。为减少此类问题，应在使用氰基丙烯酸酯胶水前尽量减少颅骨暴露于空气中的时间。此外，在成像前滴加一滴矿物油可提高颅窗的透明度。运动伪影也可能...

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致谢

本工作得到了NIGMS P20GM109089和美国国防部PR200891基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#00-90 x .118 机用螺钉US Micro Screw00.90-118-M-SS-P，Amazon
0.8 mm 直径钻头PCB 钻头WYTP21，Amazon
16-A 头戴式放大器Intan C3335
2.1 mm 球形微钻头精细科学工具公司19007-21
交流放大器IntanRHD 记录系统
C57BL/6J 小鼠 Jackson Laboratory Jax#000664
CCD 相机MightexTCE-1304-U
延长镜头Zeikos ZE-ETN
Ethiqa XR（缓释丁丙诺啡）Midwest Veterinary Supply产品编号 267.10000.3
金质连接插针（母头）A-M Systems520100
金质连接插针（公头）A-M Systems520200
ImageJ2/FijiImage JNA
Impactor OneLeica39463930
LED 面板板SuponL122t
MATLABMathWorks机构或个人激活码
医用级氰基丙烯酸酯胶水MasterBondMB287
Micro-Manager 相机软件Image JNA
指甲钻/抛光器Makartt 电动指甲钻文件JD700
Omnetic 连接器OmneticsA79014-001
RHX 数据采集软件IntanNA
不锈钢未涂层导线（0.005"）A-M Systems792800
立体定位仪Kopf Instruments1923-B
Teets“冷固化”牙科水泥A-M Systems525000，526000
XLR 相机镜头NikonNIKKOR 50 mm f/1.8-16

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