利用高效液相色谱法对小鼠眼部及非眼部组织中膳食维生素A代谢物进行定量分析

摘要

本文描述了一种正相高效液相色谱法，用于检测和定量与视觉功能维持相关的关键类视黄醇物质，这些物质存在于眼组织和全身组织中，在全身维生素A供应的背景下，可生成必需的光敏视紫红质发色团11-cis-视黄醛。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类跨膜蛋白的超家族，当其与配体结合后，可通过激活相应的G蛋白来启动信号级联反应。在所有哺乳动物的视觉过程中，视紫红质是负责启动光转导级联反应的G蛋白偶联受体。在光感受器细胞中，视紫红质与其发色团11-cis-视黄醛结合，并通过光敏感的异构化反应将11-cis-视黄醛转化为全-trans-视黄醛，从而激活转导素G蛋白，引发光转导级联反应。

尽管光转导机制已较为明确，但关于眼部生成11-cis-视黄醛所需的膳食维生素A前体的供给过程，以及导致该供给过程受阻的相关疾病，目前尚未完全阐明。维生素A前体被肠道吸收后，以视黄酯的形式储存在肝脏中，并以全-trans-视黄醇与视黄醇结合蛋白4（RBP4）结合的形式释放入血液循环。这种循环中的RBP4-视黄醇复合物可被包括肝脏、肺、肾和眼在内的全身器官吸收。因此，建立一种能够定量检测眼部及全身器官中各种膳食维生素A代谢物的方法，对于研究视紫红质G蛋白偶联受体（GPCR）的正常功能至关重要。

本方法介绍了一种用于小鼠组织中维生素A分析的全面提取与分析流程。通过正相高效液相色谱分析，可在单次运行中同时检测视黄醛、视黄醇和视黄酯的所有相关异构体，从而高效利用实验样本，并提高同一样本中不同维生素A代谢物之间的内部可靠性。采用这一全面的方法，研究人员将能够更准确地评估视紫红质G蛋白偶联受体功能中的全身性维生素A供应状况。

引言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是目前已知研究最为广泛且特征最明确的蛋白质超家族之一。在其最为人熟知的功能中，GPCRs作为细胞表面受体参与信号转导，当与特定配体结合后可启动细胞内的响应反应。GPCRs的特征是具有七个跨膜（TM）螺旋结构域和总共六个环状结构域。这六个环中，三个位于细胞外侧，有助于配体结合；另外三个位于细胞内侧的环则与由Gα、Gβ和Gγ亚基组成的异源三聚体G蛋白相偶联^1,2。

G蛋白偶联受体（GPCR）可分为多个类别，包括A类视紫红质样受体、B类分泌素受体家族、C类谷氨酸受体、D类真菌交配信息素受体、E类环磷酸腺苷受体以及F类卷曲/平滑受体^3,4。顾名思义，G蛋白偶联受体中的视紫红质样A类亚族包含视紫红质，这是一种在光信号转导和视觉功能中起关键作用的G蛋白偶联受体。视紫红质具备典型G蛋白偶联受体模型中的所有重要特征和结构元件，包括前述的七个跨膜α螺旋结构域、六个胞外和胞内环区，以及与异源三聚体G蛋白的结合——在感光细胞中，该G蛋白也被称为转导素（G_t）^1,5,

方案

注意：所有动物实验均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（方案编号 # 2312-41637A），并依照ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明进行操作。所有提取步骤均需在黑暗中进行，仅使用微弱红光照明。注意仪器显示屏及附属LED灯可能发出的残留光线。

1. 分光光度法类视黄醇标准品制备及外标标准曲线绘制

注意：在使用高效液相色谱分析前，准备一个干冰容器用于类视黄醇的临时储存。

1. 称取适量但任意的视黄醇类化合物，并将其溶解于适当的溶剂中，以便通过分光光度法进行定量。
   注意：本研究中选用的溶剂为乙醇，溶解于乙醇中的视黄醇类化合物的摩尔吸光系数值详见表1。标准品和样品必须使用无水、HPLC级乙醇溶解。仅通过蒸馏纯化的乙醇会与水形成共沸混合物，体积比约为4%的水。水与己烷流动相不混溶，并会导致硅胶固定相水化，最终引起色谱柱降解。
2. 利用比尔-朗伯定律及相应视黄醇类化合物的摩尔吸光系数，测定所制备标准品的浓度（表1）。
   吸光度 = 摩尔吸光系数 (ε) × 摩尔浓度 × 光程长度
3. 进行系列稀释，以制备可在目标组织定量范围内生成标准曲线的浓度。
   注意：需了解比尔-朗伯定律的基本局限性，例如....

结果

在此，我们采用上述方法检测并定量小鼠眼部及全身组织中的类视黄醇，并生成了代表性色谱图。此外，我们将简要总结在这些组织中可检测到的典型类视黄醇。

在6月龄时，小鼠通过CO₂窒息法实施安乐死。为维持眼部视黄醇含量，小鼠在安乐死及组织取材前需在黑暗环境中适应2天。采集两只眼球、0.2 g肝脏组织以及75 μL血液，用于视黄醇提取及后续的高效液相色谱（HPLC）分析。对于眼部组织，一只眼球在提取时未添加羟胺，另一只则进行羟胺处理。对于肝脏和血液样本，则无需羟胺处理，因为视黄醛通常不在这些组织中被检测到。

在未用羟胺处理的小鼠眼部色谱图中，鉴定出两种非经典视黄醛异构体之一的13-cis-视黄醛。此外，还鉴定出两种经典视黄醛异构体：11-cis-视黄醛和全-trans-视黄醛。在两张色谱图中，均鉴定出视觉循环中间产物11-cis-视黄醇以及维生素A的主要运输形式全-trans-视黄醇（图.......

讨论

本方法采用正相高效液相色谱法（HPLC）检测和定量相关类视黄醇化合物，包括视黄酯、视黄醛和视黄醇。鉴于11-cis-视黄醛是视紫红质G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中的关键发色团，能够检测与11-cis-视黄醛生成相关的代谢物的方法，对于整体视觉功能研究至关重要。该方法的主要优势在于，可在单次运行中同时检测和定量视黄醛和视黄醇的所有相关异构体。考虑到可用的实验组织通常极为有限，该方法可高效利用组织进行类视黄醇检测。尽管已有报道使用正己烷和乙酸乙酯作为流动相对类视黄醇进行分离⁴⁹，但添加1,4-二氧六环和1-辛醇可进一步提高类视黄醇异构体的分离分辨率。其中，1,4-二氧六环对13-cis-视黄醇与11-cis-视黄醇的分离至关重要⁵⁰，而长链醇类（如1-辛醇）则可进一步改善视黄醇异构体的分离效果^45,51,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
1-辛醇，适用于HPLC，≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-二氧六环，适用于HPLC，≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-顺式-视黄醛	国家眼科研究所	N/A
11-顺式-视黄醇	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-顺式-视黄醛	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-顺式-视黄醇	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
全反式-视黄醛	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
全反式-视黄醇	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
乙酸乙酯，适用于HPLC，≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
正己烷，HPLC级	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
甲醇（HPLC）	Fisher Scienctific	A452SK-4
视黄醇棕榈酸酯	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
氯化钠（结晶/ACS认证）	Fisher Scientific	S271-500
仪器
1260 Infinity II 分析型馏分收集器	Agilent	G1364F
1260 Infinity II 二元泵	Agilent	G7112B
1260 Infinity II 二极管阵列检测器	Agilent	G7115A
1260 Infinity II 多柱温控箱	Agilent	G7116A
1260 Infinity II 进样器	Agilent	G7129A
ST40R 制冷离心机	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus 离心浓缩仪	Eppendorf	22820168
耗材
2 mL 棕色螺口小瓶	Agilent	5188-6535
带PTFE/红色橡胶隔垫的压盖盖帽，11 mm	Agilent	5183-4498
一次性玻璃锥形离心管	Millipore Sigma	CLS9950215
螺口管，15 mL	Sarstedt	62.554.502
小瓶插入件，150 µL，带聚合物底脚的玻璃材质	Agilent	5183-2088