本研究介绍了一种在非麻醉的雄性C57BL/6小鼠中，通过脑电图（EEG）控制深睡眠或非快速眼动（NREM）睡眠阶段，实现脑内Aβ向周围淋巴系统（深部颈淋巴结，dcLNs）淋巴清除的新型便携式tPBM技术，适用于不同年龄的小鼠。
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本文内容
摘要
摘要
脑膜淋巴管（MLVs）在清除大脑毒素方面发挥着重要作用。开发能够刺激MLV功能的创新技术，是治疗多种与MLV异常相关的脑部疾病（包括阿尔茨海默病和帕金森病、脑肿瘤、创伤性脑损伤以及颅内出血）的一个有前景的方向。睡眠是一种自然状态，在此状态下大脑的排水过程最为活跃。因此，在睡眠期间刺激大脑排水功能及MLVs可能产生最显著的治疗效果。然而，目前尚无此类商业化技术存在。
本研究介绍了一种新型便携式经颅光生物调节技术（tPBM），该技术在脑电图（EEG）监控睡眠状态下运行，旨在通过光刺激促进老年BALB/c小鼠脑内毒素（如可溶性淀粉样蛋白β（Aβ））的清除，并能够比较不同光学资源的治疗效果。该技术可在无需麻醉的自然条件下于小鼠的居家笼环境中使用，同时保持小鼠的运动活性。这些数据为开发无创且具有临床前景的光技术开辟了新的前景，可用于矫正与年龄相关的MLV功能及脑部引流过程的变化，并有效清除脑组织中的代谢产物和毒素。该技术既适用于睡眠脑功能的临床前研究，也适用于开发针对睡眠相关脑部疾病的临床治疗方案。
引言
脑膜淋巴管（MLVs）在清除脑组织中的毒素和代谢产物方面发挥着重要作用1,2,3。在多种脑部疾病（包括肿瘤、创伤性脑损伤、出血和神经退行性病变）中，MLVs的损伤常伴随其功能下降，从而促进这些病理过程的进展1,2,3,4,5,6。因此，开发能够刺激MLVs的方法，为有效治疗脑部疾病的新技术带来了广阔前景。近年来，已提出一种非侵入性的经颅光生物调节（tPBM）技术，可用于刺激MLVs并促进血液和Aβ等毒素从脑内清除5,7,8,9,10<....
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方案
所有操作均按照 "实验动物护理和使用指南"，欧盟关于用于科学目的动物保护的第2010/63/EU号指令，以及俄罗斯联邦科学与高等教育部的指南（Nº 742号，1984年11月13日），已获萨拉托夫国立大学生物伦理委员会批准（第7号协议，2022年9月22日）。
1. 硬件组装
- 将一块厚度为 1.5 mm 的箔片电木切割成 1.5 mm × 2 mm 的尺寸。该部件称为发光二极管（LED）印刷电路板（PCB）（图 1C）。
- 按照 图 1 所示，将 LED 焊接到 PCB 上。
- 将两根绞合铜线焊接到 LED 的引脚上，然后用套管覆盖。
- 打印出框架的 3D 模型（图 1A）；将 LED（图 1B）和磁铁（图 1D）安装在框架上；将垫圈（图 1E）安装在小鼠头部。
- 按照以下步骤组装电路（图 2）。
-
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结果
第一步研究重点是确定有效光剂量（1050 nm LED）以促进清醒成年雄性BALB/c小鼠（2-3月龄，26-29 g）脑内荧光标记的Aβ通过淋巴系统清除至深颈部淋巴结（dcLNs）。根据我们先前关于经颅光生物调节（tPBM）对不同染料及红细胞从脑内清除作用的研究7,8,9,10,11,12，光剂量随机选择为10 J/cm2、20 J/cm2,和30 J/cm2。共聚焦成像结果如图8A-E所示，明确显示了tPBM对Aβ从脑部经淋巴系统.......
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讨论
MLV 是开发创新技术的重要靶点，用于调节大脑的引流功能并清除脑内细胞碎片和代谢废物，尤其是在 MLV 功能衰退的老年个体中尤为关键1,22。在稳态条件下，深度睡眠与大脑组织自然清洁的激活密切相关13,14。因此，可以合理预期，在深度睡眠期间刺激 MLV 的效果将优于清醒状态15,16。本文介绍了一种新型的、非侵入性且便携的技术——在 EEG 监测睡眠状态下，采用 tPBM 刺激老年雄性小鼠大脑中可溶性 Aβ 的淋巴清除。
该光平台体积小（7 mm × 11 mm）、重量轻（1 g），可牢固且稳定地安装在小鼠头部，同时保持其自然的运动活动。这还消除了在经颅光生物调节治疗（tPBM）过程中使用麻醉的需要。在深度睡眠期间进行tPBM时，可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由俄罗斯科学基金会资助（项目编号：23-75-30001）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% Tween20 | Helicon, 俄罗斯 | SB-G2009-100ML | |
| 导管 | Scientific Commodities Inc., 美国 | PE-10, 0.28 mm 内径 × 0.61 mm 外径 | |
| CO2 培养箱 | Binder, 德国 | CB-S 170 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon, 日本 | A1R MP | |
| 牙科丙烯酸树脂 | Zermack, 波兰-俄罗斯 | Villacryl S, V130V4Z05 | |
| 钻机 | Foredom, 俄罗斯 | SR W-0016 | |
| Dumont 镊子 | Stoelting, 美国 | 52100-07 | |
| 伊文思蓝染料 | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | 206334 | |
| Hamilton | Hamilton Bonaduz AG, 瑞士 | 29 G 针头 | |
| 布洛芬 | Sintez OJSC, 俄罗斯 | 无 | 镇痛药物 |
| 胰岛素针头 | INSUPEN, 意大利 | 31 G, 0.25 mm x 6 mm | |
| 左旋美科抗菌软膏 | Nizhpharm | D06C | 外用，剂量为 40 mg/g，每日 1 次 |
| 微型镊子 | Stoelting, 美国 | 52102-02P | |
| 微量离心机 | Gyrozen, 韩国 | GZ-1312 | |
| 微量注射器 | Stoelting, 美国 | 53311 | |
| 钝头镊子 | Stoelting, 美国 | 52108-83P | |
| PINNACLE 系统 | Pinnacle Technology, 美国 | 8400-K3-SL | 用于记录小鼠脑电图（2 通道）和肌电图（1 通道）的系统 |
| 剃毛机 | Braun | Series 3310s | |
| 单通道和多通道移液器 | Eppendorf, 奥地利 | Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019 | |
| 氯化钠 | Kraspharma, 俄罗斯 | 无 | |
| 焊接站 | AOYUE, 中国 | 无 | |
| 立体定位仪 | Stoelting, 美国 | 51500 | |
| 直头解剖剪 | Stoelting, 美国 | 52132-10P | |
| 四环素 | JSC Tatkhimfarmpreparaty, 俄罗斯 | 无 | 眼膏 |
| 镊子 | Stoelting, 美国 | 52100-03 | |
| 超声波细胞破碎仪 | Biobase, 中国 | USD-500 | |
| 伤口牵开器 | Stoelting, 美国 | 52125 | |
| Xylanit | Nita-Farm, 俄罗斯 | 无 | 肌肉松弛剂 |
| Zoletil 100 | Virbac Sante Animale, 法国 | 无 | 全身麻醉剂 |
参考文献
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat Co....
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