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研究维生素A膜受体与视蛋白与其配体相互作用以生成视黄醛蛋白的方法学

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DOI：

10.3791/67036

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2024年10月4日

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1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

本文内容

摘要

本文介绍了两种定量研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其各自生理配体之间蛋白质-配体相互作用的方法。

摘要

膳食维生素A/全反式视黄醇（ROL）在体内的分布对于维持外周组织中视黄醇类物质的功能以及生成视觉功能所需的视黄醛蛋白至关重要。RBP4-ROL 是视黄醇与视黄醇结合蛋白4（RBP4）在血液中形成的复合物。两种膜受体——肝脏中的视黄醇结合蛋白4受体2（RBPR2）和眼部的受视黄酸刺激基因6（STRA6）——可结合循环中的RBP4，该机制对于将ROL内化进入细胞至关重要。建立研究受体-配体动力学的方法，对于理解维生素A受体在视黄醇稳态中的生理功能具有重要意义。通过表面等离子共振（SPR）检测，我们可以分析维生素A膜受体与其生理配体RBP4之间的结合亲和力及动力学参数。

这些方法可以揭示RBP4在RBPR2和STRA6中结合基序的新结构和生化信息，这对于理解维生素A缺乏症的病理状态至关重要。在眼部，内化的ROL被代谢为11-cis视黄醛，这是一种视觉发色团，可与光感受器中的视蛋白结合形成视黄醛蛋白——视紫红质。光的吸收导致11-cis视黄醛发生cis到trans的异构化，从而诱导视紫红质的构象变化，并继而激活光转导级联反应。血清和眼部ROL浓度的降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视紫红质错位定位、脱辅基蛋白视蛋白积聚、夜盲症以及光感受器外节退化，最终引发色素性视网膜炎或莱伯先天性黑蒙症。

因此，定量分析视网膜中G蛋白偶联受体视蛋白-11-cis 视黄醛复合物的分光光度法在理解上述病理状态下视网膜细胞变性机制方面至关重要。通过这些全面的方法，研究人员将能够更好地评估膳食维生素A的供给在维持全身和眼部视黄醇稳态中的作用，这对于在感光细胞中生成和维持视黄酰基蛋白浓度至关重要，而后者又是维持人类视觉功能的关键。

引言

膳食获取的维生素A/全反式维甲酸转 视黄醇（retinol/ROL）是参与视觉功能的重要成分1,2. 发色团 11-顺式 视黄醛是膳食维生素A的代谢产物，可与光感受器中的G蛋白偶联受体（GPCR）视蛋白结合，生成视黄醛蛋白——视紫红质。当光线照射到眼睛时，视紫红质的构型会发生根本性变化，这一过程通过其11-顺式顺式-视网膜组分到全-转-视黄醛。这种构型变化会触发视杆细胞内的光转导级联反应，将光转化为电信号，并通过视神经传递至大脑的视觉皮层。3,4,5,6,7,8,9,10血清和眼内ROL浓度降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视蛋白错位、脱辅基视蛋白积聚、夜盲以及光感受器外节变性，最终引发视网膜色素变性或莱伯先天性黑蒙，可能导致失明3,10.

全部-转 视黄醇是膳食维生素A的基本运输形式，也是所有功能性类视黄醇和膳食维生素A代谢物的来源。肝脏是膳食维生素A储存的主要器官。肝内的视黄醇以与视黄醇结合蛋白4（RBP4）形成的复合物形式通过血清运输。RBP4主要在肝脏中表达，与视黄醇底物和转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）形成全复合物后进入血液循环。11,12,13,14,15,16,1720世纪70年代关于RBP4细胞表面受体的报道提出了膜转运蛋白可能参与视黄醇类物质进出细胞运输的假说。在眼部视网膜色素上皮（RPE）中，RBP4结合的视黄醇（RBP4-ROL）的细胞表面受体被鉴定为视黄酸诱导基因6蛋白（STimulated by Retinoic Acid 6 Retinol, STRA6）。STRA6可结合循环中的全型RBP4复合物，并将RBP4结合的视黄醇转运穿过RPE，供光感受器细胞利用18,19.STRA6基因的突变可导致多种疾病及表型，这些疾病和表型与眼部视黄醇（ROL）浓度降低相关。发育过程中发生的STRA6突变可导致无眼症、小眼球症以及其他非眼部症状，这些症状与Matthew-Wood综合征相关的表型存在重叠20,21,22,23,24,25,26,27STRA6 在不同器官和组织中表达，例如眼内的视网膜色素上皮（RPE），但并非在所有组织中均有表达26,27尽管类视黄醇的主要储存部位是肝脏，但STRA6在肝脏中并不表达。

Alapatt 及其同事发现，视黄醇结合蛋白4受体2（RBPR2）能够以高亲和力结合RBP4，并负责肝脏对RBP4结合的视黄醇的摄取，这一功能与RPE中的STRA6相似28。已有研究报道，RBPR2在结构上与STRA6具有同源性29,30,31。据推测，RBP4可结合RBPR2上的S294、Y295和L296残基，该氨基酸结合结构域在RBPR2与STRA6之间部分保守29,30,31。根据这些研究，诸如STRA6和RBPR2等含有一个或多个胞外结合残基/结构域的维生素A膜受体，被认为可与循环中的RBP4-ROL相互作用。因此，膜受体在介导循环RBP4与其靶组织（如肝脏和眼睛）细胞表面受体结合并实现视黄醇内化的过程中发挥着重要作用。

在本研究的第一部分，我们利用表面等离子体共振（SPR）技术研究了两种维生素A膜受体（RBPR2和STRA6）与其生理配体RBP4的相互作用31表面等离子体共振技术（SPR）可实时测定蛋白质与配体复合物的结合亲和力及结合/解离动力学。该方法旨在提供关于RBPR2和STRA6中RBP4结合基序的关键动力学、结构及生物化学信息，这对于理解维生素A缺乏相关病理状态至关重要。31,32如上所述，循环中的ROL通过STRA6被视网膜色素上皮细胞（RPE）内化，以生成发色团11-顺式 视黄醛，在感光细胞中与视蛋白结合形成视黄亚胺蛋白视紫红质33我们采用分光光度法对G蛋白偶联受体-视蛋白及其配体11-顺式 小鼠视网膜裂解液中视黄醛蛋白复合物，对于理解视网膜色素变性或莱伯先天性黑蒙等眼病状态下视紫红质（rhodopsin）减少的机制至关重要34。通常，这些方案可用于研究 体外 突变体的生理学后果 RBP4, STRA6，或 RBPR2 影响全身及眼部维生素A稳态，或突变视紫红质及类视黄醇循环蛋白对视觉功能的影响35,36.

方案

1. 表面等离子共振（SPR）方法学

  1. 小鼠 RBP4 蛋白的制备与纯化
    1. 设计引物以扩增全长小鼠 RBP4（msRBP4）cDNA（NCBI 参考序列：NM_001159487.1）。将 msRBP4 cDNA 克隆至 pET28a His 标签卡那霉素抗性表达载体中，并在 BL-21 DE3 细胞中表达（材料表）。
    2. 将连接好的 msRBP4-pET28a 载体转化至 BL-21 DE3 感受态细胞中（按照制造商说明书操作），随后涂布于含卡那霉素 50 µg/mL 的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上30,37。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养，次日筛选阳性克隆。
    3. 挑取单个菌落，接种于 5 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。
    4. 以步骤 1.1.3 的初级培养物 1% 体积接种于 500 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中进行二级培养，37 °C 培养 3–4 小时；使用分光光度计检测光密度。当 OD 值处于 0.6 至 1.0 之间时，加入 0.5 mM IPTG，在 24 °C 下诱导蛋白表达过夜。
    5. 采用 0.1–1 mM 的多种 IPTG 浓度及 16–30 °C 的温度范围，优化 msRBP4 的表达水平与稳定性。
    6. 将培养物（来自步骤 1.1.5）在 16,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，沉淀置于冰上保存。
    7. 用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%（v/v）Triton X-100，10% 甘油，0.5 mM PMSF 及蛋白酶抑制剂，pH 8.0）重悬沉淀。使用输出功率为 250 瓦、频率为 20 kHz、输出强度为 40–50% 的匀浆器进行超声处理，工作模式为开启 15 秒、关闭 30 秒，重复 5 次。
    8. 在 16,000 × g 条件下离心 20 分钟，去除细胞碎片和未裂解细胞。将裂解液上清通过预先用缓冲液平衡的镍-NTA 柱。
    9. 用含 30 mM 咪唑的裂解缓冲液（来自步骤 1.1.8）洗涤层析柱。
    10. 使用含 250 mM 咪唑的缓冲液洗脱结合的 msRBP4 蛋白，收集洗脱组分。通过 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各组分，并用考马斯亮蓝 R-250 染色液（甲醇:水:乙酸 = 45:45:10）染色，再用不含染料的甲醇:水:乙酸（45:45:10）溶液脱色，以肉眼观察蛋白量。
    11. 合并未使用的组分，使用 10 kDa 截留分子量（MWCO）的 10K 透析盒对合并组分进行透析。
    12. 通过 12% SDS-PAGE 凝胶评估透析后组分的纯度，并测定蛋白浓度。
      注：表面等离子共振（SPR）分析中使用的是无配体 RBP4（Apo-RBP4）蛋白。如需制备全反式视黄醇结合的 RBP4（holo-RBP4，即 RBP4-视黄醇复合物），请参考已发表的详细方案36,37。
  2. 通过色氨酸荧光分析和圆二色性（CD）光谱法初步验证 RBPR2 与 STRA6 肽段与 RBP4 的结构特征及相互作用
    1. 色氨酸荧光分析
      1. 使用在线蛋白质组成分析工具（https://web.expasy.org/protparam/），将氨基酸序列以单字母代码形式粘贴，以评估重组 RBP4 蛋白及 RBPR2 和 STRA6 各自肽段的结构组成，并确定各肽段和蛋白中色氨酸（Trp）残基的存在情况（材料表）。
      2. 点击“计算参数”按钮，评估色氨酸（Trp）残基的氨基酸组成。
        注：被分析的各个肽段或蛋白中必须含有色氨酸残基。
      3. 将 RBPR2 和 STRA6 各自肽段稀释至不同微摩尔浓度，分别与 3 µg msRBP4 在 96 孔板中室温孵育 5 分钟。以 290 nm 激发光激发混合物，扫描 300 nm 至 400 nm 波长范围内的发射光谱。
      4. 以空白组（仅缓冲液，无肽段和蛋白）和肽段对照组（无蛋白）进行数据归一化，并作图。
        注：随着肽段浓度由低至高增加，若观察到色氨酸荧光信号增强，则提示该肽段与 RBP4 蛋白之间存在正向相互作用。
    2. 圆二色性（CD）光谱分析
      1. 将各肽段及重组 RBP4 蛋白稀释于 1× PBS 缓冲液（pH 7.0）中。为进行质量检测，使用 0.1 至 10 μg/mL 范围内的不同浓度 RBPR2 和 STRA6 肽段及 RBP4 蛋白，具体方法如下所述。
      2. 将稀释后的各肽段和蛋白分别加入光程为 0.1 cm 的比色皿中，使用圆二色光谱仪在 195–250 nm 波长范围内测定 CD 吸光度/椭圆率。使用以下公式计算平均残基椭圆率（θ）：
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        其中 S 表示以 mθ 为单位的 CD 信号；mRw 表示平均残基分子量；c 表示蛋白浓度（mg/mL）；l 表示光程（cm）。
      3. 使用 BeStSel 二级结构分析工具（https://bestsel.elte.hu）基于 CD 光谱数据计算分子结构的二级结构百分比变化。
        注：二级结构可反映蛋白是否正确折叠以及构象是否保守，这对相互作用研究及其结果至关重要。请检查预测的结构域构象，确认无误后继续开展相互作用研究。

2. SPR分析以测定维生素A膜受体（RBPR2和STRA6）与其生理配体RBP4的结合亲和力及动力学参数

  1. 用于RBP4在CM5芯片表面的固定化时，我们采用表面等离子共振（SPR）传感器芯片，该芯片表面共价连接有羧甲基葡聚糖交联层，延伸至约100 nm，并固定于金膜表面。在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）存在条件下， NN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将芯片表面的羧基转化为 N-羟基琥珀酰亚胺酯可自发与氨基酸和蛋白质的氨基发生反应，从而使配体共价结合到芯片表面材料表).
    1. 固定纯化的 毫秒传感器芯片上的 RBP4 蛋白图1 和 图2）。在软件中 运行 菜单，选择 向导 并继续进行 固定化 选项。将配体（毫秒将步骤1.1中获得的RBP4蛋白用固定化缓冲液（10 mM醋酸钠缓冲液，pH 5.0）稀释至10 µg/mL（4 µL配体 + 396 µL缓冲液），并将偶联试剂分装至小瓶中。打开 固定化设置向导 软件控制窗口 选择 CM5 芯片，以及选项 固定2号流动池 和 目标水平 的 1,200 反应单元（RU) 以在动力学研究中达到30 RU的Rmax值 洗涤液：乙醇胺输入名称 RBP4 并点击 下一步.
      注：可选： 系统准备 对话框用于 运行前启动 如果此前已使用运行缓冲液PBST（含0.05% Tween 20去污剂溶液的磷酸盐缓冲盐水）进行过预处理，则此步骤非必需。
    2. 在 架子位置 对话框中，单击 推出载架. 取出试管架，将各试剂按指定体积加入试管中：每管加入 156 µL 的 毫秒RBP4、177 µL 乙醇胺、89 µL EDC、89 µL NHS 以及一个空离心管。插入装有样品管的支架，然后点击 好的，下一步.
    3. 在 准备运行程序 对话框中，单击 开始并保存.
  2. RBPR2与STRA6肽段动力学实验设置
    1. 梯度稀释小鼠 RBPR2、突变型 RBPR2 和 STRA6 肽段（先前化学合成）31 并列于 材料表在0.8–26.6 μM范围内的运行缓冲液中。
    2. 打开控制软件并选择 动力学/亲和力向导. 点击 文件 | 打开模板 并选择 动力学/亲和力输入注射序列对话框 流路 2-1 (流通池 2 作为 活性 和 流通池 1 作为 参考文献），检查 芯片类型 CM5，然后单击 下一步. 在 设置 对话框，检查该 运行启动循环，输入 溶液：缓冲液 和 循环：并单击 下一步.
    3. 在 注射参数 对话框中，输入以下数值 样本 参数： 结合时间：120 秒，流速 30 μL/min，解离时间 300 秒；用于 再生 参数：输入再生溶液名称：Glycine-HCl (pH 2.5) 接触时间：30 s，流速：30 μL/min 并点击 下一步.
    4. 在 样本 对话框中，输入 名称 的 肽, 分子量，以及 浓度 并点击 下一步. 在 架子位置 对话框中，将稀释后的多肽分配为不同浓度（1 至 100 µM）的单独样品，每份约 120 µL，并将约 230 µL 缓冲液、约 120 µL 缓冲液以及约 1,000 µL pH 2.5 的甘氨酸溶液分别分配至 Rack 上的相应位置。点击 推出载架 并插入所有小瓶。点击 下一步，以及在 准备运行程序 对话框中，单击 开始，输入文件名，然后 保存 (图2).
    5. 在软件中，单击 开始菜单 并选择 评估选择 打开文件 在软件中，从下拉选择菜单中选择 Fc2-1，以分析参照细胞经空白扣除后的活性传感图在结合与解离阶段的数据 毫秒RBP4 和突变体 毫秒RBPR2 和 毫秒STRA6 肽段
    6. 点击下拉菜单 动力学/亲和力 按钮并选择 表面结合；以打开 选择曲线 对话，检查 在表格中包含该列 并点击 下一步选择 数据对话 显示减去空白的传感图；点击 动力学与亲和力，保持默认参数，然后单击 适合 曲线拟合选项。检查 报告 平衡解离常数 K 的标签d 和 Ka 或 K开启 结合速率和Kd 或 K关闭 解离速率。将动力学数据传感器图以制表符分隔的 .txt 格式保存，并使用这些数值绘制图表（图3).
    7. 为了确定亲和动力学常数 Kd （平衡状态下与一半受体结合的配体浓度），将从评估结果生成的 .txt 格式文件中的数据列复制并粘贴到软件中用于 XY 作图的数据区域。点击 分析 和 非线性回归（曲线拟合），检查 数据列，然后单击 好的. 在 参数 对话框中，单击 结合饱和度 和 单一位点特异性结合拟合模型 其公式为：
      Y = (Bmax × X) / (Kd + X)
      其中，Bmax 为最大结合位点数（响应单位），X 为肽段浓度，Y 为结合量（响应单位）图3).

3. 分光光度法测定视网膜裂解液中G蛋白偶联受体-11-cis 视黄醛蛋白复合物（视黄基 Schiff 碱蛋白视紫红质）含量的方法

  1. 将预定的成年 WT-C57BL/6J 小鼠组运送至暗室。
  2. 在黑暗环境中适应过夜 12–16 小时，在红光下将小鼠放入安乐死舱，打开调节器上的 CO2 气体阀门至 5 L/min，持续约 5 分钟。通过按压颈部并向后拉尾部（颈椎脱位）确认动物死亡。
  3. 摘除眼球，并在冰浴缓冲液中匀浆，缓冲液含 20 mM bis-tris propane（1,3-双(三(羟甲基)甲氨基)丙烷；BTP）pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂（材料表）。
  4. 将匀浆液在 4 °C 条件下以 16000 × g 离心 15 分钟，弃去含有水溶性胞质蛋白的上清液。将沉淀的膜及膜蛋白重悬并溶于含 20 mM n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂的缓冲液中，在 4 °C 旋转平台上孵育 1 小时。
  5. 将重新溶解的膜组分在 4 °C 条件下以 16000 × g 离心 1 小时。将上清液与 30 μL Rho 1D4 抗体磁珠混合，在 4 °C 旋转平台上孵育 1 小时。
  6. 使用磁力架分离磁珠，弃去上清液，并用含 20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、500 mM NaCl 和 2 mM DDM 的缓冲液洗涤磁珠。
  7. 通过在室温下用含 0.2 mg/mL 1D4 肽（-TETSQVAPA）的缓冲液（20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM DDM）孵育 5–10 分钟，洗脱视紫红质蛋白（图 4 和 图 5）。
  8. 使用矩形、亚微体积、石英比色皿（孔径 2 mm，光程 10 mm，容积 50 μL），在分光光度计的快速扫描模式下测定 200 nm 至 800 nm 范围内的吸光度。
    注：仅使用高质量石英比色皿（图 4）。
  9. 为验证并确定样品质量，检测洗脱液并暴露于强光下 1 分钟，然后重复步骤 3.8。
  10. 扣除空白吸光度后，计算分析所得吸收光谱的比值：500 nm 处为结合 11-cis 视黄醛的视蛋白，380 nm 处为光照后结合全-trans 视黄醛的视蛋白，280 nm 处为无配体的脱辅基视蛋白（Apo-Opsin）（图 6）。无配体视黄醛的游离视蛋白在 500 nm 处提供基线吸光度。
  11. 为定量视紫红质浓度，使用比尔-朗伯定律：
    A=ε·C·l 或 C=A/ε·l
    其中 A 为吸光度，ε 为摩尔消光系数（视紫红质 ε500 = 40,600 M−1 cm−1，游离脱辅基视蛋白 ε280 = 81,200 M−1 cm−1），C 为浓度，l 为光程。
  12. 为以百分比形式定量配体结合型视蛋白，使用 A280/A500 的比值。
  13. 绘制扣除空白后的吸光度光谱，并计算游离视蛋白值32。
  14. 使用消光系数 ε500 = 40600 M−1 cm−1 计算视紫红质浓度。脱辅基视蛋白（无配体）浓度则通过比尔-朗伯定律，使用消光系数 ε280 = 81,200 M−1 cm−1 计算。

结果

描述了研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其相应生理配体之间蛋白质-配体相互作用的定量方法。重组小鼠RBP4应在 E. coli 纯化的蛋白被用作表面等离子共振（SPR）芯片上的偶联配体。化学合成的RBPR2、STRA6以及突变体S294A RBPR2的“SYL基序RBP4相互作用胞外位点”（约40个氨基酸的肽段）作为分析物，在不同浓度下用于测定结合动力学及平衡饱和常数Kd 相互作用图1 和 图2).

作为RBPR2和STRA6配体的重组RBP4蛋白，对这些肽段中的相互作用位点表现出结合亲和力，其Kd值分别约为22.38 µM和26.73 µM。氨基酸基序“SYL”在RBPR2和STRA6中均对稳定这些相互作用起关键作用；如预测所示，S294A突变肽的Kd值升高至约114.9 µM，表明需要更高数量的突变型RBPR2肽才能达到结合饱和（图3）。视黄醇通过STRA6进入眼部，并转化为多种视黄类物质，最终生成11-cis视黄醛作为发色团，与视紫红质中的赖氨酸296残基结合，从而形成功能性光子感应受体，实现视觉功能。11-cis视黄醛共价结合视蛋白形成视紫红质，表现出特定的吸收光谱特征。蛋白质在280 nm处有吸收峰，游离视黄醇的吸收峰位于约325 nm处；然而，全反式视蛋白（holo-Opsin）与11-cis视黄醛或视紫红质的吸收峰则位于500 nm波长处。

由于系统性视黄醇水平低下，或因RBPR2或STRA6基因突变导致视黄醇摄取障碍，从而影响该复合物的形成，将引起游离视蛋白（Free Opsin）或无11-cis视黄醛发色团的脱辅基视蛋白（apoprotein opsin）积累，使其特征性吸收峰转变为在500 nm处吸收值降低。通过定量测定吸光度，并利用280 nm与500 nm波长吸光度的比值，可估算出配体结合型视蛋白（liganded Opsins）或视紫红质（Rhodopsin）的含量。通过短暂光照，可进一步验证11-cis视黄醛结合型视蛋白在500 nm处的吸光度向全-trans-视黄醛结合型视蛋白（Meta II rhodopsin）在380 nm处吸光度的光异构化过程（图4、图5和图6）。在实验操作中，产生伪影和污染的可能性较高；其中两种主要的伪影来源为仪器产生的非预期光照，以及低浓度盐溶液洗涤不充分，未能有效去除视网膜色素上皮（RPE）或晶状体中的污染物分子（图7）。

用于DNA分离的光谱分析实验装置，配备分析软件和色谱系统。
图1：表面等离子体共振（SPR）工作台。 所需材料及SPR仪器的概览。(A) SPR芯片加载座。(A') CM5芯片，其表面为共价连接金膜的羧甲基化葡聚糖，可通过-NH2、-SH、-CHO、-OH或-COOH基团实现分子固定。(B) 样品加载自动进样器支架。(B') 3型橡胶盖。(B'') 7 mm塑料样品管，用于存放样品分装液。(C,D) 平衡/运行缓冲液储液瓶及废液收集罐。(E) Biacore软件控制面板。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示配体-分析物相互作用及响应曲线的表面等离子共振示意图。
图 2：表面等离子共振原理及传感器图采集步骤示意图。步骤 1： CM5芯片表面固定RBP4蛋白，目标响应单位为1,200。 步骤 2： 将不同浓度的RBPR2肽作为分析物进行检测，该生物分子相互作用会改变金芯片表面的电子电荷密度，从而导致在特定角度（即共振角）处光反射的改变或减弱。 步骤 3：洗涤步骤逆转表面等离子体共振现象，使反射光强度恢复，传感器图下降至基线水平。这些相互作用的动力学数据进一步用于确定结合与解离常数以及相互作用强度。 请点击此处查看该图的放大版本。

msRBP4 与多肽及其突变体相互作用的 SPR 传感器图和结合亲和力曲线。图中显示了不同多肽浓度下的响应单位随时间变化情况。
图 3：维生素A受体结合域单个肽段与其生理配体RBP4的表面等离子体共振结合研究。 （A）软件提示界面，显示RBP4在CM5芯片表面的固定化效果。（B,C,D）肽段-配体RBPR2-RBP4、STRA6-RBP4以及突变体S294A RBPR2-RBP4在不同浓度下的传感器图谱。（B',C',D'）结合动力学及平衡解离常数Kd的测定结果，展示结合模式的差异与相似性。请点击此处查看该图的放大版本。

测量光吸收的光谱学装置，图示在暗处与光照条件下的数据分析。
图 4：视蛋白-11-cis 视黄醛吸收光谱工作站及仪器设备概览。（A）带制冷功能的台式离心机，所有LED指示灯均用红色胶带覆盖；（B）紫外-可见分光光度计，其中一个LED指示灯用红色胶带覆盖；（B'）矩形超微量比色皿、石英比色皿及磁力支架；（C）扫描应用软件；（D）分光光度计样品室滑盖处于打开状态，用于分析的比色皿架，以及关闭状态的样品室盖；（E）在单一红光源下进行样品制备的“无光”设置，显示器关闭；（F）用于样品制备和溶解的带制冷功能的旋转混合仪；（G）进行样品吸光度测量的“无光”设置，显示器开启；（H）XY图谱中的吸光度分析。请点击此处查看该图的放大版本。

眼球提取与离心流程图；肽段洗脱；紫外-可见光吸收分析。
图5：Opsin-11-cis 视黄醛吸收分析方法的工作流程概览。步骤1： 在红光光源下取暗适应小鼠的视网膜，分离、匀浆并溶解，以获得视网膜膜组分。步骤2-4： 通过一系列离心操作，在无去污剂条件下溶解沉淀，并在DDM去污剂缓冲液中进一步处理。步骤5-6： 获得含有视网膜光感受器及其他膜蛋白的可溶性沉淀物，可用于抗体下拉与纯化。步骤7： 使用VAPA 1D4肽段洗脱的Opsin，可用于吸收分析。请点击此处查看该图的高清版本。

视紫红质吸收光谱图及明/暗条件下分析的蛋白质电泳结果。
图6：视紫红质吸收光谱。（A）使用1D4纯化的视紫红质检测暗适应小鼠视网膜提取物，显示在500 nm处的吸收峰；（B）使用1D4纯化的视紫红质检测光照后视网膜提取物，显示在380 nm处的吸收峰。（C）使用1D4视紫红质抗体进行的Western印迹，显示视紫红质纯化质量及分子大小分布。请点击此处查看该图的放大版本。

吸收光谱图，光照和盐洗影响，波长250-700nm，光谱分析
图7：视紫红质吸收光谱伪影。（A）暗适应眼组织提取物的吸收光谱中出现伪影，表现为在380 nm处出现吸收峰；仪器产生的非预期光照或暗室门遮光装置失效导致视紫红质蛋白漂白。（B）高盐缓冲液洗涤次数不足，会导致视网膜色素上皮（RPE）、晶状体或其他来源的污染物在眼组织提取物中积累，从而引起吸收光谱范围过宽及伪影。 请点击此处查看该图的放大版本。

视黄醇运输示意图；显示视网膜血管系统、RBP4-STRA6机制以及感光细胞对视黄醇的利用。
图8：维生素A膜受体（RBPR2和STRA6）与视蛋白（Opsin）分别与其配体（RBP4和11-cis 视黄醛）相互作用的示意图，这些相互作用对于在感光细胞中形成视黄基化蛋白以实现视觉功能至关重要。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：内在色氨酸荧光强度。 RBP4 与不同浓度的 RBPR2 和 STRA6 肽相互作用后，其内在色氨酸残基的相互作用及取向变化的初步证据。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：RBPR2 与 RBP4 蛋白-蛋白对接及相互作用。 界面残基在 PyMOL 中可视化，RBPR2 在膜中的取向通过服务器工具 https://opm.phar.umich.edu/ 进行可视化。 请点击此处下载该文件。

补充图 S3：蛋白质-蛋白质对接相互作用及可能接触位点的计算机分析流程。 该分析流程展示了从步骤1到步骤6运行Python脚本和PyMOL命令行的顺序，以确保获得相互作用位点的可靠性。请点击此处下载该文件。

补充图 S4：RBP4、RBPR2 和 STRA6 肽段的圆二色光谱二级结构分析，显示其二级结构组成。 饼状图展示了分子中各类二级结构所占比例。使用 BeStSel 二级结构分析工具“通过圆二色光谱进行蛋白质折叠预测”（https://bestsel.elte.hu）进行分析。请点击此处下载该文件。

讨论

方案中的关键步骤
SPR 方法学
计算机模拟 建模与对接分析：RBPR2（https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1）和STRA6的预测结构，以及已知的结构 毫秒RBP4 PDB 数据库（RSCB PDB ID: 2wqa）应用于对接研究29,31此外， 体外 应采用细胞培养方法来验证维生素A受体（RBPR2和STRA6）上假定结合位点与其配体（RBP4）之间的相互作用29,31(补充图 S1、补充图 S2 和补充图 S3）。使用CD光谱法测定肽的质量。此前，对于远紫外CD光谱，采用1 mm矩形比色皿，样品浓度为0.1 μg/μL，体积约200 μL（含3–4 μg RBP4蛋白、32 µM RBPR2和32 µM STRA6肽）31(补充图 S4）。应使用氮气流以防止在发射氙灯下产生有害的臭氧，并降低200-300 nm波长范围内的背景吸光度。采用默认参数，测定波长范围为185 nm至300 nm。基线需通过扣除空白样（Blank）进行校正。α螺旋和β折叠含量根据吸光度特性进行计算，例如α螺旋在222 nm处的负峰。

在数据库（https://www.uniprot.org）中分析 RBPR2 和 STRA6 蛋白及其拓扑结构域数据，确认先前已知的细胞外区域可能相互作用位点，并使用约 40-50 个氨基酸的序列进行多肽的化学合成。本研究需要纯化的重组小鼠 RBP4（msRBP4）蛋白，以及化学合成的包含推测 RBP4 结合残基的 RBPR2 和 STRA6 多肽，用于研究受体-配体相互作用18,19,29,31。在最终确定多肽序列之前，必须通过计算机模拟（基于计算机的蛋白-配体对接）分析确定相互作用的维生素 A 受体蛋白的细胞外多肽序列31。采用表面等离子共振（SPR）实验研究受体-配体相互作用的动力学。了解基于计算机模拟分析或体外（in-vitro）分析所预测的相互作用位点至关重要。本研究中设计的多肽参照了已知与 RBP4 相互作用的膜蛋白 RBPR2 和 STRA6 的细胞外区域。为确保结果准确并防止潜在的假象和出现异常的 SPR 传感图，必须对缓冲液、多肽浓度和溶解度进行标准化。在视紫红质吸光度研究中，视黄醛裂解物的分离需在严格避光条件下进行，并执行充分的洗涤步骤，以避免假象和不必要的吸光峰（图 7）。

为了理解SYL基序在维生素A转运蛋白结合RBP4、RBPR2、STRA6中的重要性，通过两个氨基酸之间的羧基和氨基发生缩合反应，化学合成了S294A-RBPR2突变体肽31。该合成过程遵循逐步添加氨基酸至锚定树脂的精确方案。氨基酸合成过程中需对N端氨基酸单元进行化学保护与去保护修饰，从而实现肽链的合成与多肽聚合物的形成。合成完成后，将肽从树脂上洗脱并进行纯化。RBP4蛋白与维生素A受体肽相互作用的初步验证应通过内源性色氨酸荧光检测法进行，并使用圆二色光谱仪进行检测（补充图S1）。重组RBP4蛋白与小鼠STRA6（msSTRA6）、小鼠RBPR2（msRBPR2）及对照肽的初始相互作用质量，应通过内源性色氨酸荧光检测法确认（补充图S1）。内源性色氨酸荧光检测是一种关键实验方法，用于评估蛋白质中色氨酸残基在受体与配体结合后荧光的猝灭或增强情况。所测得的荧光信号直接反映了因分子相互作用引起的局部环境变化。

方法的优化与故障排除
使用以下运行缓冲液优化表面等离子共振（SPR）：1× 磷酸盐缓冲盐水（含 Tween 20）或 1× HEPES（P20）。为避免沉淀产生，稀释后的多肽在使用前应进行离心和过滤。使用不同高盐缓冲液（300–500 mM NaCl）对视紫红质吸光度进行标准化。为确认视紫红质在暗处的吸光度峰值位于 500 nm，可将样品暴露于光下 30 秒后重复测量，通过观察吸光度峰值是否移至 380 nm 来验证样品质量及拉下实验的有效性。

方法的局限性
表面等离子共振（SPR）可提供两种蛋白质相互作用的特异性信息；然而，如果该相互作用需要第三个未知组分，则数据可能变得难以理解。分子构象的变化在相互作用过程中将无法被识别。由于RBP4蛋白是在无视黄醇（即脱辅基RBP4，apo-RBP4）条件下制备的，因此所测量的是apo-RBP4与其受体的结合。因此，与apo-RBP4相比，载有视黄醇的RBP4（即全辅基RBP4，holo-RBP4）对RBPR2和STRA6受体的亲和力可能有所不同35,36。有趣的是，先前研究表明，apo-RBP4和holo-RBP4与STRA6的亲和力均处于微摩尔范围，且两者与STRA6受体结合之间未观察到统计学差异35。视紫红质吸收光谱法能够检测眼中未结合配体的视蛋白（脱辅基视蛋白，apoprotein opsin）的存在，但无法确定其背后的致病机制。

视紫红质吸收光谱
关键检查点：11-cis 视黄醛向全-trans 视黄醛的光异构化反应极为敏感且即时发生32。视紫红质（全反式视蛋白）的定量应在严格避光条件下进行，以准确测定暗适应状态下（500 nm）的视蛋白和11-cis 视黄醛含量，或在光适应条件下测定Meta II型视紫红质（380 nm）32。因此，为测量未漂白的视紫红质，小鼠应在完全黑暗的房间中暗适应12–16小时32。为此，暗室必须完全遮光，入口门应使用遮光布覆盖，所有设备上的外部LED光源需用红色胶带遮蔽。笔记本电脑屏幕应覆盖红色塑料片，并在不使用时保持合上状态。同时需配备一个顶部红光光源。

关键步骤：在不同高浓度盐溶液中标准化洗涤步骤，以去除具有300-500 nm波长吸收的晶状体或视网膜色素上皮（RPE）蛋白或分子污染物，这些污染物可能会干扰视蛋白吸收的测定。

本方法相对于现有或替代方法的意义
目前尚无可行的方法用于研究系统性视黄醇利用、多组织贡献以及视黄醇结合蛋白受体突变对视黄醇分布机制的影响。本实验方案结合两种关键技术，旨在阐明光感受器中因Apo-Opsin导致的视黄醇耗竭，以及通过RBPR2-RBP4受体-配体相互作用介导的肝脏视黄醇储存利用，从而填补该领域尚未明确的关联环节（图3、图6 和 图8）。

该方法在特定研究领域中的重要性及潜在应用
基于表面等离子体共振（SPR）和吸收光谱的视紫红质检测方法为研究系统性和眼部维生素A稳态机制提供了一种有效策略，有助于视黄醛蛋白（视紫红质）的生成。总之，这些技术与实验方法能够阐明膳食类视黄醇通过肝脏向眼部转运过程中依赖膜受体的动力学特征，促进视紫红质的生成（图8）。此外，这些方法还有助于理解维生素A受体和视蛋白突变的机制及其对眼部功能的影响，特别是这些蛋白与其相应配体结合的能力。这些相互作用可能影响视黄醛蛋白的生成，而该过程对视觉功能至关重要。

披露

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表研究成果等方面均未发挥作用。

致谢

作者感谢贝亚塔·亚斯特任布斯卡博士（俄亥俄州凯斯西储大学药理学系）在视紫红质吸光度实验方案方面提供的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院眼科研究所资助（项目编号：EY030889 和 3R01EY030889-03S1），以及明尼苏达大学向 G.P.L. 提供的部分启动资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-D 定量试剂盒Cytiva80648356
胺偶联试剂盒CytivaBR100050
Biacore 分析软件Biacore S200版本 1.1
Biacore 传感芯片 CM5CytivaBR100530
双(三羟甲基)氨基甲烷丙烷（Bis tris propane）SigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 感受态细胞Thermo ScientificEC0114
圆二色光谱仪JascoJ-815 圆二色光谱仪
盐酸甘氨酸（Glycine HCL）Fisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism 模型拟合、数据分析
LB 培养基Fisher BioreagentsBP1426-500
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）EMD Millipore324355-1GM2–20 mM
pET28a His标签卡那霉素抗性表达载体 Addgene69864-3
质粒纯化试剂盒Qiagen27106
Rho1D4 磁珠CubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K 透析盒Thermo Scientific66810
吐温20（Tween20）Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
紫外-可见分光光度计Agilent Cary 60 UV-Vis
肽名称肽序列HPLC纯度质谱
小鼠 Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%符合
小鼠 Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%符合
小鼠 Rbpr2 突变体 S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%符合

参考文献

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