本文介绍了两种定量研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其各自生理配体之间蛋白质-配体相互作用的方法。
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本文内容
摘要
摘要
膳食维生素A/全反式视黄醇（ROL）在体内的分布对于维持外周组织中视黄醇类物质的功能以及生成视觉功能所需的视黄醛蛋白至关重要。RBP4-ROL 是视黄醇与视黄醇结合蛋白4（RBP4）在血液中形成的复合物。两种膜受体——肝脏中的视黄醇结合蛋白4受体2（RBPR2）和眼部的受视黄酸刺激基因6（STRA6）——可结合循环中的RBP4，该机制对于将ROL内化进入细胞至关重要。建立研究受体-配体动力学的方法，对于理解维生素A受体在视黄醇稳态中的生理功能具有重要意义。通过表面等离子共振（SPR）检测，我们可以分析维生素A膜受体与其生理配体RBP4之间的结合亲和力及动力学参数。
这些方法可以揭示RBP4在RBPR2和STRA6中结合基序的新结构和生化信息，这对于理解维生素A缺乏症的病理状态至关重要。在眼部，内化的ROL被代谢为11-cis视黄醛，这是一种视觉发色团，可与光感受器中的视蛋白结合形成视黄醛蛋白——视紫红质。光的吸收导致11-cis视黄醛发生cis到trans的异构化，从而诱导视紫红质的构象变化，并继而激活光转导级联反应。血清和眼部ROL浓度的降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视紫红质错位定位、脱辅基蛋白视蛋白积聚、夜盲症以及光感受器外节退化，最终引发色素性视网膜炎或莱伯先天性黑蒙症。
因此，定量分析视网膜中G蛋白偶联受体视蛋白-11-cis 视黄醛复合物的分光光度法在理解上述病理状态下视网膜细胞变性机制方面至关重要。通过这些全面的方法，研究人员将能够更好地评估膳食维生素A的供给在维持全身和眼部视黄醇稳态中的作用，这对于在感光细胞中生成和维持视黄酰基蛋白浓度至关重要，而后者又是维持人类视觉功能的关键。
引言
膳食获取的维生素A/全反式维甲酸转 视黄醇（retinol/ROL）是参与视觉功能的重要成分1,2. 发色团 11-顺式 视黄醛是膳食维生素A的代谢产物，可与光感受器中的G蛋白偶联受体（GPCR）视蛋白结合，生成视黄醛蛋白——视紫红质。当光线照射到眼睛时，视紫红质的构型会发生根本性变化，这一过程通过其11-顺式顺式-视网膜组分到全-转-视黄醛。这种构型变化会触发视杆细胞内的光转导级联反应，将光转化为电信号，并通过视神经传递至大脑的视觉皮层。3,4,5,6,7,8,9,10血清和眼内ROL浓度降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视蛋白错位、脱辅基视蛋白积聚、夜盲以及光感受器外节变性，最终引发视网膜色素变性或莱伯先天性黑....
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方案
1. 表面等离子共振（SPR）方法学
- 小鼠 RBP4 蛋白的制备与纯化
- 设计引物以扩增全长小鼠 RBP4（msRBP4）cDNA（NCBI 参考序列：NM_001159487.1）。将 msRBP4 cDNA 克隆至 pET28a His 标签卡那霉素抗性表达载体中，并在 BL-21 DE3 细胞中表达（材料表）。
- 将连接好的 msRBP4-pET28a 载体转化至 BL-21 DE3 感受态细胞中（按照制造商说明书操作），随后涂布于含卡那霉素 50 µg/mL 的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上30,37。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养，次日筛选阳性克隆。
- 挑取单个菌落，接种于 5 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。
- 以步骤 1.1.3 的初级培养物 1% 体积接种于 500 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中进行二级培养，37 °C 培养 3–4 小时；使用分光光度计检测光密度。当 OD 值处于 0.6 至 1.0 之间时，加入 0.5 mM IPTG，在 24 °C 下诱导蛋白表达过....
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结果
定量方法用于研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其相应生理配体之间的蛋白质-配体相互作用。重组小鼠RBP4应在 E. coli 纯化的蛋白用作表面等离子共振（SPR）芯片上的偶联配体。化学合成的RBPR2、STRA6以及突变体S294A RBPR2的“SYL基序RBP4相互作用胞外位点”（约40个氨基酸的肽段）作为分析物，在不同浓度下用于测定结合动力学及平衡饱和常数Kd 相互作用图1 和 图2).
作为RBPR2和STRA6配体的重组RBP4蛋白，对这些肽段中的相互作用位点表现出结合亲和力，其Kd值分别约为22.38 µM和26.73 µM。氨基酸基序“SYL”在RBPR2和STRA6中均对稳定这些相互作用起关键作用；如预测所示，S294A突变肽的Kd值升高至约114.9 µM，表明需要更高数量的突变型RBPR2.......
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讨论
方案中的关键步骤
SPR 方法学
计算机模拟 建模与对接分析：RBPR2（https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1）和STRA6的预测结构，以及已知的结构 毫秒RBP4 PDB 数据库（RSCB PDB ID: 2wqa）应用于对接研究29,31此外， 体外 应采用细胞培养方法来验证维生素A受体（RBPR2和STRA6）上假定结合位点与其配体（RBP4）之间的相互作用29,31(补充图 S1、补充图 S2 和补充图 S3）。使用CD光谱法测定肽的质量。此前，对于远紫外CD光谱，采用1 mm矩形比色皿，样品浓度为0.1 μg/μL，体积约200 μL（含3–4 μg RBP4蛋白、.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表研究成果等方面均未发挥作用。
致谢
作者感谢贝亚塔·亚斯特任布斯卡博士（俄亥俄州凯斯西储大学药理学系）在视紫红质吸光度实验方案方面提供的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院眼科研究所资助（项目编号：EY030889 和 3R01EY030889-03S1），以及明尼苏达大学向 G.P.L. 提供的部分启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-D 定量试剂盒 | Cytiva | 80648356 | |
| 胺偶联试剂盒 | Cytiva | BR100050 | |
| Biacore 分析软件 | Biacore S200 | 版本 1.1 | |
| Biacore 传感芯片 CM5 | Cytiva | BR100530 | |
| 双(三羟甲基)氨基甲烷丙烷（Bis tris propane） | Sigma | B6755-25G | 20 mM |
| BL21 DE3 感受态细胞 | Thermo Scientific | EC0114 | |
| 圆二色光谱仪 | Jasco | J-815 圆二色光谱仪 | |
| 盐酸甘氨酸（Glycine HCL） | Fisher Bioreagents | BP381-1 | |
| GraphPad Prism | 模型拟合、数据分析 | ||
| LB 培养基 | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM） | EMD Millipore | 324355-1GM | 2–20 mM |
| pET28a His标签卡那霉素抗性表达载体 | Addgene | 69864-3 | |
| 质粒纯化试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| Rho1D4 磁珠 | CubeBiotech | 33299 | |
| Slide-A_Lyzer 10K 透析盒 | Thermo Scientific | 66810 | |
| 吐温20（Tween20） | Fisher Bioreagents | BP337-500 | 0.05% |
| 紫外-可见分光光度计 | Agilent | Cary 60 UV-Vis | |
| 肽名称 | 肽序列 | HPLC纯度 | 质谱 |
| 小鼠 Rbpr2 (42) | HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 92.14% | 符合 |
| 小鼠 Stra6 (40) | SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK | 90.84% | 符合 |
| 小鼠 Rbpr2 突变体 S294A (42) | HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 0.92% | 符合 |
参考文献
- Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
- Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
- Kiser, P. D., Palczewski, K.
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重印与许可
