我们介绍一种用于测量视网膜色素上皮（RPE）细胞培养中耗氧率（OCR）的新型装置。该装置可在标准细胞培养板上使用标准培养基，在标准细胞培养箱中连续数周对RPE细胞进行OCR测量。
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方法文章
高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
线粒体代谢对视网膜色素上皮（RPE）的正常功能至关重要，RPE 是视网膜中一层单层细胞，对光感受器的存活具有重要作用。RPE 线粒体功能障碍是年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的典型特征，其中 AMD 是发达国家不可逆失明的首要原因，而 PVR 是视网膜脱离的一种致盲性并发症。RPE 退行性疾病已可通过高度分化且具有极性的 RPE 培养系统进行良好建模，以模拟体内（in vivo）RPE 的状态。然而，在此类培养系统中监测氧消耗率（OCR）——即线粒体功能的间接指标——一直存在困难，因为促进 RPE 理想极化和分化的培养条件不利于 OCR 的便捷测量。
本文介绍了一种新型系统Resipher，该系统可在标准细胞培养箱中，于最佳生长基质和生理培养基条件下，对高度分化的视网膜色素上皮（RPE）细胞进行长达数周的氧消耗率（OCR）监测。该系统通过测量细胞上方培养基中的氧浓度梯度来计算OCR。我们讨论了该系统相较于其他OCR检测方法的优势，以及如何在RPE培养中建立该系统的测量流程。同时，本文涵盖了使用该系统的关键技巧与注意事项，对数据解读的警示，以及针对异常结果的故障排除指南。
我们还提供一个在线计算器，可根据系统检测到的细胞培养基上方的氧气梯度，推算出RPE细胞培养所经历的缺氧、常氧或高氧水平。最后，我们回顾了该系统的两个应用：一是在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）模型中测量RPE细胞的代谢状态，二是研究RPE细胞在代谢上如何适应缺氧环境。我们预期，将该系统应用于高度极化和分化的RPE细胞培养，将有助于加深对RPE线粒体代谢在生理和疾病状态下的理解。
引言
视网膜色素上皮（RPE）是一层功能上终末分化的、高度极化的上皮细胞，形成视网膜中光感受器与其血液供应——即脉络膜毛细血管床——之间的屏障。与胶质细胞支持神经元的作用类似，RPE 执行多种功能以支持光感受器，包括吞噬光感受器外节段、向光感受器转运营养物质并提供代谢支持，以及分泌维持视觉功能所必需的多种生长因子，这些功能对于维持正常视觉至关重要。
视网膜色素上皮（RPE）的退化是多种常见视觉退行性疾病的基础。在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，RPE发生死亡，导致其上方的光感受器继发性退化；而AMD是全球范围内不可治愈性视力丧失最常见的原因之一。在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中，RPE则脱离其原本静止的终末分化状态，增殖并去分化为间充质样状态（即所谓的上皮-间充质转化[EMT]），同时伴随代谢改变。RPE的去分化不仅导致其对光感受器的支持功能丧失，还会诱发更显著的纤维化状态。这最终引起光感受器退化以及RPE介导的瘢痕形成，二者均导致视力丧失1,2。
视网膜色素上皮（RPE）对光感受器的支持作用在很大程度上是代谢性的，而代谢失调是包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）在内的多种视网膜疾病的关键因素。RPE在光感受器与其氧气和营养来源——脉络膜毛细血管之间起到调控屏障的作用。因此，R....
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方案
有关建立人原代或iPSC-RPE培养物的实验方案，请参见以下参考文献15,16,17,18。这些方案中人组织的获取和使用已通过密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）的审查并获准。
1. 该系统在RPE培养中的通用应用
- 将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞或原代人RPE细胞接种于与系统兼容的96孔板中。
- 假设已在24孔细胞培养板上培养成熟的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，然后加入500 µ0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液材料表在细胞培养孵育箱中孵育10–40分钟，每5–10分钟检查一次，直至细胞变圆且几乎准备脱落。
- 轻轻吹打培养基使细胞从细胞培养塑料表面脱落，随后转移至3倍体积的细胞培养基（1,500 µ升/24孔），在离心机中以250 × g离心沉淀 × g 室温下持续5分钟。
注意：RPE细胞培养基的配方详见于 表1 以及在先前已发表的参考文....
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结果
Resipher 实验的“三明治”装置设置如图2A所示。带有32个探针的传感盖板对应96孔板上的第3、4、9和10列，置于细胞培养板与设备之间。连接至集线器后，设备会启动电机使传感盖板上下移动，测量细胞单层上方不同高度（通常为1–1.5 mm）处培养基中O2的浓度。因此，通过记录单层上方多个高度处的O2浓度，可连续测定O2梯度。基于梯度测量结果并应用菲克扩散定律，设备可自动计算探针高度范围上方至下方的氧通量，即细胞单层的耗氧率（OCR）。无论孔内为空（仅空气）、仅含培养基无细胞（仅培养基）或含有覆盖于细胞单层之上的培养基（培养基+细胞），传感盖板均可检测O2。为评估传感盖板中传感器的工作状态，可首先将其放置在空的（仅空气）96孔板上进行质量检查。若每个孔的传感器均正常工作，则报告的O2浓度应彼此一致且接近200 µM，该数值接近标准细胞培养孵育条件下大气中的预期O2浓度。图2Bi显示了八个.......
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讨论
视网膜色素上皮（RPE）的线粒体代谢在常见致盲性视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR））的发病机制中起关键作用。RPE线粒体代谢的建模研究 体外 可使其代谢状态与周围组织分离，同时以受控方式对组织施加不同的模拟疾病损伤。此类 体外 RPE 线粒体代谢的建模得益于高保真度的人原代和 iPSC-RPE 培养技术的发展，这些培养体系能够达到适当的分化状态和极性，从而更接近真实 RPE 的生理特性 体内. 尽管监测此类培养物中的氧消耗率（OCR）是监控线粒体代谢的理想方法，但OCR监测所需的装置通常无法满足形成高度极化且完全分化视网膜色素上皮（RPE）所需的培养条件。本文中，我们介绍Resipher作为一种新型系统，可通过对高度分化且极化的RPE培养物进行实时、长期的OCR评估，来监测RPE线粒体代谢。
已有其他方法用于监测RPE中的耗氧率（OCR）。Seahorse XF分析仪旨在通过急性调控线粒体功能来短时间监测OCR。然而，Seahorse检测要求细胞培养在专用培养板上，而这种培养.......
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披露
Richard A. Bryan 和 Kin Lo 供职于 Lucid Scientific 公司，该公司生产 Resipher 系统。
致谢
我们感谢 Daniel Hass 博士和 Jim Hurley 博士提出测试 O 的想法2 新培养基与条件培养基中溶解度的对照实验。感谢Magali Saint-Geniez博士对本文稿提供的编辑意见。感谢Kellogg眼科中心仪器与电子服务核心实验室的Scott Szalay使用Resipher USB电缆对缺氧舱进行改装。HFT研究未使用任何联邦资金。电子服务核心实验室由美国国家眼科研究所P30 EY007003项目资助。本研究得到防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, RPB）的无限制部门资助。J.M.L.M.获得干性年龄相关性黄斑变性James Grosfeld倡议项目、E. Matilda Ziegler盲人基金会、Eversight眼库资助、美国国家眼科研究所K08EY033420项目资助，以及Dee和Dickson Brown和David与Lisa Drews发现希望基金会的支持。D.Y.S.获得新南威尔士大学（UNSW）Scientia项目资助。L.A.K.获得Iraty奖、Monte J. Wallace、Michel Plantevin、美国国家眼科研究所R01EY027739项目资助以及美国国防部陆军医学研究获取活动VR220059项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | #25-200-056 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐 | Sigma | T5516 | |
| 32通道 Resipher 盖 | Lucid Scientific | NS32-101A for Falcon | |
| 链霉菌来源的抗霉素 A | Sigma | A8674-25MG | 电子传递链复合体 III 抑制剂 |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | 解偶联剂，用于增强线粒体呼吸 |
| DMSO，细胞培养级 | Sigma-aldrich | D4540-100ML | 线粒体药物重悬用溶剂 |
| 细胞外基质包被基质： Synthemax II-SC | Corning | #3535 | 人源视网膜色素上皮细胞（hfRPE）用细胞外基质 |
| 细胞外基质包被基质：玻连蛋白 | Gibco | A14700 | 诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（iPSC-RPE）用细胞外基质 |
| FCCP | Sigma | C2920-10MG | 解偶联剂，用于增强线粒体呼吸 |
| 胎牛血清（Bio-Techne S11550H） | Bio-Techne | S11550H | |
| 氢化可的松-环糊精 | Sigma | H0396 | |
| 低氧培养箱 | Embrient Inc. | MIC-101 | |
| N1 培养基添加剂 | Sigma | N6530 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140050 | |
| O₂ 传感器 | Sensit technology 或 Forensics Detectors | P100 或 FD-90A-O2 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 重组人 TGFβ2 | Peprotech | 100-35B | 转化生长因子 β-2，用于诱导上皮-间质转化 |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875-1G | 电子传递链复合体 I 抑制剂 |
| 系统兼容性培养板 | Corning | #353072 | |
| 牛磺酸 | Sigma | T8691 | |
| αMEM（Eagle 培养基的 α 改良型） | Corning | 15-012-CV |
参考文献
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibr....
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重印与许可
