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通过检测人纯化血小板磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡释放表征促凝血血小板

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DOI：

10.3791/67042

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2024年11月29日

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

本文内容

摘要

促凝血血小板的形成与血栓风险增加相关。本文介绍一种从人血中分离洗涤血小板的精确方案，旨在定量检测磷脂酰丝氨酸的暴露和微囊泡的释放，这两者是促凝血血小板的显著特征。

摘要

活化的血小板主要通过在其外膜表面暴露促凝磷脂磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）以及释放表达PS的微囊泡来促进凝血，这些微囊泡保留了来源细胞原有的膜结构和胞质成分。磷脂酰丝氨酸的可及性有助于主要凝血因子的结合，显著增强凝血酶的催化效率，而微囊泡的释放则作为细胞间信号传递的关键介质。促凝血小板在止血过程中对血凝块的稳定起着至关重要的作用，其在血液中比例的升高与血栓形成风险的增加相关。研究还表明，血小板来源的微囊泡富含促进伤口愈合和调节炎症的生长因子。由于微囊泡体积微小且目标标记物的阳性事件数量有限，采用流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放面临重大技术挑战。尽管过去十年已取得显著进展，目前针对磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放的检测方法仍处于不断完善中。遗憾的是，尚不存在一种普遍适用的标准化方案，必须综合评估多种因素以确定每种具体应用中最合适的实验方法。本文中，我们详细描述了一种从人血中分离洗涤血小板并经胶原和/或凝血酶激活后，检测其磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放的实验方案，这些特征可用于表征促凝血小板。该方案旨在指导富血小板血浆的初步制备及洗涤血小板的分离。最后，通过流式细胞术定量检测磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放，从而实现对促凝血小板的识别。

引言

血小板促凝血结构的形成对于维持止血功能至关重要1,2,3。该过程涉及激动剂诱导的血小板膜上磷脂的表达，这对于凝血因子X酶复合物（tenase）和凝血酶原酶复合物（prothrombinase）的组装至关重要1,3,4。血小板活化后，还会持续释放血小板微囊泡5,6。微囊泡（直径为50 nm至1 µm以上）包裹了来源细胞的膜结构和胞质成分7,8。微囊泡是细胞间信号传递的重要介质9,10，同时也是促进伤口愈合和炎症调节的生长因子的储存库11,12。有研究还提出，微囊泡的促凝活性可能比活化的血小板高出50至100倍13。值得注意的是，近期证据表明储存的血小板会发生活化，从而导致微囊泡的产生——这对血小板输注治疗的临床实践具有潜在影响。由于微囊泡具有更长的保存时间以及更强的促凝活性，使其在输注应用中成为血小板的一种颇具前景的替代物14。

为了直接或间接评估健康和疾病状态下血小板促凝物质的形成，研究者已开发出多种方法学上的创新4,14,15。利用纯化血小板检测磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放，为理解不同类型人类疾病中血小板促凝反应的异常提供了新的数据1,4。这一不断发展的研究领域也为治疗干预开辟了新的途径1,4。然而，从血液中分离和分析纯化血小板耗时较长，需要专门的实验设备，因此目前尚无法应用于常规临床诊断16,17。此外，由于微囊泡体积微小且目标标志物阳性事件数量有限，对磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放的分析也具有较大挑战性18,19。

流式细胞术利用荧光标记的Annexin-V结合特性，自二十年前问世以来，一直是评估血小板和微囊泡表面磷脂酰丝氨酸（PS）表达的核心技术20。该技术在促凝血性血小板和微囊泡的研究中已获得广泛认可21,22。因此，本文提出了一种优化的实验方案，可用于通过Cazenave团队开发的技术从血液样本中分离纯化血小板23，并在血小板活化后，利用流式细胞术对磷脂酰丝氨酸的暴露及微囊泡的释放进行表征24。该方案将有助于进一步研究和深入表征特定临床人群中促凝血性血小板的特性。

方案

本方案遵循相关指南，并已获得波尔多大学医院人类研究伦理委员会的批准。血液样本来自提供知情同意的健康志愿者，并按照机构规程进行处理。若志愿者在实验前10天内服用过可能影响血小板功能的任何物质，则被排除在供体之外。已从健康志愿者处获得知情同意，以采集其血液并发表相关数据。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 血液采集与洗涤血小板的制备

  1. 弃去最初采集的 3 mL 血液后，使用含有活性抗凝剂枸橼酸钠-枸橼酸-右旋葡萄糖（ACD）的采血管收集外周静脉血。
  2. 采集后，轻轻颠倒混匀采血管，使血液与 ACD 充分混合，并在室温下静置 15 分钟后再进行离心。
  3. 离心前使用自动细胞计数仪计数血小板，以确定合适的离心速度（表 1）。以 250 × g 在室温（RT）下离心 10 分钟制备富血小板血浆（PRP），离心时不得启用刹车，以优化血小板回收率。
    注意：此步骤将在样本中形成三层：上层含有血浆、血小板及少量白细胞；中层富含白细胞；底层为红细胞。请小心将上层的 PRP 转移至新的 50 mL 锥形管中，避免混入红细胞和白细胞。
  4. 向 PRP 中每 9 mL 加入 1 mL ACD-A（见 表 2）和 6.25 µL 阿皮拉司（apyrase）。
    注意：阿皮拉司浓度为 0.02 U/mL 时，可降解血小板分泌的微量 ATP 或 ADP，从而防止血小板 ADP 受体脱敏并维持血小板形态25。也可同时加入前列环素 PGI2 抑制剂（0.5 µM），以防止血小板活化。
  5. 在室温下以 1100 × g 离心 10 分钟制备血小板沉淀。用温和方法（如巴斯德吸管）吸除含有贫小板血浆（PPP）的上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中（见 表 3 和 表 4）。轻轻吹打混匀后，再加入额外的 3–4 mL 洗涤缓冲液。
    注意：降低钙离子浓度可防止血浆中存在的凝血因子引发凝固。此阶段已完全去除贫小板血浆，可避免凝血酶生成导致的血栓形成和血小板活化。
  6. 再次在室温下以 1100 × g 离心 10 分钟。吸除上清液后，将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。取 150 µL 血小板悬液转移至 1.5 mL 离心管中，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。随后将剩余沉淀用 3–4 mL 洗涤缓冲液重悬。
  7. 最后以 1100 × g 在室温下离心 10 分钟。吸除上清液后，将血小板沉淀重悬于适量反应缓冲液中（见 表 5 和 表 6），使最终浓度达到 5 × 1011 血小板/L。
  8. 将洗涤后的血小板在实验前静置至少 30 分钟，以使残留的抑制剂作用消退，并让血小板适应缓冲液环境。

2. 检测准备

  1. 用反应缓冲液配制所有激动剂和荧光染料。将5 µL凝血酶加入45 µL缓冲液中（稀释比例1:10），将5 µL离子载体加入495 µL缓冲液中（稀释比例1:500）。
    1. 进行内部实验时，将未激活的血小板与经单一或双重激动剂处理的血小板进行对照。分别向不同等份样品中加入100 µL浓度为50 × 109 血小板/L的洗涤血小板：(i) 10 µL反应缓冲液，(ii) 3 µL未稀释胶原蛋白（终浓度为30 µg/mL），(iii) 10 µL预稀释凝血酶（0.5 IU/mL），(iv) 3 µL未稀释胶原蛋白 + 10 µL预稀释凝血酶，以及(v) 10 µL预稀释离子载体（终浓度为2 µM），后者已知可直接升高细胞内钙水平，如前所述26。
      注意：使用钙离子载体（如A23187或离子霉素）至关重要，因其可诱导广泛的磷脂膜翻转并增强磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
    2. 手动轻轻振荡各等份样品，并在37 °C下孵育5分钟。
      注意：延长激动剂孵育时间（30分钟）可能有助于在流式细胞术分析过程中更好地区分不同血小板亚群。
  2. 向每支微量管中加入5 µL未稀释的Annexin-V FITC，在室温避光条件下孵育10分钟。
    注意：也可加入针对血小板特异性受体（如GPIX（CD42b）或αIIb整合素（CD41，GPIIb））的单克隆抗体，以更准确地识别血小板。
  3. 加入500 µL反应缓冲液以终止反应，随后使用流式细胞仪进行样品分析。

3. 通过流式细胞术（FC）表征促凝血血小板和微囊泡

注意：为获得可靠的血小板功能分析结果，应使用按照既定标准配置的流式细胞仪（FC）27。仪器必须具备检测前向散射光（FSC）和至少一种荧光信号的能力。将光散射和荧光检测器设置为对数增益。将样本适当稀释后用于流式细胞术检测，以确保仅计数单个血小板，并降低数据采集速度。

  1. 将流式细胞仪的流速设置为“慢速”，阈值至少为10,000个血小板事件。使用FITC的带通滤光片监测荧光发射。
  2. 根据前向散射（FSC）对血小板群体设门。依据大小区分血小板和释放的微囊泡。利用密度图分别识别静息状态和刺激后血小板中的血小板及释放的微囊泡；对每个设门后的群体进行独立分析。
  3. 根据FL1轴区分促凝血性血小板。将阴性阈值设在静息状态（即仅含反应缓冲液）下血小板群体最右侧的位置。血小板激活后，将位于该阈值右侧的所有事件归类为暴露磷脂酰丝氨酸的血小板。
  4. 根据较小的光散射特性区分体积小于血小板的微囊泡。将阈值设在静息血小板群体中观察到的最低FSC值处。激活后，将低于该阈值且磷脂酰丝氨酸呈阳性的所有事件归类为微囊泡。
    注：必要时可根据个体间血小板大小的差异调整阈值。确保静息状态下微囊泡比例低于1%。

结果

通过Annexin-V染色法实现促凝血小板和微囊泡的定量，每个样本至少记录50,000个事件。如步骤2.2所述，基础血小板测量值取自与反应缓冲液孵育的样本，如图1A所示。血小板大小通过前向散射光中位值（FSC）进行评估。尽管FSC受多种因素影响，但它仍是细胞大小估算的常用指标，包括血小板。通过面积的密度图（图1A）用于识别和圈定静息状态血小板及释放的微囊泡。

对于未活化的血小板，通过Annexin-V染色测定，显示磷脂酰丝氨酸（PS）的比例低于2.9%。当使用胶原单独或联合凝血酶或钙离子载体激活洗涤后的血小板时，可观察到PS暴露增加。单独使用胶原可使PS阳性血小板增加26.7%。凝血酶对PS暴露的影响较小（9.1%），但与胶原联合使用时，可使暴露PS的血小板比例上升至36.2%。作为对照，使用2 µM离子载体处理后，有49.6%的血小板转变为促凝状态。

图1 显示，健康个体洗涤后血小板的基础微囊泡比例极低（0.3%）。凝血酶和胶原仅轻微增加微囊泡的形成，只有在胶原与凝血酶联合刺激时，微囊泡的生成才显著增加（图1D；11.4%）。加入2 µM 离子霉素后，对照组血小板产生的微囊泡中有44.0%暴露磷脂酰丝氨酸（PS）。

图2 提供了关于此过程的变异、重复性和再现性预期的信息。

血小板流式细胞术结果，前向散射对数图 vs. Annexin-V。图示为PS阴性和PS阳性血小板的分布情况。
图1：静息与激活对照血小板中磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡形成。 血小板未激活（静息状态）（A）、经30 µg/mL 胶原蛋白激活（B）、经0.5 U/mL 凝血酶激活（C）、胶原蛋白与凝血酶联合处理（D）以及经2 µM 离子载体处理。代表性点图显示血小板大小（前向散射，FSC log）与Annexin-V结合情况。水平线与垂直线（E）界定血小板阴性群体。请点击此处查看该图的放大版本。

磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡形成的箱线图；阳性细胞百分比与离子霉素浓度的关系。
图 2：经离子载体孵育后磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和微囊泡形成的重复性与可重复性。 在经洗涤的血小板中，使用2 µM或5 µM离子载体孵育后，检测PS暴露和微囊泡形成情况，血小板经或未经柠檬酸盐（一种钙螯合剂）处理：（A）来自4名不同的健康对照者；（B）来自一名健康对照者重复检测5次；（C）由两名不同技术人员制备的两名健康对照者样本。请点击此处查看该图的放大版本。

全血血小板计数（109 个/mL）相对离心力（g）
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

表1：富血小板血浆制备过程中相对离心力与全血中血小板计数的关系。

试剂用量
柠檬酸一水合物 (C6H8O7.H2O, 38 mM)8 g
柠檬酸三钠二水合物 (Na3C6H5O7.2 H2O, 61 mM)180 g
葡萄糖 (C6H12O6, 136 mM)24.6 g
溶液的 pH 值不应调节。将溶液保存在 4 °C。

表2：1 L 枸橼酸-葡萄糖抗凝剂（ACD）水溶液的配制。

试剂用量
柠檬酸一水合物 (C6H8O7.H2O, 36 mM)7.56 g
NaCl (103 mM)6 g
NaOH4 g
MgCl2.6H2O (1 mM)0.203 g
调节 pH 至 6.5。将溶液保存在 4 °C。

表3：洗涤缓冲液母液的制备。

试剂用量
30% 牛血清白蛋白 (BSA)583 µL
CaCl2, 0.25 M400 µL
葡萄糖40 mg
腺苷三磷酸双磷酸酶（Apyrase）31.5 µL 

表4：从储存液配制50 mL临时用洗涤缓冲液溶液。

试剂用量
NaCl (137 mM)8 g
KCl (2.7 mM)0.2 g
MgCl2.6H2O (1 mM)0.203 g
HEPES (5 mM) 1.19 g
NaHCO3 (12 mM) 1 g
NaH2PO4.2H2O; 0.3 mM0.05 g
将 pH 调至 7.4。溶液置于 4 °C 保存。

表5：反应缓冲液储备液的配制。

试剂用量
30% 牛血清白蛋白 (BSA)167 µL
CaCl2, 0.25 M400 µL 
葡萄糖50 mg

表6：从贮存液配制50 mL临时反应缓冲液溶液。

讨论

近期关于促凝血血小板的研究揭示了其在多种疾病过程中的变化1,28,29，凸显了对其开展详细分析与表征的重要性30,31,32。尽管目前用于评估血小板促凝血形成的临床检测手段仍有限，但在过去二十年中，临床关注度显著上升。例如，钙依赖性翻转酶TMEM16F（ANO6）参与促凝血性磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻暴露过程33。TMEM16F的变异与Scott综合征相关33,34,35，后者是一种罕见的出血性疾病，其特征为活化血小板中磷脂翻转功能受损以及凝血酶生成减少36。此外，促凝血血小板水平升高与血栓性卒中及冠状动脉疾病相关，促使人们关注抑制血小板促凝血活性的治疗策略37。在当前可用于评估促凝血血小板形成的多种方法中，通过Annexin-V结合检测PS暴露以及微囊泡释放是最常用的方法之一38,39。

本方案旨在通过流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和微囊泡释放，实现人源纯化血小板的分离及促凝血性血小板的表征。必须提前至少10天告知健康志愿者避免使用可能影响血小板功能的药物。采血过程中需注意避免静脉损伤或血流过慢，因为这些因素可能诱发凝血酶生成和血小板活化。不建议使用枸橼酸钠抗凝血制备洗涤血小板，因为在离心过程中残留的钙离子可能促进凝血酶生成和血小板活化17。ACD抗凝血的pH为6.5，枸橼酸盐浓度为22 mmol/L，而普通枸橼酸盐抗凝血的pH为7.5，枸橼酸盐浓度为13 mmol/L17。ACD抗凝血的酸性pH和较低的细胞外钙浓度可防止血小板聚集24。在采血过程中尽量减少凝血酶的生成至关重要。建议采用非创伤性静脉穿刺，并使用至少21 G的针头，以避免静脉淤滞或压力过高。此外，应弃去最初几毫升血液，以防止组织因子和微量凝血酶的污染17。从静脉穿刺到样本处理的时间也应尽可能缩短，因为血液长时间储存可能导致血小板活化，从而增加PS暴露和微囊泡释放40。在整个血小板制备过程中必须特别注意防止血小板自发性预活化，这种预活化可能在制备过程中即已发生41,17。此外，分离纯化血小板时必须仔细避免其他血细胞的污染17。这需要在血小板离心后彻底吸除上清液，以确保制备物的纯净。由于沉淀通常可见且牢固附着于管壁，可使用移液器吸头轻松吸除上清液。

在离心洗涤步骤中，血小板被重悬于模拟生理条件的缓冲液中。使用生理缓冲液中的洗涤血小板可将其与抗凝剂和血浆分离，从而避免凝血酶介导的假象。尽管富血小板血浆（PRP）是一种快速获得高浓度血小板的方法，但其在功能研究中的应用受到抗凝剂引起的pH变化以及血浆中外源性钙离子和蛋白质含量的限制，这些因素可能影响血小板的活化17。此外，血小板活化过程中产生的高水平磷脂酰丝氨酸（PS）足以促进血浆凝血复合物的组装，引发后续的凝血酶爆发和凝块形成，从而使PRP中的实验结果无法解读。相比之下，建议将血小板重悬于含有apyrase的缓冲液中，通过降解ATP和ADP防止嘌呤能受体脱敏，从而维持血小板功能42,43。尽管反复的离心和洗涤步骤耗时较长，但该方法制备的洗涤血小板悬液具有更高的稳定性（5–8小时），相比之下，枸橼酸盐抗凝的PRP制备物稳定性不超过1–3小时23。

本研究证明了通过流式细胞术定量微囊泡的可行性和简便性。然而，微囊泡的信号可能淹没在仪器产生的碎片和噪声中。因此，必须确保流式细胞仪经过充分清洗，并且所用缓冲液不含任何可能在流式细胞术分析中导致高背景信号的污染颗粒。 alternatively，可使用具有小颗粒检测能力的专用流式细胞仪来识别微囊泡的形成。此外，还研究了荧光素标记的膜联蛋白V（Annexin-V）与膜磷脂酰丝氨酸（PS）含量之间的结合关系，强调了缓冲液中维持足够钙离子浓度对于膜联蛋白V结合及促凝血血小板反应的关键作用44。

目前支持血小板样本在时间推移下稳定性的数据十分有限。一些实验室通过添加固定剂溶液（例如含甲醛的缓冲液）来稳定样本。向 freshly collected 血小板样本中添加固定剂的优势在于可保存样本以供后续分析。然而，甲醛固定可能导致 Annexin-V 结合出现人为性增加。Rochat 等人证明，使用低浓度、无钙甲醛溶液对血小板进行固定不会改变 Annexin-V 阳性血小板的比例45。但是，需要进行固定的科研人员应优化其特定实验方案，以确保不会产生人为性偏差结果。否则，样本应立即处理。

另一种可能导致磷脂酰丝氨酸（PS）暴露的途径涉及内在凋亡，该过程已知可调控血小板在循环中的寿命46激活促凋亡蛋白BAK和BAX可导致caspase活化，进而促进磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻，最终引发 体内 血小板清除。最近有研究建议，除Annexin-V外，还可联合使用另一种血小板表面标志物P-selectin/CD62P，以区分促凝血性血小板与凋亡血小板47促凝血性血小板应同时对磷脂酰丝氨酸（PS）和P-选择素标志物呈阳性，而凋亡血小板对膜联蛋白V（Annexin-V）呈阳性，但对P-选择素呈阴性。然而，时间也是区分促凝血性血小板与凋亡血小板的一个因素。47生成促凝血小板 体外 是一个快速过程，而内源性凋亡则较慢，需要数小时48在此情况下，无需使用额外标记物来评估促凝血血小板，从而简化了实验方法。细胞内钙离子水平持续升高2+ 在使用离子载体或胶原与凝血酶联合激活等极强激动剂的情况下，促凝血血小板的形成可在数分钟内发生；而BCL-XL抑制剂（或BH3模拟物）则通过激活促凋亡蛋白BAK和BAX，诱导线粒体外膜通透性增加、细胞色素C释放及caspase激活，从而触发凋亡性血小板的形成49.

综上所述，本文所述方案利用标准实验室设备和流式细胞术，可实现纯化血小板的分离及其促凝活性的后续表征。该方法为未来在患者血液样本中研究促凝血小板奠定了基础，在临床实践中具有潜在应用价值，例如用于罕见的斯科特综合征（Scott syndrome）的诊断50。

披露

作者声明不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(CD42b, GPIX) APC贝克曼库尔特B13980
ACD-A 血液采集管BD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VII西格玛-奥德里奇A6410
牛血清白蛋白 30%西格玛-奥德里奇A9576
CaCl2, 0.25M西格玛-奥德里奇C3881
柠檬酸一水合物默克5949-29-1
胶原蛋白 Stago86924
葡萄糖 西格玛-奥德里奇G8270
HEPES 西格玛-奥德里奇H3375
离子载体 Calbiochem/VWR100105
KCl 默克7447-40-7
MgCl2西格玛-奥德里奇M0250
NaCl VWR27810.295
NaOH 默克1.06498
碳酸氢钠默克6329NaHCO3
凝血酶 Hyphen BiomedEZ 006 A
枸橼酸三钠二水合物 西格玛-奥德里奇G8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb 整合素 (CD41, GPIIb) PC7贝克曼库尔特6607115

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