通过检测人纯化血小板磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡释放表征促凝血血小板

摘要

促凝血血小板的形成与血栓风险增加相关。本文介绍一种从人血中分离洗涤血小板的精确方案，旨在定量检测磷脂酰丝氨酸的暴露和微囊泡的释放，这两者是促凝血血小板的显著特征。

摘要

活化的血小板主要通过在其外膜表面暴露促凝磷脂磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）以及释放表达PS的微囊泡来促进凝血，这些微囊泡保留了来源细胞原有的膜结构和胞质成分。磷脂酰丝氨酸的可及性有助于主要凝血因子的结合，显著增强凝血酶的催化效率，而微囊泡的释放则作为细胞间信号传递的关键介质。促凝血小板在止血过程中对血凝块的稳定起着至关重要的作用，其在血液中比例的升高与血栓形成风险的增加相关。研究还表明，血小板来源的微囊泡富含促进伤口愈合和调节炎症的生长因子。由于微囊泡体积微小且目标标记物的阳性事件数量有限，采用流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放面临重大技术挑战。尽管过去十年已取得显著进展，目前针对磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放的检测方法仍处于不断完善中。遗憾的是，尚不存在一种普遍适用的标准化方案，必须综合评估多种因素以确定每种具体应用中最合适的实验方法。本文中，我们详细描述了一种从人血中分离洗涤血小板并经胶原和/或凝血酶激活后，检测其磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放的实验方案，这些特征可用于表征促凝血小板。该方案旨在指导富血小板血浆的初步制备及洗涤血小板的分离。最后，通过流式细胞术定量检测磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放，从而实现对促凝血小板的识别。

引言

血小板促凝血结构的形成对于维持止血功能至关重要^1,2,3。该过程涉及激动剂诱导的血小板膜上磷脂的表达，这对于凝血因子X酶复合物（tenase）和凝血酶原酶复合物（prothrombinase）的组装至关重要^1,3,4。血小板活化后，还会持续释放血小板微囊泡^5,6。微囊泡（直径为50 nm至1 µm以上）包裹了来源细胞的膜结构和胞质成分^7,8。微囊泡是细胞间信号传递的重要介质^9,10，同时也是促进伤口愈合和炎症调节的生长因子的储存库^11,12。有研究还提出，微囊泡的促凝活性可能比活化的血小板高出50至....

方案

本方案遵循相关指南，并已获得波尔多大学医院人类研究伦理委员会的批准。血液样本来自提供知情同意的健康志愿者，并按照机构规程进行处理。若志愿者在实验前10天内服用过可能影响血小板功能的任何物质，则被排除在供体之外。已从健康志愿者处获得知情同意，以采集其血液并发表相关数据。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 血液采集与洗涤血小板的制备

1. 弃去最初采集的 3 mL 血液后，使用含有活性抗凝剂枸橼酸钠-枸橼酸-右旋葡萄糖（ACD）的采血管收集外周静脉血。
2. 采集后，轻轻颠倒混匀采血管，使血液与 ACD 充分混合，并在室温下静置 15 分钟后再进行离心。
3. 离心前使用自动细胞计数仪计数血小板，以确定合适的离心速度（表 1）。以 250 × g 在室温（RT）下离心 10 分钟制备富血小板血浆（PRP），离心时不得启用刹车，以优化血小板回收率。
   注意：此步骤将在样本中形成三层：上层含有血浆、血小板及少量白细胞；中层富含白细胞；底层为红细胞。请小心将上层的 PRP 转移至新的 50 mL 锥形管中，避免混入红细胞和白细胞。
4. 向 PRP 中每 9 mL 加入 1 mL ACD-A（见 表 2）和 6.25 µL 阿皮拉司（apyrase）。<....

结果

通过Annexin-V染色法实现促凝血小板和微囊泡的定量，每个样本至少记录50,000个事件。如步骤2.2所述，基础血小板测量值取自与反应缓冲液孵育的样本，如图1A所示。血小板大小通过前向散射光中位值（FSC）进行评估。尽管FSC受多种因素影响，但它仍是细胞大小估算的常用指标，包括血小板。通过面积的密度图（图1A）用于识别和圈定静息状态血小板及释放的微囊泡。

对于未活化的血小板，通过Annexin-V染色测定，显示磷脂酰丝氨酸（PS）的比例低于2.9%。当使用胶原单独或联合凝血酶或钙离子载体激活洗涤后的血小板时，可观察到PS暴露增加。单独使用胶原可使PS阳性血小板增加26.7%。凝血酶对PS暴露的影响较小（9.1%），但与胶原联合使用时，可使暴露PS的血小板比例上升至36.2%。作为对照，使用2 µM离子载体处理后，有49.6%的血小板转变为促凝状态。

图1

讨论

近期关于促凝血血小板的研究揭示了其在多种疾病过程中的变化^1,28,29，凸显了对其开展详细分析与表征的重要性^30,31,32。尽管目前用于评估血小板促凝血形成的临床检测手段仍有限，但在过去二十年中，临床关注度显著上升。例如，钙依赖性翻转酶TMEM16F（ANO6）参与促凝血性磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻暴露过程³³。TMEM16F的变异与Scott综合征相关^33,34,35，后者是一种罕见的出血性疾病，其特征为活化血小板.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(CD42b, GPIX) APC	贝克曼库尔特	B13980
ACD-A 血液采集管	BD Vacutainer	366645
Annexin-V FITC	BD Pharmingen	560931
Apyrase Grade VII	西格玛-奥德里奇	A6410
牛血清白蛋白 30%	西格玛-奥德里奇	A9576
CaCl2, 0.25M	西格玛-奥德里奇	C3881
柠檬酸一水合物	默克	5949-29-1
胶原蛋白	Stago	86924
葡萄糖	西格玛-奥德里奇	G8270
HEPES	西格玛-奥德里奇	H3375
离子载体	Calbiochem/VWR	100105
KCl	默克	7447-40-7
MgCl2	西格玛-奥德里奇	M0250
NaCl	VWR	27810.295
NaOH	默克	1.06498
碳酸氢钠	默克	6329	NaHCO3
凝血酶	Hyphen Biomed	EZ 006 A
枸橼酸三钠二水合物	西格玛-奥德里奇	G8270	Na3C6H5O7*2H2O
αIIb 整合素 (CD41, GPIIb) PC7	贝克曼库尔特	6607115