方法文章

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67047

⸱

2024年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

本文内容

摘要

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。

摘要

脂质纳米颗粒（LNPs）作为治疗性递送载体已展现出巨大的潜力，这一点已通过两种获批并全球使用的新型冠状病毒（COVID-19）信使RNA（mRNA）疫苗得到证实。在小规模制备中，LNPs通常采用微流控技术制备；然而，这些设备的局限性限制了其在大规模生产中的应用。目前，COVID-19疫苗的大规模生产采用的是受限对射射流（CIJ）湍流混合器。CIJ技术能够在实验室规模上实现制备，并确保其可线性放大至生产规模。CIJ混合的关键原理在于：混合长度和时间尺度由混合腔内的湍流强度决定，且纳米颗粒的形成远离器壁，从而避免了表面沉积和结垢问题。本研究展示了使用两种不同结构的受限对射射流混合器技术制备LNPs的过程：双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（MIVM）。文中讨论了每种混合结构的优缺点。在这两种结构中，LNPs通过有机溶剂流（通常为含有可电离脂质、辅助脂质和稳定化PEG-脂质的乙醇溶液）与水相抗溶剂流（含RNA或DNA的缓冲水溶液）的快速混合而形成。本文提供了CIJ和MIVM混合器的操作参数，以制备具有可控粒径、zeta电位、稳定性及转染效率的可重复性LNPs。同时，也对比展示了采用低效混合方式（如移液混合）与CIJ混合所制备的LNPs之间的差异。

引言

基于mRNA的治疗手段在多种疾病的治疗和预防方面具有巨大潜力，包括传染病、遗传性疾病和癌症1。与能够被动扩散穿过细胞膜的小分子药物不同，核酸必须被包裹以实现细胞内递送2。包裹不仅为mRNA提供结构和稳定性，还能通过内吞途径促进其细胞内递送，并防止其被细胞内外的核酸酶等成分降解3。目前已开发出多种材料和纳米载体用于mRNA的包裹与递送，包括无机纳米颗粒、聚合物、脂质以及类脂材料1。其中，脂质纳米颗粒（LNPs）已成为基于mRNA治疗手段中最突出的递送平台4。

LNPs 由四种脂质成分组成：可电离脂质、胆固醇、两性离子脂质和 PEG-脂质稳定剂5适合用于mRNA递送的可电离脂质，其脂质疏水性与叔胺基团的解离常数（pKa）之间需保持精确的平衡。6可电离脂质的pKa值通常在6.0至6.7之间，例如KC-2（DLin-KC2-DMA）、MC-3（DLin-MC3-DMA）和ALC-03157这一对可电离脂质的pKa限制，既能实现核酸聚合物以疏水性脂质盐形式的包封，也可实现细胞内的递送 "内体逃逸" 过程。LNPs 通过（多种）内吞途径进入靶细胞，这些途径均涉及内体的酸化，pH 值从 7.4 降至约 58可电离脂质的pKa值确保脂质纳米颗粒（LNPs）在生理条件下表面近乎中性，但在酸性内体环境中变为阳离子。9这种pH响应性能够选择性地破坏内体膜，释放包封的核酸聚合物，同时保持细胞活力，这与转染系统（如Lipofectamine）中使用的永久性阳离子脂质不同。胆固醇是LNP结构中的疏水性间质分子，可提高脂质流动性。两性离子脂质发挥结构作用，在LNP表面形成双层结构。聚乙二醇-脂质（PEG-脂质）是一种胶体稳定剂，通过在LNP表面引入聚合物空间稳定层，增强LNP的稳定性，防止LNP聚集。这在pH变化期间尤为重要，因为pH变化会再生可电离脂质的游离碱形式，使其行为类似于疏水性油相，而PEG-脂质的存在有助于维持LNP的稳定。Onpattro（patisiran）配方（以下简称LNP配方）常作为LNP配方设计的起点，其中包含可电离脂质MC3、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和PEG2000-DMG，溶于乙醇后与RNA的水溶液混合制备10.

有多种技术可用于制备包封核酸聚合物的脂质纳米颗粒（LNPs），其中大多数技术依赖于将含有脂质的乙醇溶液与含有目标核酸（siRNA、mRNA 或 DNA）的水相溶液快速混合这一共同原理9,11,12,13,14。在这一范畴内，诸如移液混合和涡旋混合等整体混合方法为LNPs的制备提供了简单策略，无需使用复杂的仪器设备12。然而，整体混合无法实现组分的均一分布，导致LNPs粒径分布不理想，并伴随显著的批间差异15。

实验室通常采用微流控混合技术，通过更精确地控制混合条件来获得可重复的脂质纳米颗粒（LNPs）12,13,16。然而，由于微流控腔室内的尺度小、流速低，微流控装置中固有的层流条件导致溶剂与非溶剂的混合相对较慢17。微小的腔室尺寸严重限制了LNPs在GMP生产中所需的通量和可扩展性，尽管研究人员已通过并联微流控腔室来尝试扩大生产体积15。并联的微流控结构并不能消除在大体积处理过程中脂质吸附到表面的问题——这一问题通常被称为混合装置的"fouling"现象，同时在流动的均一性和稳定性方面也存在问题，使得微流控技术在工业规模生产中的放大面临挑战18,19。制药公司采用湍流撞击射流混合器来生产新冠疫苗mRNA-LNPs，这一点并不令人意外20。

RNA负载型脂质纳米颗粒（LNPs）的制备过程包括将含有RNA载荷的水相缓冲液流与含有四种不同脂质组分的乙醇流进行混合。这些配方采用pH为4.0或更低的酸性缓冲液，当水相和乙醇相混合时，使可电离脂质带正电荷。带正电的可电离脂质与带负电的RNA通过静电相互作用结合，形成疏水性的RNA-脂质盐。包括RNA-脂质盐在内的疏水性脂质物质在混合溶剂中析出，并形成疏水性核。这些核通过两性离子脂质和胆固醇的持续沉淀而生长，直至达到一个临界点，此时足量的聚乙二醇化脂质吸附在LNPs表面，从而阻止进一步生长——即成核与生长机制21,22,23。将水相缓冲液加入脂质溶液中，直至脂质析出并形成LNPs，该过程依赖于两个不同的时间尺度：溶剂-反溶剂混合时间τmix和核生长时间τagg。无量纲的达姆科勒数（Damköhler number）定义为Da = τmix/τagg，用于描述这两个时间尺度之间的相互关系24。在混合较慢的情况下（Da > 1），LNPs的最终粒径受传质控制，并随混合时间变化。相反，在快速混合条件下（Da < 1），流体被分裂为柯尔莫哥洛夫长度尺度的条纹或层状结构，此时LNPs的形成完全由各组分的分子扩散所主导，从而实现均一的LNPs形成动力学。实现后一种情况要求脂质浓度超过某一临界阈值，以建立有利于均匀均相成核的过饱和状态。

据估计，τ聚集 从几十毫秒到几百毫秒不等25在其最基本配置中，两条流路——一条含有乙醇和脂质，另一条含有携带RNA货物的水相缓冲液——被注入一个称为混合室的腔室中 "受限撞击射流" (CIJ) 混合器。在适当流速下运行时，湍流涡旋可在 1.5 毫秒内产生约 1 µm 的溶剂/抗溶剂条纹尺度。流股速度与混合几何结构决定了线性动量向湍流涡旋的转化，从而实现流体混合。该过程通过无量纲数——雷诺数（Re）进行参数化描述，Re 与流速呈线性正比关系。Re 的计算公式为 Re = Σ (ViDi/vi），其中 Vi 每股流体中的流速 vi 是各股流体的运动粘度，Di 是双射流CIJ装置中的流道入口直径26 或4喷嘴MIVM中的腔室直径27注意：某些关于CIJ的参考文献仅使用单一射流直径和速度来定义Re28在微流控装置中，雷诺数（Re）范围为1-100，而在撞击射流（CIJ）装置中，雷诺数可达125,000。在CIJ混合器中，具有相等动量的流股发生碰撞，碰撞时动量耗散形成湍流混合，由于柯尔莫哥洛夫微尺度较小且达姆科勒数较低，从而实现高效的微混合。另一种类型的混合器是 "多入口涡流混合器" （MIVM），其中四股流体被导入一个中央腔室。在此装置中，持续流入受限混合腔室可确保明确定义的混合时间尺度。在这两类混合器中，所有流体单元均会通过高能混合区域。相比之下，简单的混合装置（如T型接头）不包含提供混合区域的腔室，由于入射流体的动量主要被偏转至出口方向，而非用于产生湍流涡旋，导致两股流体的混合程度较低。CIJ和MIVM混合器均可在分批或连续模式下运行，为不同规模的脂质纳米颗粒（LNP）生产提供了灵活性。

本方案描述了如何利用两种受限撞击射流技术——双射流受限撞击射流（2-jet CIJ）和四射流多入口旋流混合器（4-jet MIVM）——制备最优的脂质纳米颗粒（LNP）配方。此前已有研究证实，CIJ和MIVM混合器可用于制备具有疏水性核心材料的纳米颗粒（NPs）。29。有关使用这些混合器形成纳米颗粒（NPs）的更多信息，应参考该文章和视频作为补充资源。本更新重点介绍基于脂质的纳米颗粒（NPs）的形成。文中展示了通过调节微混合条件来调控脂质纳米颗粒（LNPs）尺寸的能力。此外，还展示了撞击式喷射混合（CIJ）技术在形成稳定、单分散性良好且性能提升的脂质纳米颗粒（LNPs）方面的应用价值 体外 与使用低效移液混合制备的脂质纳米颗粒相比，HeLa细胞中的转染效率得到提升。此外，还讨论了每种CIJ混合结构的优缺点，以及这些混合器放大所需的相关条件。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 缓冲液、溶剂和抗溶剂流的制备

  1. 将所有脂质组分按所示质量浓度溶解于乙醇中，如图所示 表1，以制备patisiran LNP制剂10使用前将溶液加热至 37 °C 通过温和超声处理，重新溶解任何已沉淀的固体。
    注意：可制备数毫升的较大体积储备液，并储存于 4 °C.
  2. 配制100 mM、pH 4的醋酸盐缓冲液储备液：将186 mg醋酸钠和464 mg乙酸溶于80 mL无核酸酶水中。根据需要使用浓盐酸或氢氧化钠调节pH，并加水定容至100 mL。
  3. 配制1 M、pH 7.5的HEPES缓冲液母液：将23.82 g HEPES盐溶解于80 mL无核酸酶水中，根据需要使用浓HCl或NaOH调节pH，最后定容至100 mL。
  4. 将目标核酸聚合物和100 mM乙酸盐缓冲液储备液用无核酸酶水稀释，以制备 300 µg/mL 30 mM 乙酸盐缓冲液中的 RNA 溶液。根据设计的实验准备足量的工作溶液，本方案需要 1500 µL CIJ 和 MIVM 混合器的总量。
    注意：供应商提供的 RNA 通常已溶于适当的缓冲液中，浓度一般为 10 mg/mL（酵母 RNA）或 1 mg/mL（编码荧光素酶的 mRNA，LucRNA，或编码绿色荧光蛋白的 mRNA，GFP-RNA）。酵母 RNA 可作为沉淀实验中的低成本模型 RNA 使用。

2. 使用双射流CIJ混合器配制LNPs

  1. 仪器准备与清洗
    1. 使用前立即用乙醇冲洗CIJ混合器进行清洗。将两个5 mL注射器装满乙醇，并分别锁入CIJ的两个入口端口。快速推动注射器活塞，将混合器流出液作为废液收集。
      注意：CIJ混合器的构建和操作可参照先前所述方法29。可使用多种支撑架固定CIJ混合器，包括铁架台、离心管架或锥形瓶。CIJ供应商列于材料表和补充文件1中。
    2. 从CIJ上取下用于乙醇冲洗的注射器。这些注射器可储存并重复用于后续CIJ的乙醇冲洗。
    3. 通过向入口接头通入干燥氮气流，吹干CIJ的内部通道。若无氮气，可使用干燥且经过滤的空气，但必须确保不被泵油雾或气溶胶污染。
  2. 溶剂与反溶剂流的准备
    1. 混合脂质储备液，并用额外的乙醇稀释，在1.5 mL微量离心管中制备总量为500 µL、浓度为6 mg/mL的脂质溶液，具体组成见表1。
      注意：该配方为常用的Onpattro组分，包含50 mol% MC3、10 mol% DSPC、38.5 mol%胆固醇和1.5 mol% DMG-PEG2000。
    2. 将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液储备液稀释至10 mM，总体积为4 mL，作为CIJ混合器流出液的淬灭浴。
      注意：可在淬灭浴中加入磁力搅拌子以辅助混合。
    3. 用1 mL注射器抽取在步骤1.4中制备的500 µL RNA溶液。将注射器倒置，排出含有核酸聚合物的水相反溶剂流中的任何空气。
    4. 用1 mL注射器抽取在步骤2.2.1中制备的500 µL脂质溶液。将注射器倒置，排出含有脂质的乙醇溶剂流中的任何空气。
  3. 在CIJ混合器中制备LNP
    1. 将清洁的CIJ混合器置于淬灭浴小瓶上方。
      注意：可使用铁架台夹具或试管架作为CIJ混合器的支撑。典型的CIJ装置参见图1A。
    2. 将步骤2.2.3和步骤2.2.4中装填好的两个注射器连接至CIJ混合器的入口端口。
    3. 快速推动两个注射器，使溶剂与反溶剂流混合，并在淬灭浴中收集脂质纳米颗粒（LNP）。
      注意：推动注射器时必须迅速（小于1秒），同时保持平稳和均匀。流动不对称或过慢会导致生成多分散性高、粒径较大的LNP。
    4. 保持注射器连接状态，将CIJ混合器从淬灭浴上方移开。
      注意：切勿取下注射器或让滞留体积的液体流入淬灭浴，因为这部分物料混合不充分，若混入淬灭浴将对最终分散体系的性质产生不利影响。
    5. 将CIJ混合器移至废液容器上方，取下注射器，使残余的滞留体积流入废液容器。处理掉这些注射器，并按照第2.1节所述重复清洗过程。
    6. 按照下文第5节所述方法分析CIJ制备的LNP。

使用四射流 MIVM 混合器配制脂质纳米颗粒（LNPs）

  1. 组装一种被称为微型MIVM的MIVM混合器，µMIVM以区别于用于放大生产的较大型模型
    1. 收集组装MIVM混合器所需的全部单独组件：底座接收器、混合几何圆盘、顶部圆盘、O型圈和扳手。
      注意：MIVM 的构建、组装和操作此前已用于疏水性物质的包封，相关供应商列于 补充文件 1 以及 材料表29参见 图2 有关组件和搅拌器支架术语的示意图。
    2. 将O形圈嵌入混合盘的凹槽中。
    3. 将混匀盘上的孔与顶盘上的销钉对齐，然后将其推合，注意不要使O形圈移位。
    4. 将配对好的混合盘、O型圈和上盘组件松松地拧入底部接收器中。
      注意：在此步骤之前，需将出口管路从底部接收器上拆除。
    5. 使用扳手将顶部圆盘拧紧到底部接收器中。
      注意：若观察到螺纹咬合现象，可在顶部圆盘的螺纹处涂抹食品级或制药级防咬合剂。
    6. 将出口管路接头插入底部接收器并拧紧，以完成MIVM的组装。
    7. 将组装好的MIVM安装到混合架上，使出口管路穿过支撑板。
      注意：应定期执行调整MIVM混合器支架的程序，以确保混合器支架上的机械限位装置配置正确29.
  2. 溶剂与反溶剂流的制备
    1. 将两种乙醇脂质溶剂流溶液按照所述加入1.5 mL微量离心管中混合，如 表2通过稀释脂质储备液，并根据需要添加额外的乙醇，使最终脂质浓度达到6 mg/mL。
      注意：此脂质溶液的组成与2.2.1节相同，但总体积不同 1000 µL.
    2. 将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10 mM，总体积为8 mL，作为MIVM洗脱液淬灭浴。
      注意：也可向淬灭浴中加入磁力搅拌子。
  3. 使用MIVM混合器配制LNPs
    1. 将8 mL淬灭浴置于混合器支架下方，使流出管路的液体排入淬灭浴中。
    2. 用平头针将溶剂和非溶剂分别吸入1 mL气密式注射器中。去除所有气泡，并丢弃针头。通过倒置注射器并排出其中空气，对每个注射器进行预处理。
    3. 将四个注射器按顺时针方向依次安装到混合器上（注射器1-4， 表 2）与对侧的相同血管。参见 图1B 用于最终外观示意图。
    4. 握住移动板两侧的轴承座。避免将手指放在轴承座的底面，因为机械限位装置可能导致夹伤危险。小心地降低移动板，直至其均匀地落在注射器上。
      注意：操作前，所有注射器的活塞必须处于相同的高度。
    5. 平稳而缓慢地按压平板，目标是在约0.5 s至1 s内完成此操作，适用于这些流速体积。
    6. 盖上含有LNP分散液的淬灭浴。
    7. 使用后请按照下文步骤3.5中的说明对MIVM进行清洁。
  4. 使用由注射泵驱动的MIVM混合器配制脂质纳米颗粒
    1. 按照第3.1步所述组装MIVM。
    2. 按所需配比配制溶剂和反溶剂溶液，并准备足够体积以满足目标制剂规模的需求（表3).
      注意：这些组分与水相抗溶剂（步骤 1.4）和乙醇溶剂（步骤 3.2.1）流中的成分相同，但已按比例放大，以适用于更大体积的注射器使用 表3.
    3. 将溶液装入20 mL体积的气密性注射器中，并在末端连接带有鲁尔接头的PTFE管。通过倒置注射器和管路并排出所有空气，对注射器和管路进行预冲洗。
    4. 将注射器安装到注射泵中，并将注射器连接至MIVM上的混合器入口，如图所示。 图3A.
      注意：CIJ 也可在以下模式运行 通过 以相同方式泵送，但仅使用一个反溶剂和溶剂流路注射器。
    5. 将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10 mM，总体积为320 mL，作为MIVM洗脱液淬灭浴。
    6. 将淬灭浴置于MIVM出口下方。
    7. 将注射泵的体积流速设置为 20 mL/min。
      注意：可通过手动设置注射泵的数值，将体积流速调节在 2 mL/min 至 40 mL/min 范围内，以形成具有不同微混合条件的脂质纳米颗粒（LNPs）。
    8. 启动注射泵，但让前10秒的流出液流入废液杯中。在初始10秒流出后，将MIVM流出液收集至淬灭浴中。
    9. 移除并盖上盖子，该淬灭浴中含有以选定流速（20 mL/min）制备的脂质纳米颗粒（LNP）分散液。
      注意：通过选择适当的淬灭浴体积，可重复此步骤以在不同流速下合成脂质纳米颗粒（LNPs）。
    10. 每次实验之间（更换流速时），通过冲洗至少两倍于出口管路体积的溶液来清洗MIVM，以防止在开始下一次脂质纳米颗粒（LNP）合成前收集到先前流速条件下制备的LNP。
  5. 使用后的设备清洁
    1. 将混合器从支架上取下，同时保持注射器连接，将其置于废液容器上方。取下注射器，使滞留体积的液体排入容器中。然后将混合器组件倒置，使用扳手拆卸混合器。
    2. 用溶剂（如乙醇）冲洗出口管路，并用空气或氮气吹干。
    3. 用适当的溶剂（如去离子水或乙醇）冲洗混合装置，随后再用乙醇冲洗一次。使用空气或氮气气流干燥各组件。
    4. 用去离子水冲洗O形圈，然后吸干。
      注意：如果发现 O 形圈出现拉伸或变形，请将其风干过夜后再使用。由于 O 形圈属于耗材，应保持充足的库存储备。若次日其形状未能恢复，请丢弃该 O 形圈。
    5. 用溶剂彻底冲洗上部圆盘，并用气流或氮气流吹干表面和注射器接头。
    6. 用合适的溶剂（例如去离子水或乙醇）冲洗每支注射器。使用乙醇进行最后一次冲洗，然后在下次使用前晾干。

4. 脂质纳米颗粒的后期处理

  1. 缓冲液置换与乙醇去除
    1. 使用截留分子量为20 kDa的透析盒，在pH 7.4的10 mM HEPES缓冲液中对LNP分散液进行透析。
      注意：此步骤通过将乙酸盐缓冲液替换为 HEPES，既可去除残留的 10% 乙醇，又能提高分散液的 pH 值。
    2. 将1 M HEPES储备液稀释至10 mM，总体积为1 L。
    3. 使用注射器和针头将LNP分散液加入一个12 mL透析盒中。
    4. 将透析盒浸入1 L HEPES缓冲液中，并对缓冲液进行磁力搅拌。3小时后更换外部HEPES缓冲液，再继续透析3小时，总透析时间为6小时，随后取出透析盒。
    5. 从透析盒中取出透析后的LNP分散液，并弃去使用过的透析盒。
  2. LNP 悬液浓度 通过 超速离心
    1. 将悬液移入适当尺寸的离心过滤器中，其截留分子量为100 kDa30.
      注意：离心过滤器有多种规格，通常为 0.5 mL 至 12 mL。
    2. 以 2000 x g 离心分散液 g 10-20 分钟（室温），使浓度提高约 5-20 倍。
      注意：离心过程中，每5分钟检查一次样品，以确保留有适量液体。

5. 脂质纳米颗粒（LNP）的表征

  1. 通过动态光散射（DLS）测量流体动力学直径
    1. 分配 750 µL 或 900 µL 将制备好的LNP分散液（无需稀释）分别加入塑料微量比色皿或方形比色皿中。
      注意：也可在合适的比色皿中使用较小体积。
    2. 设定LNPs所分散溶剂的适当黏度（例如，10 vol%乙醇混合液为1.26 cP）。
    3. 收集背向散射光 173° 角度在 25 °C，随后根据 ISO 标准文件 13321:1996 E 的定义，采用斯托克斯-爱因斯坦模型及光散射相关函数级数展开的一阶累积量对脂质纳米颗粒（LNP）的粒径进行测定。
    4. 至少重复测量三次。
  2. Zeta电位测量
    1. 添加约~800 µL 将制备好的LNP分散液注入折叠毛细管zeta电位仪样品池中。
      注意：为避免毛细管通道内产生气泡，需将一半液体注入倒置的细胞中，然后旋转。
    2. 至少重复测量三次。
      注意：为了获得最佳效果，缓冲液电导率应保持在0.2–2毫西门子/厘米之间。
  3. 使用市售RNA定量试剂盒测定包封效率（EE）
    1. 使用无核酸酶水将检测试剂盒中提供的 pH 7.5 的 20x Tris-EDTA (TE) 缓冲液稀释至 1x 浓度。
    2. 配制2 wt%的Triton X-100溶液。
    3. 将适量的LNP分散液用1x TE缓冲液稀释，得到总质量浓度约为 0.6 µg/mL 用于RNA，乙醇含量低于0.2 vol%。
    4. 制备与前一步骤类似的样品，但含有0.5 wt.% Triton X-100，该试剂可有效溶解LNPs，从而分别在无和有Triton X-100的条件下区分“游离”RNA与总RNA浓度。
    5. 配制相应浓度的对照RNA溶液 0 µg/mL, 0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0.4 µg/mL, 0.6 µg/mL, 0.8 µg/mL 和 1.0 µg/mL 在1x TE缓冲液中。
      注意：RNA试剂盒最初可能需要稀释。
    6. 重复上一步操作，但使用0.5 wt.% Triton X-100。
    7. 将试剂盒中提供的Ribogreen染料用1x TE缓冲液稀释200倍。
    8. 向所有已配制的对照RNA和样品溶液（无论是否含有Triton X-100）中加入适量体积的稀释后Ribogreen染料。染料在对照RNA和样品溶液中的稀释倍数应相同，均为两倍。因此，染料的总体稀释倍数为试剂盒中原始浓度的400倍。
    9. 涡旋混合容器。
    10. 准备一个96孔、未经处理、平底、不透明白板，用于酶标仪分析。
    11. 分配 100 µL 将样品和RNA对照的体积分别加入到板的不同孔中。
      注意：观察含有Triton X-100的溶液中是否产生气泡。每份样品至少进行三次重复实验，需要至少 350 µL 样本的数量。
    12. 使用酶标仪记录荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为528 nm，每次读数光照持续时间约为10 s。无需振荡。
      注意：EE 由以下公式确定 包封效率方程，用于化学实验中计算包封效率（EE）的公式。，其中 I含Triton 我不含Triton 分别代表含和不含Triton X-100的三份样本重复实验的平均荧光强度，以及一个含Triton 和一个不含Triton 分别表示在有和无Triton X-100条件下，对两条平均校准曲线进行线性拟合所得的斜率31.

结果

使用双股流CIJ湍流混合器，并在适当的流速下操作，即可用相对少量的材料快速筛选出最优的LNP配方。如图3A所示，采用由可编程注射泵驱动的µMIVM混合器，以突出在超过临界雷诺数的条件下实现充分微混合的重要性，从而形成小尺寸且单分散的LNPs。用于制备LNPs的配方汇总见表3，混合器设置遵循步骤3.4中所述的方案。通过动态光散射（DLS）表征LNPs粒径随雷诺数的变化情况。如图3B所示，当雷诺数超过5000的临界值时，可观察到小尺寸且单分散的LNPs。此外，当通过手动均匀推动注射器或使用混合支架（图3B中最右侧数据点）时，可达到较高的雷诺数（~104-105）。如图2A所示，混合支架可同时均匀地推动所有注射器27，从而获得粒径最优的LNPs。混合不充分（即雷诺数过低）时，则会形成较大的LNPs。图3B展示了低雷诺数（照片1）和高雷诺数（照片2）下形成的LNPs的代表性照片。低雷诺数下制备的样品呈浑浊状，表明存在较大的胶体光散射结构（廷德尔效应），而高雷诺数下形成的LNPs则呈现澄清状态，这是由于较小胶体产生的散射较弱且发生蓝移所致。

可电离脂质具有不同的理化性质，这会影响使用其他相同脂质配方制备的脂质纳米颗粒（LNP）的理化特性。为此，可采用CIJ混合器（图1A）进行测试。表4列出了使用两种美国FDA批准的可电离脂质ALC-0315和MC3制备的配方。图4A显示，在pH 5条件下由ALC-0315制备的LNP粒径约为80 nm，而使用MC3制备的LNP粒径约为60 nm。此外，在pH 5条件下，MC3-LNP具有正的Zeta电位（约28 mV），而ALC-LNP的Zeta电位接近中性（<10 mV）。这种表面电荷的差异以及LNP整体尺寸的不同，源于这两种脂质的pKa值差异。MC3的pKa值（6.44）高于ALC-0315（6.09）32，因此在pH 5时，MC3脂质中带电比例更高。两种配方均含有1.5 mol%的PEG-脂质稳定剂；然而，由于在扩散限制聚集过程中LNP组装时存在更强的静电排斥作用，MC3-LNP在更小的粒径下即达到稳定，从而抑制了进一步生长。如图4B所示，两种配方均表现出高的包封效率（>90%）。脂质的化学结构对于决定LNP的整体性质及其性能至关重要，因此必须根据目标应用谨慎选择脂质种类。

使用两种湍流混合器几何结构（步骤2.3和步骤3.3）制备的脂质纳米颗粒（LNP）具有相似的理化性质。该比较进一步扩展至采用较差混合技术（如移液枪批量混合）制备的LNP，以进一步说明湍流混合器与非均匀混合技术之间的差异（图1C）。表5总结了用于制备LNP的配方，如图5所示。对于移液混合技术，等体积的乙醇相和水相通过上下吹打15-20秒快速混合，随后将混合物用移液枪加入pH为4的醋酸盐缓冲液浴中。图5A显示，在淬灭用10 mM醋酸盐缓冲液浴（pH 4，含10 vol%乙醇）中，无论使用何种混合器几何结构（CIJ或MIVM），所形成的LNP粒径均显著相似且较小（约50 nm）。然而，采用移液混合技术制备的LNP粒径是使用湍流混合器所制备LNP的两倍。这表明，在足够高的流速下（雷诺数超过临界值的湍流区），不同CIJ几何结构制备的LNP表现出相似的特性，而混合不良则会导致粒径更大、粒径分布更宽的LNP。

接下来，将LNPs置于10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4，体积为100倍）中透析，以去除乙醇并将pH调节至7.4。在此过程中，LNPs会发生一定程度的融合和粒径略微增大，如图所示。 图 5A，这与文献中已有深入研究的融合机制一致33总体而言，使用CIJ和MIVM混合器制备的脂质纳米颗粒（LNP）粒径小于100 nm，而使用移液管混合制备的LNP粒径约为140 nm。如图所示 图5B，这些制剂的zeta电位均低于10 mV，表明它们在pH 7.4条件下均为中性。此外，它们均表现出较高的包封效率 >95% (图5C因此，可利用湍流混合技术轻松制备具有最佳理化特性的脂质纳米颗粒（LNPs）。通过执行以下实验来评估这些LNPs的性能 体外 在HeLa细胞中的转染

基于荧光素酶的 体外 转染实验方案采用自先前发表的研究34. 图6A 绘制三种配方每1000个细胞的发光值（RLU） 表5Lipofectamine 3000 用作阳性对照。需要注意的是，Lipofectamine 3000 通常用于 DNA 制剂，但在这些实验中可作为合适的对照。使用 2 喷嘴 CIJ 和 4 喷嘴 MIVM 混合器制备的脂质纳米颗粒（LNP）的转染效率明显高于使用移液管混合制备的 LNP。尽管由于每个 LNP 载量更大，较大颗粒预期应比小颗粒具有更高的转染效率，但此处使用移液管混合制备的 LNP 转染效果反而更低。这明确表明，采用 CIJ 技术制备的 LNP 与采用移液管混合制备的 LNP 在结构上存在显著差异。使用 CIJ 和 MIVM 混合器制备的 LNP 的转染效率基本相同。Lipofectamine 3000 的转染效率最低。 图6B 评估LNP的毒性 体外 使用基于刃天青钠盐的细胞活力检测法在HeLa细胞上进行35所有制剂均表现出较低的细胞毒性，这体现在细胞存活率较高，以未接受任何纳米颗粒处理的对照组为参照，活细胞百分比均维持在较高水平。

喷射混合器装置：(A) 双喷射受限撞击射流混合器，(B) 四喷射微多入口涡流混合器，(C) 移液混合。流体动力学示意图。
图1：用于制备脂质纳米颗粒（LNP）的混合方法。（A）双喷射受限撞击射流混合器（CIJ），显示了一个透明混合器的照片以及实验室中常规使用的组装式Delrin混合装置。（B）四喷射微多入口涡流混合器（µMIVM），显示了一个透明混合器的照片以及组装好的不锈钢和Delrin混合装置。透明混合器的入口流道已移至混合器两侧，以便更清晰地观察混合几何结构；而在实际使用的混合器中，入口流道从顶部进入。CIJ和µMIVM均在足够高的液体流速下运行，使流动处于湍流状态，混合产生的柯尔莫哥洛夫微尺度小于1 µm，从而可在约1.5 ms内实现过饱和。（C）广泛用于通过混合水相和乙醇相溶液来制备小体积LNP分散液的移液混合装置。请点击此处查看该图的放大版本。

显示移动板、机械止挡、支撑板和混合组件的流变仪装置示意图
图 2：µMIVM 及其混合支架的放大视图。（A）组装好的 µMIVM，配有玻璃注射器，位于混合支架下方，该支架有助于均匀且快速地按压注射器。此图引自 Markwalter 等人29。（B）拆解状态的 µMIVM，显示其内部组件。该混合结构与图 1B中的透明混合器相同，区别仅在于进样流体从顶部圆盘进入，而非从侧面圆柱表面进入。请点击此处查看该图的放大版本。

µMIVM 注射泵示意图，LNP 尺寸与雷诺数关系图；流体动力学直径分析。
图3：在湍流混合器中提高雷诺数可减小LNP的流体动力学直径，直至达到临界雷诺数的平台期。（A）注射泵与µMIVM装置的示意图，通过设定各流路的体积流速来调控湍流混合器中的雷诺数。（B）MIVM中LNP流体动力学直径随雷诺数的变化。提高雷诺数和湍流动能耗散率可改善混合效果，实现更均一的混合、过饱和及颗粒生长。当雷诺数超过临界值后，由于Da<<1条件成立（即溶剂/反溶剂扩散时间远短于纳米颗粒组装时间），即使进一步增加流速，LNP尺寸也保持不变。图中所示流速为四股流路的总流速。请点击此处查看该图的放大版本。

粒径、ζ电位、包封效率图；ALC 与 MC3；纳米材料分析结果。
图 4：使用不同可电离脂质制备的脂质纳米颗粒（LNP）的胶体性质。（A）使用两种不同可电离脂质 ALC-0315 和 MC3 制备的 LNP 的流体动力学直径和 ζ 电位。测量在 LNP 形成后于淬灭浴中 pH 5 条件下进行。可电离脂质表观 pKa 的差异影响 LNP 的胶体性质。（B）两种 LNP 的包封效率测量结果（n = 3，误差条表示一个标准差）。请点击此处查看该图的放大版本。

LNP表征：流体动力学直径、zeta电位、包封效率；柱状图。
图5：使用MC3可电离脂质并通过不同混合器制备的包封荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）的胶体性质。（A）使用双射流、四射流和移液管混合器制备的LNP的流体动力学直径。测量在LNP形成后淬灭浴的酸性条件（左侧）以及透析至中性HEPES缓冲液后（右侧）两种条件下进行。在pH中和过程中，由于可电离脂质的去质子化，导致LNP发生融合与生长，从而使得颗粒尺寸增大。脂质-PEG稳定剂在此过程中抑制了颗粒的聚并生长，防止形成微米级沉淀。（B）在10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中透析后的LNP表面电荷测量结果（以ζ电位表示）。所有LNP的ζ电位均在0 mV的±2 mV范围内，表明这些颗粒表面呈电中性，仅带有几乎无法检测到的阳离子电荷。（C）LNP透析后的包封效率测量结果（n = 3，误差条表示一个标准差）。请点击此处查看该图的放大版本。

HeLa细胞转染及活力比较图表；荧光素酶活性、细胞活力百分比数据
图6：使用制备好的LNPs转染HeLa细胞。(A) 加入荧光素后表达的荧光素酶的发光强度。(B) 与LNPs孵育后HeLa细胞的活力。细胞活力无统计学显著变化，由刃天青代谢实验测定（n = 4，误差条表示一个标准差）。请点击此处查看该图的放大版本。

流体 /
淬灭浴		组分配方储存液浓度体积
注射器 1 -
乙醇相
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL0.5 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 2 -
水相
（RNA 0.3 mg/mL）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL0.5 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
淬灭浴乙酸盐缓冲液10 mM, pH 4100 mM, pH 44 mL

表1：通过CIJ混合器制备的标准patisiran脂质纳米颗粒（LNP）配方。 本方案中使用酵母RNA作为模型RNA。所有溶液在装入注射器前均需完全分子溶解并充分混合。

流体（流）/
淬灭浴		组分配方储存液浓度体积
注射器 1 -
乙醇流
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL0.5 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 2 -
水相流
（0.3 mg/mL RNA）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL0.5 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
注射器 3 -
乙醇流
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL0.5 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 4 -
水相流
（0.3 mg/mL RNA）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL0.5 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
淬灭浴乙酸盐缓冲液10 mM, pH 4100 mM, pH 48 mL

表2：通过MIVM混合器制备的标准patisiran脂质纳米颗粒（LNP）配方。 MIVM混合器使用四股流体——两股溶剂和两股非溶剂。虽然可以使用动量不相等的流体，但本方案中选择使用动量相等的流体。

流体（流）/
淬灭浴		组分配方储存液浓度体积
注射器 1 -
乙醇流
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL20 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 2 -
水相流
（RNA 0.3 mg/mL）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL20 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
注射器 3 -
乙醇流
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL20 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 4 -
水相流
（RNA 0.3 mg/mL）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL20 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
淬灭浴
（收集时间
= 30 s）		HEPES 缓冲液10 mM, pH 7.51 M, pH 7.5320 mL

表3：由注射泵驱动的MIVM混合器制备的脂质纳米颗粒（LNP）配方。 本实验以DODMA作为可电离脂质，酵母RNA作为模型RNA。本方案选用流速为40 mL/min的示例条件进行操作。

流体 /
淬灭浴		组分配方储存液浓度体积
注射器 1 -
乙醇相
（总脂质浓度 12 mg/mL）		可电离脂质（MC3 或 ALC0315）50 mol%50 mg/mL0.5 mL
两性离子脂质（DSPC）10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质（DMG-PEG2000）1.5 mol%4 mg/mL
注射器 2 -
水相
（RNA 浓度 0.6 mg/mL）		酵母 RNAN/P 610 mg/mL0.5 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 5100 mM, pH 5
淬灭浴乙酸盐缓冲液10 mM, pH 5100 mM, pH 59 mL

表4：由两种不同可电离脂质通过CIJ混合器制备的脂质纳米颗粒（LNP）配方。 配方由ALC-0315或MC3制备，其余所有组分保持不变。

流体（流）/
淬灭浴		组分配方储存液浓度体积
注射器 1 -
乙醇相流体
（总脂质 6 mg/mL）		可电离脂质 (MC3)50 mol%50 mg/mL0.5 mL
两性离子脂质 (DSPC)10 mol%5 mg/mL
胆固醇38.5 mol%5 mg/mL
聚乙二醇化脂质 (DMG-PEG2000)1.5 mol%4 mg/mL
注射器 2 -
水相流体
（RNA 0.3 mg/mL）		FLuc mRNAN/P 61 mg/mL0.5 mL
乙酸盐缓冲液20 mM, pH 4100 mM, pH 4
淬灭浴乙酸盐缓冲液10 mM, pH 4100 mM, pH 44 mL

表5：通过CIJ混合器制备的标准patisiran脂质纳米颗粒（LNP）配方。 表达荧光素酶蛋白的FLuc mRNA被用于通过生物发光检测法测量基因表达。

补充文件1：CIJ和MIVM混合器的供应商。 请点击此处下载该文件。

讨论

已介绍使用两个对向射流湍流混合器合成含有核酸聚合物的脂质纳米颗粒（LNPs）的方法。当以适当的流速进行时，对向射流湍流混合器可确保混合时间尺度短于LNP的组装时间，从而产生均匀的过饱和条件，形成粒径小且分布窄的LNPs21。因此，采用相同化学成分但不同湍流混合器几何结构（双射流CIJ混合器和四射流MIVM混合器）制备的LNPs表现出相似的理化性质，并显示出良好的转染效率（图5 和 图6）。相比之下，采用移液方式混合（混合效果较差）所制备的LNPs粒径更大、多分散性更高（图5A），且转染效率较低。长期以来人们已认识到，混合与组装动力学在LNP制备过程中起着关键作用；Cullis等人指出，乙醇与缓冲液之间的快速对流-扩散混合可形成粒径小且分布窄的颗粒，而缓慢的扩散混合则导致形成粒径较大且分布较宽的颗粒9。在对向射流湍流混合器中，混合的时间尺度与进入混合器的流体流速成比例地减小27。这一现象可通过无量纲雷诺数（Re）进行量化，Re表示惯性力与粘性力之间的比值。当Re足够高时，CIJ和MIVM混合腔内发生湍流，湍流涡旋拉伸产生微小的长度尺度，从而通过扩散实现溶剂与反溶剂的快速混合。湍流的特征长度尺度取决于Re，而不依赖于混合装置的具体几何结构。这正是CIJ和MIVM混合器能够制备出相同LNP颗粒的原因，也是不同尺寸的MIVM混合器能够产生相同纳米颗粒（NP）尺寸的原因27。在高Re条件下（对应高入口流速），LNPs可被重复稳定地制备，且批次间无显著差异（图3B）。

本方案利用湍流受限撞击射流（CIJ）混合器，可制备具有不同理化特性的多种mRNA、DNA或siRNA脂质纳米颗粒（LNP）。该技术不仅允许在组分和浓度上具有高度灵活性，还提供了一条清晰的路径，可在实验室规模（数毫克）快速筛选配方，并将优选配方以每分钟5升的生产速率放大至工业级批量生产36。这对于其他多种技术（包括体相混合和微流控技术）而言一直是重大挑战。例如，体相加工技术甚至在数毫升规模下也难以稳定地重复生产出一致的LNP。微流控技术相较于体相混合技术显著提升了LNP的均一性和可重复性；然而，其产量仅限于毫克级别29。如引言中所述，尽管通过微流控装置的并行化尝试实现向生产规模的放大，但仍无法解决装置污染（结垢）问题，且其放大效果远不如基于受限撞击射流技术的混合器。

除了这些优势之外，CIJ 混合器将在制造具有靶向能力或可进行基因编辑的下一代脂质纳米颗粒（LNP）中发挥关键作用。目前的 LNP 配方中，脂质和核酸具有相似的扩散性，因此即使在实验室规模下混合效果略差，也能实现制备。然而，基因编辑方法可能需要包封分子量差异较大的核酸种类，例如小分子向导 RNA 和用于编码 CAS9 蛋白的大分子 mRNA 转录本37。这些不同种类核酸的扩散时间尺度差异极大，使得在化学计量比下实现均匀包封变得具有挑战性。当混合效率降低时，均匀包封的问题会更加突出。同样，靶向肝外细胞可能需要引入强结合且扩散缓慢的稳定剂（例如带有靶向配体的大分子量嵌段共聚物）。在纳米颗粒组装前，可将高达 14 kDa 的靶向配体偶联至嵌段共聚物上，从而利用 CIJ 混合实现其在纳米颗粒中的均匀掺入38。CIJ 湍流混合器是制造由不同扩散性组分构成的 LNP 的有效工具。

尽管对撞射流（CIJ）湍流混合器在制备脂质纳米颗粒（LNP）方面相较于其他混合器具有多项优势，但需注意每种几何结构所伴随的局限性。双射流CIJ混合器要求两股进料流（乙醇相和水相）的动量相等（在10%-30%范围内），才能在腔室内实现均匀的湍流微混合。由于出流中溶剂与反溶剂的比例为50:50，这限制了沉淀发生区域混合腔内的过饱和程度29。四射流MIVM混合器解决了这一缺点，因其可利用四股动量不等的射流，在混合腔内实现更高的过饱和条件。此外，这两种混合器的总处理量通常仅为毫克级别，使其在高通量筛选多种不同LNP配方时并非理想选择。对于简单的LNP配方，初步筛选可优先采用微流控或微量移液策略在微克尺度上进行，待确定若干候选配方后，再转移至受限对撞射流技术进行放大。同时，混合器中的死体积也必须予以充分考虑。在双射流CIJ混合器中，滞留体积为50–100 µL。在计算工艺回收率时，这部分物料必须从淬灭浴中收集的产物量中扣除。虽然在大规模操作中这些损失可忽略不计，但在总反应体积仅为5 mL的情况下，此类损失可达10%，如本研究所示。对撞射流湍流混合器是实现GMP级LNP生产的重要工具，这一点已由两种获得FDA批准的新冠疫苗所证实。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

BKW 获得美国国家科学基金会（NSF）奖学金（DGA1148900）、Tessera Therapeutics 公司的支持、比尔及梅琳达·盖茨基金会（BMGF，合同编号：OPP1150755 和 INV-041182）以及美国食品药品监督管理局（FDA）资助项目（编号：75F40122C00186）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18:0 PC（DSPC）Avanti Polar Lipids850365P辅助脂质
21 G × 1-1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头BD305167
96孔黑色壁黑色底板Fisher Scientific07-000-135
96孔白色/透明底板，TC表面赛默飞世尔科技165306
冰醋酸Fisher ScientificA38-212
ALC-0315Avanti Polar Lipids890900可电离脂质
Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa 截留分子量，15 mLMillipore SigmaUFC910024
Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa 截留分子量，4 mLMillipore SigmaUFC810096
Bright-Glo 荧光素酶检测系统PromegaE2620
胆固醇Millipore SigmaC8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)TriLink 生物技术公司L-7202
受限撞击射流混合器Holland Applied Technologies，Helix Biotech，Diamond Tool and Die（DTD）N/A请联系 Holland 或 DTD 以获取定制订单，Helix Biotech 系统为 Nova BT。审阅新混合器验证的相关文本
D-Lin-MC3-DMA MedChemExpressHY-112251 可电离脂质
DMEM，高糖，丙酮酸赛默飞世尔科技11995065
DMG-PEG 2000Avanti Polar Lipids880151PPEG-脂质
DODMAAvanti Polar Lipids890899P可电离脂质
乙醇 200 证明Decon Labs, Inc.2701
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-959-70C
Falcon 50 mL 高透明度锥形离心管Fisher Scientific14-959-49A
胎牛血清，经认证，美国赛默飞世尔科技16000044
HeLaATCCCCL-2
HEPES，游离酸IBI ScientificIB01130
HSW HENKE-JECT 两组分 1 mL 鲁尔接头Henke Sass Wolf4010.200V0
HSW HENKE-JECT 两组分 5 mL（6 mL）鲁尔锁扣Henke Sass Wolf4050.X00V0
Idex 1648 ETFE 管 <图片 替代文本="公式 2" 源文本：src="/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg" 样式="margin: auto;"/>” OD 0.093” IDIdex Health &与科学1648
Idex P-678 ¼”-28 至鲁尔接头Idex Health &科学P-678
Idex P-940 ETFE管用卡套Idex Health &与科学P-940
Lipofectamine 3000 转染试剂赛默飞世尔科技L3000001
鲁尔接头Idex Health &与科学P-604使用带有相应螺纹的 CIJ 或 MIVM 混合器入口进行组装。Idex 部件也可通过 VWR 及许多其他供应商获取。
混匀仪支架霍兰应用技术公司N/A参见 Markwalter &&  Prud'homme 提供设计支持。26 请联系 Holland 购买
多入口涡旋混合器霍兰应用技术公司与钻石模具公司（DTD）N/A请联系 Holland 或 DTD 以获取定制订单。审阅新混合器验证的相关文本
O形圈（MIVM）C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75订购大量耗材部件。若使用其他来源的溶剂，请确保溶剂兼容性。
出口卡套 - CIJIdex Health &与科学P-200使用出口接头组装（大端与管路平齐）
出口接头 - CIJIdex Health &与科学P-205使用卡套和管路连接CIJ腔室出口
出口接头 - MIVMIdex Health &与科学P-942与套圈组合
出口管 - CIJIdex Health &与科学1517使用管子切割器以获得整齐的切口。确保多余的管子不会伸入混合室中
出口管 - MIVMN/AN/A与套圈内径匹配。
PBS - 磷酸盐缓冲液（10倍浓度），pH 7.4，无RN酶赛默飞世尔科技AM9624
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140122
PHD 2000 可编程注射泵Harvard ApparatusN/A
1 mL 塑料两件式注射器赛默飞世尔科技S7510-1
塞子接头Idex Health &科学P-309在CIJ混合器侧面组装（密封钻孔的进入点）
Quant-it RiboGreen RNA 定量检测试剂盒、RiboGreen RNA 试剂、RediPlate 96 RiboGreen RNA 定量微孔板试剂盒赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司R11491
刃天青钠盐赛默飞世尔科技R12204
RNase AWAY 表面去污剂赛默飞世尔科技7000TS1
闪烁瓶DWK生命科学74504-20
SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣，100 mLSGE100MR-LL-GT
SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣，50 mLSGE50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer 透析盒，20 K 道尔顿截留分子量赛默飞世尔科技66012
乙酸钠Millipore Sigma32319-500G-R
氢氧化钠Fisher ScientificS320-500
蔗糖Millipore SigmaS7903-1KG
无菌注射器滤器Genesse Scientific25-243
Triton X-100Millipore Sigma9036-19-5
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红赛默飞世尔科技25200056
水，无内毒素优质生物材料118-325-131无RNA酶和DNA酶
酵母RNA（10 mg/mL）赛默飞世尔科技AM7118

参考文献

  1. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  2. Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
  3. Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
  4. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  5. Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
  6. Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
  7. Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624(2023).
  8. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  9. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
  10. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
  11. Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161(2023).
  12. Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
  13. Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
  14. Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
  15. Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
  16. Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
  17. Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197(2022).
  18. Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141(2022).
  19. Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266(2020).
  20. Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
  21. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
  22. Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
  23. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37(2012).
  24. D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
  25. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302(2003).
  26. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  27. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE. 49, 2264-2282 (2003).
  29. Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757(2019).
  30. Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. (168), e62226(2021).
  31. Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083(2024).
  32. Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943(2022).
  33. Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
  34. El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810(2023).
  35. Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
  36. Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200(2019).
  37. Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
  38. Pinkerton, N. M. Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. Princeton University. , PhD thesis, http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01h128nd846 (2014).

重印与许可

标签

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。