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方法文章

68Ga标记纳米分子的放射性合成、质量控制及小动物正电子发射断层成像

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DOI：

10.3791/67048

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

本文内容

摘要

本文描述了一种新型放射性标记探针（即68Ga标记的纳米抗体NM-02）的放射性合成、制剂制备、质量控制，及其在异种移植模型中小动物PET/CT成像中的应用。

摘要

小型动物正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像技术在临床前癌症研究中至关重要，需要对放射性示踪剂的合成、质量控制以及体内注射方案给予细致关注。本研究提出了一套全面的工作流程，旨在提高小型动物PET实验的稳健性和可重复性。文中详细描述了在放射化学实验室中使用68Ga进行示踪剂合成的过程，并强调了每次放射性示踪剂制备过程中严格的质量控制与质量保证规程。浓度、摩尔活性、pH值和纯度等参数均被严格监测，符合适用于人体研究的标准。该方法引入了简化的注射器制备流程，以及一种定制设计的30G套管，用于对小鼠进行精确的静脉注射。在扫描过程中对动物健康状况（包括体温和心率）的监测，确保了实验全程动物的福利。PET和SPECT扫描的剂量预先确定，以在数据采集与尽量减少动物及研究人员的辐射暴露之间取得平衡。同样，CT扫描采用预设程序设置，以限制辐射暴露，这在评估治疗效果的长期研究中尤为重要。通过优化这些步骤，该工作流程旨在标准化操作程序、减少变异，并提升小型动物PET/SPECT/CT成像的质量。本资源为致力于提高分子成像领域临床前研究准确性与可靠性的研究人员提供了有价值的参考，从而推动该领域的发展。

引言

一个极为重要的研究领域是乳腺癌研究。乳腺癌仍是一种高发癌症，约占所有癌症病例的1/3rd 女性所有癌症中的。治疗方案需根据肿瘤的生物学和组织学特征以及疾病分期进行个体化制定。若肿瘤尚未转移，预后通常较好；一旦发生转移，5年生存率仅为约30%。1其他妇科恶性肿瘤也面临类似情况，例如卵巢癌就表现出 > 1期肿瘤的5年生存率为95%，而转移性4期肿瘤仅为15%2,3.

非侵入性成像技术，特别是正电子发射断层扫描（PET），正在深刻改变癌症研究，因为它能够以前所未有的方式揭示肿瘤的分子特征，例如代谢活动、受体表达以及对治疗的反应4,5,6。PET不仅能够可视化特定的代谢区域，还能对其进行定量分析，从而不仅有助于精确诊断，还可以在极短的时间内监测（新）疗法的效果。事实上，PET能够在1至3个治疗周期后即可评估治疗是否有反应，相较于传统的计算机断层扫描（CT）所观察到的形态学变化，其评估更为准确和迅速7。PET的非侵入性特点还使其适用于纵向研究。

为了充分评估新型（放射性）药物的治疗潜力，任何动物模型都需要最大程度的标准化，因此必须重视这一问题——无论是在肿瘤模型的建立过程中，还是在小动物PET成像及数据分析中。关于动物体内最佳肿瘤模型的选择（皮下接种或原位移植，使用小鼠、人源或同源性肿瘤，是否伴随常规临床护理）可能存在争议，但这超出了本出版物的目标范围。我们目前在癌症研究中采用多种模型，而本文所描述的是一种相对简单的皮下肿瘤模型。

放射化学中的质量控制对于动物安全和治疗效果至关重要。这不仅涉及放射性药物本身，还包括产品的配方。针对临床应用放射性药物的生产，已有大量法规要求8,9（详见 10中对现行法规和指南的全面概述），同时也有若干关于临床前研究用放射性药物特性的指导原则（详见11中的全面概述）。我们同时为临床和临床前应用生产放射性药物，从而可将临床级合成中所采用的高标准质量控制简化并应用于临床前研究中。

我们的研究重点是靶向诊疗，特别是针对人表皮生长因子受体2（HER2）阳性癌症。因此，我们开发新型放射性药物，用于癌症的诊断以及治疗过程中的监测。成功的诊断用放射性药物还将通过使用不同的放射性同位素被评估为治疗性化合物。这些放射性药物首先在动物模型中进行评估，在获得有希望的临床前结果后，致力于实现临床转化。本文将以一种放射性药物为例，介绍我们在质量控制与保障、小鼠静脉注射标准操作以及PET/CT扫描方面的实验方案，以提高分子影像学临床前研究的准确性和可靠性。该实验方案分为三个部分：放射化学（示踪剂合成与质量控制）、动物模型构建（皮下肿瘤模型）和影像学检测。

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方案

本研究方案遵循最高标准的动物福利要求，并严格遵守亚琛大学医院的动物护理指南。我们致力于确保研究中所有动物均得到符合伦理和人道的对待，相关操作程序均经过当地动物伦理委员会审查和批准。所有动物实验均已获得德国主管机构（北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局，LANUV）的批准，以确保符合《动物保护法》以及关于实验和其他科学用途动物保护的法规要求。

注意：本研究中使用的所有仪器、材料和试剂的完整列表见材料表。需要特别指出的是，68Ga 的操作应尽可能使用移液器，绝对避免接触任何金属，因为铁会显著降低标记产率。这意味着在完成放射化学操作之前，必须避免使用针头。

1. 放射化学

  1. NM-02-DOTA-GA 与放射性同位素标记 68Ga
    注意：本实验方案涉及放射性物质的操作与处理。研究人员必须遵守当地关于放射性物质管理的法律法规，遵循合理可行尽量低（ALARA）原则，使用铅屏蔽装置，尽量减少接触时间，并在放射暴露的每一步骤中保持最大距离。实验操作过程必须使用放射性检测设备进行监测。
    1. 洗脱 68Ge/68Ga-发生器手动或自动洗脱至10 mL 0.6 M HCl中（1.2 GBq/10 mL）。捕获 68Ga 在 PS-H 上+ 通过将洗脱液流经色谱柱（M 型，0.8 mL），对 PS-H 进行洗脱。+ SPE 小柱，分步缓慢加入共 1 mL 的 4 M NaCl，收集至微量离心管中。
    2. 弃去前0.3 mL洗脱液，将剩余的0.7 mL收集至另一微量离心管中。
    3. 取一支新的微量离心管，并按照试剂盒说明书所述步骤对 NM-02-DOTA-GA 进行放射性标记。
      注：纳米抗体-螯合剂偶联物（NM-02-DOTA-GA）已根据供应商提供的方案预先制备。该偶联物可分装后于 -80 °C 数月。
    4. 使用最多将产品的 pH 值调节至约 7 5 µL 3 M NH₄Cl4OAc
  2. 质量控制
    1. 使用活度计在正确设置下测量微量离心管中浓缩样品的活度（68Ga 作为同位素；1 mL 注射器，取 0.1 mL 用于几何校正）。放射化学产率（衰变校正后）应至少达到 40%。
    2. 使用 pH 试纸（0-14）测定 pH 值，将足量待测液滴加至 pH 试纸（10-15 µL).
    3. 薄层色谱法（TLC）
      1. 斑点 1 µL 在浸渍有硅胶的薄层色谱条上点样放射性标记反应混合物。让点样液在空气中干燥约1分钟。使用柠檬酸作为流动相（在密闭的薄层色谱室中预先平衡至约2-3 mm高度）展开薄层色谱。当溶剂前沿迁移至色谱条顶端时，将色谱条从层析室中取出。
      2. 将TLC条带置于放射性TLC扫描仪上，按照制造商的说明书进行检测。产物应出现在原点位置（Rf < 0.2），而游离 68Ga阳离子将随溶剂前沿洗脱（Rf > 0.9).
      3. 通过放射性色谱图计算反应的放射性标记产率，将R处曲线下的积分面积（AUC）除以总积分面积。f 0.0-0.2 除以总AUC（Rf 0.0-1.0），再乘以 100。
    4. 高效液相色谱法（HPLC）
      1. 确保高效液相色谱仪（HPLC）使用正确的溶剂运行至少10分钟，以充分润洗所有管路，并调整检测参数。采用等度洗脱模式，流动相A为乙腈，流动相B为0.9% NaCl溶液（980 mL）与三氟乙酸（1 mL）及柠檬酸溶液（20 mL）的混合液，A与B的体积比为50:50。在280 nm波长下检测紫外吸收。
      2. 取 5 µL 产物并用 15 µL 0.9% NaCl。注射 15 µL 分析性放射性高效液相色谱（radio-HPLC）中的混合物5 µm SEC-s2000 154 Å 色谱柱；流速：2 mL/min。
      3. 使用乙腈（溶剂A）与0.9% NaCl溶液（980 mL）混合三氟乙酸（1 mL）和柠檬酸溶液（20 mL）组成的混合液（溶剂B）以50:50比例进行等度洗脱。在280 nm处检测紫外吸收。紫外通道与γ射线通道之间的保留时间存在轻微偏移，这是由于高效液相色谱仪（HPLC）的设计所致（γ射线信号检测器串联安装在紫外检测器之后）。
      4. 通过积分γ通道中的峰来确定放射化学纯度。产物应位于先前通过测量非放射性标记纳米抗体所确定的积分范围内。此外，对γ通道中所有其他峰进行积分，并将其评估为杂质。纯度应为 >95%.
    5. 内毒素
      1. 将产物用总体积为的溶液稀释至1:20 150 µL 使用（经认证的）无内毒素水进行稀释。
      2. 插入一次性内毒素检测 cartridge（商品化预装所有必要试剂）至内毒素检测仪中并加载 25 µL 每个 cartridge 腔室中稀释后产物的量。
      3. 按压 播放. PTS 包含内部阳性和阴性对照，并将被纳入最终报告。检测过程约需 15 分钟。若样品中内毒素含量低于规定限值，则该产品被视为无内毒素。 < 8.7 EU/mL 在 V 时max = 20 mL
    6. 回顾性无菌检测
      1. 注射并采集质量样品后，将放射性药物储存在无菌小瓶中，并置于冰箱中，温度为 4 °C.
      2. 将样本送至有资质的机构（内部或外部公司）进行无菌性分析，若豁免限值为105 Bq 或 10 Bq/g 未超过时，方可按照无菌试验要求进行12.
  3. 注射器准备（每只动物一支）
    1. 使用活度计在正确的设置下测量产物的活度（68Ga 作为同位素；1 mL 注射器，取 0.1 mL 用于几何校准。
    2. 取约15 MBq的产物（约 25 µL)于微量离心管中，用0.9% NaCl补足体积至 75 µL.
    3. 添加 50 µL 将注射器连接至活度计，并在正确的设置下测量其放射性活度（68Ga作为同位素；1 mL注射器，取0.1 mL用于几何校正。注射器中应含有10 MBq的产物。
      注意：一旦 68Ga标记的纳米抗体NM-02形成后，操作时不再需要塑料移液器吸头 68从这一步开始，每当实验方案中提到处理液体时，应使用适当的注射器（1 mL）和针头（27–30G）。

2. 动物模型构建

  1. 动物饲养
    1. 使用雌性免疫缺陷型 Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu 6至8周龄的小鼠（来自商业供应商），用于建立皮下肿瘤。到达后，将所有小鼠直接安置于动物房，并在运输后给予至少1周时间适应环境。
    2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并提供自由摄食和饮水。保持室温及相对湿度在20-25 °C 分别为45%–65%。
  2. 细胞移植前的制备
    1. 从 1 × 10 开始进行细胞培养6 SKOV-3 细胞，向 T175 细胞培养瓶中加入 25 mL 预热的含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基。
    2. 在培养箱中培养细胞 37 °C 和5% CO2 每周至少更换两次完全培养基。
    3. 在细胞移植前1周或最迟前1天，进行 20 µL 从细胞培养瓶中取出培养基以检测支原体13仅使用无支原体污染的细胞进行细胞注射。
    4. 在细胞注射当天，吸出完全培养基，用移液管向瓶中加入5 mL PBS。来回轻轻晃动瓶子数次，以洗去残留的培养基。
    5. 向培养瓶中加入 3 mL 胰蛋白酶，在培养箱中孵育 4 分钟 37 °C 和 5% CO2 用以解离细胞。在显微镜下以40倍放大观察细胞是否已从细胞培养瓶上脱落。
    6. 加入7 mL培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
    7. 以 150 x g 离心细胞 g 离心5分钟（室温）以获得细胞沉淀。移除上清液，加入1 mL培养基重悬细胞。
    8. 取 12 µL 将细胞悬液加入微量离心管中，加入等体积的台盼蓝。用此混合液填充血细胞计数室。 10 µL 仔细混匀的细胞悬液。
    9. 在指定区域内计数未染色的活细胞，并计算细胞数量。将细胞浓度调整至 5 x 107 细胞/mL 培养基，并将细胞悬液与 1 mL 基底膜基质轻柔混匀。
    10. 取 5 x 106 每只小鼠使用1 mL胰岛素注射器，将细胞悬浮于0.2 mL细胞培养基与50%基底膜基质的混合液中。注射前将注射器置于冰上，以防止基底膜基质凝固。
      注意：若小鼠体重小于20 g，则仅注射 150 µL （适用于15-20克）或 100 µL （适用于10-15克）混合物。皮下给药时，需注意确保给药体积不超过GV-SOLAS推荐的最大剂量，即10 mL/kg体重。14.
  3. 接种与随访
    1. 用一只手固定动物的颈部和尾部，将细胞悬液皮下注射至清醒动物的侧腹部。通常，我们更倾向于注射于左侧腹部。
    2. 等待基底膜基质硬化10−15秒，然后移除针头。
    3. 植入后每日使用数字游标卡尺测量两个相互垂直的肿瘤轴径，以监测肿瘤生长。
    4. 利用这些测量数据，通过以下公式计算肿瘤体积来评估肿瘤生长情况：
      VT = L × B2 × π / 6
      其中 VT 肿瘤体积，单位为 mm³3, L 为肿瘤的长度（mm）（即两条垂直轴中较长的一条），以及 B 肿瘤的宽度（单位：mm），即两条相互垂直的轴线中较短的一条15该技术倾向于高估肿瘤体积，因为它将皮肤组织也包含在内。
    5. 肿瘤质量会影响小鼠在电子天平上测得的体重。为计算经肿瘤质量校正后的动物体重，请使用以下公式：
      m小鼠-T = m小鼠 - 0.82 × VT
      其中 m小鼠-T 是小鼠体重（不包括肿瘤质量），单位为 g， m小鼠 是电子天平测得的小鼠体重（单位：g） VT 以 mm³ 计的计算肿瘤体积30.82 g/mm3 根据此前动物实验中分离的一系列肿瘤的平均值，经称重并利用给定公式计算其体积，所得结果代表平均肿瘤密度。
    6. 此外，确定肿瘤相对于小鼠的大小，并使用以下公式监测肿瘤负荷：
      肿瘤负荷 [%] = (0.82 × VT) / m小鼠 × 100
      其中肿瘤负荷以百分比表示，0.82 × VT 对应肿瘤质量（单位：g）即, VT，以 mm³ 计算的肿瘤体积3，平均肿瘤密度的倍数），以及 m小鼠 小鼠体重根据天平读数，单位为 g。
    7. 当动物的肿瘤体积超过 200 mm3根据实验需求，为其安排非侵入性PET/CT或SPECT/CT检查。

3. 成像

  1. 注射器准备（定制系统）
    注意：小鼠尾巴较小，因此必须使用27G或更小规格的套管针（数字越大，针头越细）。对于雌性小鼠，仅尾部三条静脉可用于快速推注给药。从解剖结构上看，背侧尾静脉较两条侧尾静脉更靠近脊柱，为避免医源性骨刮伤，不应在此静脉注射。根据经验，使用30G套管针效果最佳，因其可进入更细的静脉。由于市售无30G导管，研究人员需自行小心制备。
    1. 根据计划的给药途径，用放射性示踪剂准备注射器。静脉注射时，确保对25 g小鼠给药体积不超过5 mL/kg体重，即最大注射体积为125 µL。
    2. 制备30G导管时，首先取任意30G针头，用金属剪刀或弯曲方式将其金属针管从塑料基座上移除。
    3. 手动将直径为0.3 mm的PE10塑料管插入已从基座上取下的针管部分。操作时需小心，避免刺破塑料管。
      注意：也可使用其他类型的塑料材料，但PE10在管壁刚性与柔韧性之间提供了最佳平衡。
  2. 静脉注射
    注意：静脉注射也可在清醒动物中进行；但若非必要，应在异氟烷镇静下进行注射，以减轻实验动物负担。
    1. 用0.9% NaCl缓冲液或任何其他所需缓冲液填充30G导管。
    2. 将小鼠放入诱导室，持续通入氧气（或医用级压缩空气）与气态异氟烷的混合气体，直至动物失去翻正反射。诱导阶段使用3.5%-5%异氟烷，氧气或空气流速为0.8 L/min。
    3. 立即将镇静后的小鼠置于加热垫（37-38 °C）上，保持俯卧初始体位，并通过鼻罩继续维持异氟烷镇静。频繁检查小鼠是否过热（如过度伸展、呼吸急促、皮肤发红）。维持麻醉时使用1.8%-2.5%异氟烷，氧气或空气流速为0.8 L/min。
    4. 在动物眼部涂抹眼用软膏，防止镇静期间角膜干燥。检查两侧尾静脉，选择最适合注射的一侧。应考虑静脉的可见度与直径。为获得最佳效果，可轻微旋转尾巴，使选定静脉接触加热垫，静置1分钟以促进静脉扩张。
    5. 将整个小鼠转为侧卧位，使选定静脉朝上。用胶带固定尾巴尖端与基部。
    6. 用惯用手持30G导管，非惯用手食指轻压选定静脉，使静脉内血液暂时受阻。在阻滞部位，静脉会扩张形成小隆起。
    7. 用惯用手将30G导管平行于尾巴方向，对准静脉上的隆起处。向前移动惯用手。大多数情况下，该技术可确保直接穿刺入静脉。
    8. 进入静脉后，可在塑料管中观察到血液回流。固定塑料管，防止注射过程中针头在静脉内移动。在塑料管自由端连接装有示踪剂的注射器，该注射器已接30G针头。
      注意：若需评估示踪剂的动态分布，以下步骤应在动物放置于PET扫描仪床并启动PET后执行。
    9. 缓慢推注示踪剂注射器内容物，时间不少于10秒。保持30G针头与30G导管系统连接的同时，仅取下示踪剂注射器，并连接装有0.9% NaCl缓冲液（或任何其他所需缓冲液）的注射器冲洗导管。在整个注射过程中持续监测呼吸，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率维持在约每秒1次。
    10. 从尾静脉移除30G导管，并使用无菌棉球压迫止血。
    11. 为测量残留放射活性，需分别测量30G导管、缓冲液注射器、空示踪剂注射器及棉球，因这些物品均含有未进入动物体内的微量示踪剂。
  3. PET/CT采集
    注意：对于68Ga标记的纳米抗体NM-02，所有动物均使用小动物PET/CT系统进行成像。
    1. PET采集
      1. 将镇静后的小鼠以俯卧位置于动物床，并固定至PET扫描仪。将异氟烷气流切换至PET扫描仪的鼻罩，维持1.5%-2.5%异氟烷在医用空气中的浓度，流速为0.8 L/min，使动物扫描期间呼吸频率保持在每分钟50至75次之间。
      2. 用医用胶带将小鼠颈部后方固定于动物床。如有必要，再次在小鼠眼部涂抹眼用软膏，防止镇静期间角膜干燥。
      3. 将动物床内加热垫开启至约80%功率，相当于约30 °C。
      4. 设置采集时间为45分钟，并选择将要扫描的感兴趣区域。选择68Ga作为研究同位素并开始扫描。输入注射活性量、注射时间及空注射器测量时间。一个PET床位长度为160 mm，足以完成全身影像扫描。
      5. 若需评估示踪剂的动态分布，应先启动PET扫描，等待30秒采集开始后，再执行步骤3.2.9–3.2.10。保持导管留在小鼠体内，并连接缓冲液注射器，以避免进一步失血。可在PET扫描结束、CT扫描开始前断开导管，以避免伪影。
    2. CT采集
      1. 将动物床从PET扫描仪断开，并立即连接至CT扫描仪。如有需要，也可从尾静脉移除套管针。静脉穿刺后至少30分钟，穿刺部位已凝血，不再出血。
      2. 将异氟烷气流切换至CT扫描仪的鼻罩。
      3. 选择与PET成像相同的感兴趣区域进行扫描。选择标准采集协议：440 µA，50 kVp，曝光时间32 ms，螺旋模式下旋转1080°，每360°采集960次；全身影像扫描的CT扫描时间约为7分钟。
      4. 控制呼吸频率，并开启动物床内的加热垫。在整个扫描过程中持续监测呼吸，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率维持在每分钟50至75次之间。

4. 成像后动物护理

  1. 扫描结束后，动物需要至少15分钟苏醒。为避免同窝动物间的攻击行为，应将动物单独饲养约15分钟，或直至其能够自主行走，然后再放回原来的饲养笼中。在此期间，使用红外灯以防止低体温。
  2. 最初应将动物置于其左侧（安全体位），以避免血流动力学休克。眼用软膏可保留在原位，动物苏醒后会自行将其清除。

5. PET/CT 重建

  1. 使用三维有序子集最大期望值算法（即OSEM-3D，30次迭代），在511 keV峰值±15%的能量窗范围内，将PET图像重建为192 × 192 × 384矩阵，体素尺寸为各向同性0.4 mm。对PET重建应用基于CT的校正（即衰减校正、散射校正、死时间校正和随机事件校正）。
  2. 若需评估示踪剂的动态分布，则采用多帧重建。例如，对于45分钟的扫描，可使用以下帧序列：4 × 30秒、3 × 1分钟、5 × 2分钟、2 × 5分钟和2 × 10分钟。
  3. 使用迭代重建算法（即ISRA）将CT标准采集协议重建为各向同性体素尺寸0.2 mm的200 × 200 × 425矩阵。使用厂商软件，通过以下公式将CT值转换为Hounsfield单位（HU）：
    Hounsfield单位公式，μt、μw、μa变量，医学影像分析方程。
    其中µw为水的线性衰减系数，µa为空气的线性衰减系数，µt为组织的线性衰减系数。
  4. PET与CT图像在重建后利用毛细管模体扫描生成的矩阵自动配准。将所有重建数据归档，并根据需要使用图像分析软件将其传输至数据库服务器。

6. 图像处理与分析

注意：配准后的 PET/CT 图像将进一步用于图像分析软件的数据库服务器中的定量分析，其中每个融合扫描均保存为一个受试者数据。

  1. 根据 CT 图像识别肿瘤，并将其选为感兴趣区域。在 CT 上手动勾画肿瘤轮廓以生成掩膜。
  2. 为实现与操作者无关的分割，在 PET 或 SPECT 图像上对新生成的肿瘤掩膜进行阈值处理。对于 PET，采用不低于 1.0 的标准摄取值（SUV）作为最小阈值；对于 SPECT，采用高于心脏或腹主动脉末端处血池平均摄取值的最小阈值。
  3. 记录新生成感兴趣体积的平均摄取值、最大摄取值、最热点连续 10 个体素的平均摄取值（即热点平均 10）以及总摄取值。
  4. 利用上述数值计算 SUV 值和靶/本底比值（TBR），用于后续统计分析。

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结果

放射性药物质量控制最重要的方面之一是采用高效液相色谱法（HPLC），因为该方法不仅能够显示药物的化学纯度和放射化学纯度（本例中为98.2%），还可通过将洗脱时间及色谱峰形与非放射性参照化合物进行比较，以确认放射性药物的身份。本例中的参照化合物是一种未标记的纳米抗体，其结构已通过质谱或核磁共振等经典技术验证为正确的化合物。这些技术无法直接应用于放射性化合物（因其质量过低，无法产生可检测信号），但通过将放射性化合物与其参照物进行比较，可以获得充分证据，证明目标化合物确实已被成功标记，并且在合成过程中未发生结构改变。请注意图1中放射性产物与参照物之间保留时间的微小差异，这是由于HPLC流路中检测顺序所致（紫外信号首先被检测，流份随后需要约0.2分钟才能到达放射性检测器，这在典型装置中是常见情况）。

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讨论

放射性合成
此处描述的放射性合成是新型68Ga标记化合物的典型方法——合成时间短，重点在于合适的pH值，并尽可能避免金属污染。为此，必须严格遵守各组分的添加顺序。首先，必须使用3 M NH4OAc将68Ga溶液的pH值调节至pH 4；否则，若pH值过低，纳米抗体可能发生降解。有关68Ga合成的一般原理此前已有报道16，因此本文不再详述。自动化合成模块仍需进一步优化以降低辐射剂量，但这需要大量工作，超出了本文所述典型临床前探索性研究的范围。此外，自动化合成难以实现当前方法所能达到的小体积产物（< 1 mL），而小体积有利于获得更高浓度的68Ga和更高的比活度。

仍需详细进行质量控制并详细记录。对此详细程度的一个例外是pH值：虽然临床合成中的pH值测量通常使用pH计非常精确地进行，但此处使用简单的pH试纸测量即可，因为静脉注射的要求允许这样做（pH值在6至8之间均可接受

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披露

FMM 是 NanoMab Technology Ltd. 和 Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH 的医学顾问。他近期获得了来自 NanoMab Technology Ltd.、西门子（Siemens）和 GE Precision Healthcare LLC 的机构资助。此外，他与 CURIUM 签有介入性研究合同。

致谢

作者感谢 Susanne Allekotte 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
活动度检测仪 ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
离心机 MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
内毒素检测仪 Endosafe nexgen-PTSCharles River-
加热块 NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
高效液相色谱系统（含放射性检测器）Knauer & Raytest-
图像分析软件 Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-
小动物PET/CT系统 β-CUBE 和 X-CUBEMolecubes NV-
TLC MiniGITA*Elysia-Raytest-
材料
直径0.3 mm的PE10管fisher scientific22-204008
30G针头B|Braun4656300
离心过滤器；截留分子量10 kDa，0.5 mLMilliporeUFC501008
色谱纸条 iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
内毒素检测 cartridge，灵敏度0.05 EU/mL Charles RiverPTS-2005
HPLC色谱柱 Biosep SEC-s2000Phenomenex-
微量离心管（1.5 mL）Eppendorf0030125150
pH试纸 0.0 - 6.0Merck KGaA109531
pH试纸 0-14Merck KGaA109535
PS-H+固相萃取 cartridgeMacherey Nagel GmbH & Co. KG731861
无菌西林瓶 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
试剂
68Ge/68Ga-发生器NRF-iThembaLABS-
乙酸铵Merck KGaA101116
柠檬酸Merck KGaA100241
盐酸Merck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
纳米抗体 NM-02Radiopharm Theranostics-
P-SCN-Bz-DOTA-GACheMatechC115
三氟乙酸Merck KGaAT6508
超纯水Merck KGaA101262

参考文献

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