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68Ga标记纳米分子的放射性合成、质量控制及小动物正电子发射断层成像

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DOI：

10.3791/67048

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2024年10月4日

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

本文内容

摘要

本文描述了一种新型放射性标记探针（即68Ga标记的纳米抗体NM-02）的放射性合成、制剂制备、质量控制，及其在异种移植模型中小动物PET/CT成像中的应用。

摘要

小型动物正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像技术在临床前癌症研究中至关重要，需要对放射性示踪剂的合成、质量控制以及体内注射方案给予细致关注。本研究提出了一套全面的工作流程，旨在提高小型动物PET实验的稳健性和可重复性。文中详细描述了在放射化学实验室中使用68Ga进行示踪剂合成的过程，并强调了每次放射性示踪剂制备过程中严格的质量控制与质量保证规程。浓度、摩尔活性、pH值和纯度等参数均被严格监测，符合适用于人体研究的标准。该方法引入了简化的注射器制备流程，以及一种定制设计的30G套管，用于对小鼠进行精确的静脉注射。在扫描过程中对动物健康状况（包括体温和心率）的监测，确保了实验全程动物的福利。PET和SPECT扫描的剂量预先确定，以在数据采集与尽量减少动物及研究人员的辐射暴露之间取得平衡。同样，CT扫描采用预设程序设置，以限制辐射暴露，这在评估治疗效果的长期研究中尤为重要。通过优化这些步骤，该工作流程旨在标准化操作程序、减少变异，并提升小型动物PET/SPECT/CT成像的质量。本资源为致力于提高分子成像领域临床前研究准确性与可靠性的研究人员提供了有价值的参考，从而推动该领域的发展。

引言

一个极为重要的研究领域是乳腺癌研究。乳腺癌仍是一种高发癌症，约占所有癌症病例的1/3rd 女性所有癌症中的。治疗方案需根据肿瘤的生物学和组织学特征以及疾病分期进行个体化制定。若肿瘤尚未转移，预后通常较好；一旦发生转移，5年生存率仅为约30%。1其他妇科恶性肿瘤也面临类似情况，例如卵巢癌就表现出 > 1期肿瘤的5年生存率为95%，而转移性4期肿瘤仅为15%2,3.

非侵入性成像技术，特别是正电子发射断层扫描（PET），正在深刻改变癌症研究，因为它能够以前所未有的方式揭示肿瘤的分子特征，例如代谢活动、受体表达以及对治疗的反应4,5,6。PET不仅能够可视化特定的代谢区域，还能对其进行定量分析，从而不仅有助于精确诊断，还可以在极短的时间内监测（新）疗法的效果。事实上，PET能够在1至3个治疗周期后即可评估治疗是否有反应，相较于传统的计算机断层扫描（CT）所观察到的形态学变化，其评估更为准确和迅速7。PET的非侵入性特点还使其适用于纵向研究。

为了充分评估新型（放射性）药物的治疗潜力，任何动物模型都需要最大程度的标准化，因此必须重视这一问题——无论是在肿瘤模型的建立过程中，还是在小动物PET成像及数据分析中。关于动物体内最佳肿瘤模型的选择（皮下接种或原位移植，使用小鼠、人源或同源性肿瘤，是否伴随常规临床护理）可能存在争议，但这超出了本出版物的目标范围。我们目前在癌症研究中采用多种模型，而本文所描述的是一种相对简单的皮下肿瘤模型。

放射化学中的质量控制对于动物安全和治疗效果至关重要。这不仅涉及放射性药物本身，还包括产品的配方。针对临床应用放射性药物的生产，已有大量法规要求8,9（详见 10中对现行法规和指南的全面概述），同时也有若干关于临床前研究用放射性药物特性的指导原则（详见11中的全面概述）。我们同时为临床和临床前应用生产放射性药物，从而可将临床级合成中所采用的高标准质量控制简化并应用于临床前研究中。

我们的研究重点是靶向诊疗，特别是针对人表皮生长因子受体2（HER2）阳性癌症。因此，我们开发新型放射性药物，用于癌症的诊断以及治疗过程中的监测。成功的诊断用放射性药物还将通过使用不同的放射性同位素被评估为治疗性化合物。这些放射性药物首先在动物模型中进行评估，在获得有希望的临床前结果后，致力于实现临床转化。本文将以一种放射性药物为例，介绍我们在质量控制与保障、小鼠静脉注射标准操作以及PET/CT扫描方面的实验方案，以提高分子影像学临床前研究的准确性和可靠性。该实验方案分为三个部分：放射化学（示踪剂合成与质量控制）、动物模型构建（皮下肿瘤模型）和影像学检测。

方案

本研究方案遵循最高标准的动物福利要求，并严格遵守亚琛大学医院的动物护理指南。我们致力于确保研究中所有动物均得到符合伦理和人道的对待，相关操作程序均经过当地动物伦理委员会审查和批准。所有动物实验均已获得德国主管机构（北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局，LANUV）的批准，符合《动物保护法》以及关于实验和其他科学用途动物保护条例的规定。

注意：本研究中使用的所有仪器、材料和试剂的完整列表见材料表。需要特别注意的是，68Ga 的操作应尽可能使用移液器进行，绝对避免接触任何金属，因为铁会显著降低标记产率。这意味着在放射性化学操作完成之前，必须避免使用针头。

1. 放射化学

  1. NM-02-DOTA-GA 的放射性标记 68Ga
    警告：本实验方案涉及放射性物质的操作与处理。研究人员必须遵守当地关于放射性物质操作的法律法规，遵循合理可行尽量低（ALARA）原则，使用铅屏蔽装置，尽量减少直接接触时间，并在放射性暴露的每一步骤中保持最大距离。实验操作过程必须使用放射性检测设备进行监测。
    1. 洗脱 68Ge/68Ga-发生器手动或自动洗脱，收集于10 mL 0.6 M HCl（1.2 GBq/10 mL）。捕获 68Ga 在 PS-H 上+ 通过将洗脱液过柱，使用色谱柱（M 型，0.8 mL）纯化。洗脱 PS-H+ SPE小柱，分步缓慢加入共1 mL的4 M NaCl，收集于微量离心管中。
    2. 弃去前0.3 mL洗脱液，将剩余的0.7 mL收集至另一微量离心管中。
    3. 取一个新的微量离心管，并按照生产商说明书所述步骤对 NM-02-DOTA-GA 进行放射性标记。
      注意：纳米抗体-螯合剂偶联物（NM-02-DOTA-GA）已根据供应商提供的方案预先制备。该偶联物可分装后于 -80 °C 数月。
    4. 使用最多将产品的 pH 值调节至约 7 5 µL 3 M NH₄Cl4OAc
  2. 质量控制
    1. 使用活度计在正确设置下测量微量离心管中浓缩样品的活度68Ga 作为同位素；1 mL 注射器，取 0.1 mL 用于几何校正）。放射化学产率（衰变校正后）应至少为 40%。
    2. 使用pH试纸（0-14）测定pH值，将足量样品滴加至pH试纸（10-15 µL).
    3. 薄层色谱法（TLC）
      1. 斑点 1 µL 在浸渍硅胶的薄层色谱条上点样放射性标记反应混合物。让点样液在空气中干燥约1分钟。使用柠檬酸作为流动相（在密闭的薄层色谱室中预先平衡至约2–3 mm高度）展开薄层色谱。当溶剂前沿迁移至色谱条顶端时，将薄层色谱条从展开室中取出。
      2. 将TLC条带置于放射性TLC扫描仪上，按照制造商的说明书进行检测。产物应出现在起始点（Rf < 0.2），而游离 68Ga³⁺ 阳离子将随溶剂前沿洗脱（Rf > 0.9).
      3. 通过放射性色谱图计算反应的放射性标记产率，将R处曲线下的积分面积（AUC）除以总积分面积。f 0.0-0.2 除以总AUC（Rf 0.0–1.0），再乘以 100。
    4. 高效液相色谱法（HPLC）
      1. 确保高效液相色谱仪（HPLC）使用正确的溶剂运行至少10分钟，以充分润洗所有管路，并调整检测参数。采用等度洗脱模式，流动相A为乙腈，流动相B为0.9% NaCl溶液（980 mL）与三氟乙酸（1 mL）及柠檬酸溶液（20 mL）的混合液，A与B的体积比为50:50。在280 nm波长下检测紫外吸收。
      2. 取 5 µL 产物并用 15 µL 0.9% NaCl。注射 15 µL 分析性放射性高效液相色谱（radio-HPLC）中的混合物5 µm SEC-s2000 154 Å 柱；流速：2 mL/min。
      3. 使用乙腈（溶剂A）与0.9% NaCl溶液（980 mL）、三氟乙酸（1 mL）和柠檬酸溶液（20 mL）混合液（溶剂B）按50:50比例等度洗脱。在280 nm处检测紫外吸收。紫外通道与γ通道之间存在轻微的保留时间偏移，这是由于高效液相色谱仪（HPLC）的设计所致（γ射线信号检测器串联安装在紫外检测器之后）。
      4. 通过积分γ通道中的峰来确定放射化学纯度。产物应位于先前通过测量非放射性标记纳米抗体所确定的积分范围内。此外，对γ通道中所有其他峰进行积分，并将其评估为杂质。纯度应为 >95%.
    5. 内毒素
      1. 制备产物的1:20稀释液，总体积为 150 µL 使用（经认证的）无内毒素水进行稀释。
      2. 插入一次性内毒素检测 cartridge（商品化预装所有必要试剂）至内毒素检测仪中并加载 25 µL 每个 cartridge 腔室中稀释后产物的量。
      3. 按压 播放. PTS 含有内部阳性和阴性对照，将被纳入最终报告。检测耗时约 15 分钟。若内毒素含量低于限值，则该产品被视为无内毒素。 < 8.7 EU/mL 在 V 时最大值 = 20 mL
    6. 回顾性无菌检测
      1. 注射并采集质量样品后，将放射性药物储存在无菌小瓶中，并置于冰箱中冷藏 4 °C.
      2. 将样本送至有资质的机构进行无菌分析（可由内部实验室或外部公司完成），若豁免限值为105 Bq 或 10 Bq/g 未被超过时，方可按照无菌试验要求进行检测12.
  3. 注射器准备（每只动物一个）
    1. 使用活度计在正确设置下测量产物的活度（68Ga 作为同位素；1 mL 注射器，取 0.1 mL 用于几何校准。
    2. 取约15 MBq的产物（约 25 µL) 置于微量离心管中，并用0.9% NaCl补足体积至 75 µL.
    3. 添加 50 µL 注射器中，并使用活度计在正确设置下进行测量（68Ga 作为同位素；1 mL 注射器，取 0.1 mL 用于几何测量。注射器中应含有 10 MBq 的产物。
      注意：一旦 68Ga标记的纳米抗体NM-02形成后，操作时不再需要塑料移液器吸头 68Ga. 从此时起，每当实验步骤中提及处理液体时，均应使用合适的注射器（1 mL）和针头（27–30G）。

2. 动物模型构建

  1. 动物饲养
    1. 使用雌性免疫缺陷型 Rj: ATHYM-Foxn1 小鼠nu/nu 6至8周龄的小鼠（来自商业供应商），用于建立皮下肿瘤模型。到达后，将所有小鼠直接饲养于动物房中，并在运输后至少给予1周时间适应环境。
    2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并提供自由摄食和饮水。保持室温及相对湿度在20-25 °C 分别为45%–65%。
  2. 细胞移植前的制备
    1. 从1 × 10⁶个细胞开始进行细胞培养6 将SKOV-3细胞接种于T175细胞培养瓶中，加入25 mL预热的含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。
    2. 将细胞置于培养箱中培养 37 °C 和5% CO2 每周至少更换两次完全培养基。
    3. 在细胞移植前1周或最迟前1天，进行 20 µL 从细胞培养瓶中收集培养基以检测支原体13仅使用无支原体污染的细胞进行细胞注射。
    4. 在细胞注射当天，吸除完全培养基，用移液管向瓶中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），来回轻轻晃动瓶子数次，以洗去残留的培养基。
    5. 向培养瓶中加入 3 mL 胰蛋白酶，在培养箱中孵育 4 min 37 °C 和5% CO2 用以解离细胞。在显微镜下以40倍放大观察细胞是否已从细胞培养瓶上脱落。
    6. 加入7 mL培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
    7. 以 150 x g 离心细胞 g 离心5分钟（室温）以获得细胞沉淀。弃去上清液，加入1 mL培养基重悬细胞。
    8. 取 12 µL 将细胞悬液加入微量离心管中，加入等体积的台盼蓝。用细胞计数板进行加样。 10 µL 仔细混匀的细胞悬液。
    9. 计数指定区域内的未染色活细胞并计算细胞数量。将细胞浓度调整至 5 x 107 细胞/mL 培养基，并将细胞悬液与 1 mL 基底膜基质轻轻混匀。
    10. 取 5 x 106 每只小鼠使用1 mL胰岛素注射器，将细胞悬浮于0.2 mL细胞培养基与50%基底膜基质的混合液中。注射前将注射器置于冰上，以防止基底膜基质凝固。
      注意：如果小鼠体重小于20 g，则仅注射 150 µL （适用于15-20克）或 100 µL （用于10-15克体重）的混合物。皮下给药时，需注意确保给药体积不超过GV-SOLAS推荐的最大剂量，即10 mL/kg体重。14.
  3. 接种与随访
    1. 用一只手固定动物的颈部和尾部，将细胞悬液皮下注射到清醒动物的侧腹部。通常，我们更倾向于注射在左侧腹部。
    2. 等待基底膜基质硬化10−15秒，然后移除针头。
    3. 植入后每天使用数显卡尺测量肿瘤两个相互垂直的直径，以监测肿瘤生长情况。
    4. 根据这些测量结果，利用以下公式计算肿瘤体积来评估肿瘤生长情况：
      VT = L × B2 × π / 6
      其中 VT 肿瘤体积，单位为 mm³3, L 肿瘤的长度（单位为 mm，即两个垂直轴中较长者），以及 B 肿瘤的宽度（单位：mm），即两个垂直轴中较小者15）。该技术往往会高估肿瘤体积，因为它同时包含了皮肤组织。
    5. 肿瘤质量会影响小鼠在电子天平上测得的体重。为计算经肿瘤质量校正后的动物体重，请使用以下公式：
      m小鼠-T = m小鼠 - 0.82 × VT
      其中 m小鼠-T 是小鼠体重（不包括肿瘤质量），单位为 g， m小鼠 小鼠体重根据电子天平测量，单位为 g，且 VT 以 mm³ 计的计算肿瘤体积30.82 g/mm3 根据先前动物实验中分离的一系列肿瘤的平均值，称重并使用给定公式测定其体积，计算得出平均肿瘤密度。
    6. 此外，确定肿瘤相对于小鼠的大小，并使用以下公式监测肿瘤负荷：
      肿瘤负荷 [%] = (0.82 × VT) / m小鼠 × 100
      ​其中肿瘤负荷以百分比表示，为0.82 × VT 对应肿瘤质量（单位：g）即, VT，以 mm³ 计算的肿瘤体积3，倍数的平均肿瘤密度），以及 m小鼠 小鼠体重（根据天平读数，单位为 g）。
    7. 当动物的肿瘤体积超过 200 mm3根据实验需求，为其安排非侵入性PET/CT或SPECT/CT检查。

3. 成像

  1. 注射器准备（自制系统）
    注意：小鼠尾巴较细，因此必须使用27G或更小规格的套管针（数字越大，针头越细）。对于雌性小鼠，仅可接触三条尾静脉用于快速推注给药。从解剖结构上看，背侧尾静脉较两条侧尾静脉更靠近脊柱，应避免在此静脉注射，以防医源性骨损伤。根据经验，使用30G套管针效果最佳，因其可进入更细的静脉。由于市售无30G导管，研究人员需自行小心制备。
    1. 根据计划的给药途径，用放射性示踪剂准备注射器。静脉注射时，确保给25 g小鼠注射的体积不超过5 mL/kg体重，即最大注射量为125 µL。
    2. 制备30G导管时，首先取任意30G针头，用金属剪刀或弯曲方式将金属针管从塑料针座上移除。
    3. 手动将直径为0.3 mm的PE10塑料管插入已从针座上取下的针管部分。操作时需小心，避免刺破塑料管。
      注意：也可使用其他类型的塑料材料，但PE10在管壁刚性与柔韧性之间提供了最佳平衡。
  2. 静脉注射
    注意：静脉注射也可在清醒动物中进行；但若无特殊要求，应在异氟烷镇静下进行注射，以减轻实验动物的负担。
    1. 用0.9% NaCl缓冲液或任何其他所需缓冲液填充30G导管。
    2. 将小鼠放入诱导室，持续通入氧气（或医用级压缩空气）与气态异氟烷的混合气体，直至动物失去翻正反射。诱导阶段使用3.5%-5%异氟烷，氧气或空气流速为0.8 L/min。
    3. 立即将镇静后的小鼠置于加热垫（37-38 °C）上，保持俯卧初始体位，同时通过鼻罩继续维持异氟烷镇静。频繁检查小鼠是否过热（如过度伸展、呼吸急促、皮肤发红）。维持麻醉时使用1.8%-2.5%异氟烷，氧气或空气流速为0.8 L/min。
    4. 在动物眼部涂抹眼用软膏，防止镇静期间角膜干燥。检查两侧尾静脉，选择最适合注射的一侧。需综合考虑静脉的可见度和直径。为获得最佳效果，可轻微旋转尾巴，使选定静脉接触加热垫，并等待1分钟以促进静脉扩张。
    5. 将整个小鼠翻转至侧卧位，使选定静脉朝上。用胶带固定尾巴的尖端和基部。
    6. 用优势手持30G导管，非优势手的食指轻压选定静脉，使静脉内血液积聚。在积血部位，静脉会扩张形成一个小隆起。
    7. 用优势手持30G导管，平行于尾巴方向，对准静脉上的隆起处。向前推动优势手。大多数情况下，该技术可确保直接穿刺入静脉。
    8. 一旦进入静脉，可在塑料管中观察到血液回流。固定塑料管，确保注射过程中针头不会在静脉内移动。在管子的自由端，连接装有示踪剂的注射器和30G针头。
      注意：当需要评估示踪剂的动态分布时，应在动物放置于PET扫描仪床并启动PET扫描后，再执行后续步骤。
    9. 缓慢推注示踪剂注射器内容物，时间不少于10秒。保持30G针头与30G导管系统连接的同时，仅取下示踪剂注射器，并连接装有0.9% NaCl缓冲液（或任何其他所需缓冲液）的注射器，以冲洗导管。在整个注射过程中持续监测呼吸，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率维持在约每秒1次。
    10. 从尾静脉中取出30G导管，并使用无菌棉球压迫止血。
    11. 为测量残留放射活性，需分别测量30G导管、缓冲液注射器、空示踪剂注射器及棉球，因这些物品均含有未进入动物体内的少量示踪剂。
  3. PET/CT采集
    注意：对于68Ga标记的纳米抗体NM-02，所有动物均使用小动物PET/CT系统进行成像。
    1. PET采集
      1. 将镇静后的小鼠以俯卧位置于动物床，并连接至PET扫描仪。将异氟烷气流切换至PET扫描仪的鼻罩，维持1.5%-2.5%异氟烷在医用空气中的浓度，流速为0.8 L/min，使动物在扫描期间的呼吸频率保持在每分钟50至75次之间。
      2. 用医用胶带将小鼠颈部后方固定于动物床上。如有必要，再次在小鼠眼部涂抹眼用软膏，防止镇静期间角膜干燥。
      3. 将动物床内的加热垫开启至约80%功率，相当于约30 °C。
      4. 设置采集时间为45分钟，并选择将要扫描的感兴趣区域。选择68Ga作为研究同位素并开始扫描。输入注射的放射活性量、注射时间以及空注射器测量时间。一个PET床位置为160 mm，足以完成整只小鼠的全身扫描。
      5. 当需要评估示踪剂的动态分布时，应先启动PET扫描，等待30秒采集开始后，再执行步骤3.2.9–3.2.10。保持导管留在小鼠体内，并连接缓冲液注射器，以避免进一步失血。可在PET扫描结束后、CT扫描前断开导管，以避免伪影。
    2. CT采集
      1. 将动物床从PET扫描仪断开，并立即连接至CT扫描仪。如有需要，也可将导管从尾静脉分离。静脉穿刺后至少30分钟，穿刺部位已凝血，不会再出血。
      2. 将异氟烷气流切换至CT扫描仪的鼻罩。
      3. 选择与PET成像相同的感兴趣区域进行扫描。选择标准采集协议：440 µA，50 kVp，曝光时间32 ms，螺旋模式下旋转1080°，每360°采集960次；整只小鼠全身扫描的CT扫描持续时间约为7分钟。
      4. 控制呼吸频率，并开启动物床内的加热垫。在整个扫描过程中持续监测呼吸，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率维持在每分钟50至75次之间。

4. 成像后动物护理

  1. 扫描结束后，动物需要至少15分钟苏醒。为避免同窝动物间的攻击行为，在将其放回原始饲养笼之前，应单独饲养约15分钟，或直至其能够自主行走。在此期间，使用红外灯以防止低体温。
  2. 最初应将动物置于其左侧（安全体位），以避免血流动力学休克。眼膏可保留，动物苏醒后会自行将其清除。

5. PET/CT 重建

  1. 使用三维有序子集最大期望值重建法（即OSEM-3D，30次迭代），在511 keV峰值处设置±15%的能量窗，将PET图像重建为192 × 192 × 384矩阵中的各向同性体素，体素尺寸为0.4 mm。对PET重建应用基于CT的校正（即衰减校正、散射校正、死时间校正和随机事件校正）。
  2. 若需评估示踪剂的动态分布，则采用多帧重建。例如，对于45分钟的扫描，可使用以下帧序列：4 × 30秒、3 × 1分钟、5 × 2分钟、2 × 5分钟和2 × 10分钟。
  3. 使用迭代重建算法（即ISRA）将CT标准采集协议重建为200 × 200 × 425矩阵中的各向同性体素，体素尺寸为0.2 mm。使用厂商软件，通过以下公式将CT值转换为Hounsfield单位（HU）：
    figure-protocol-1
    其中µw为水的线性衰减系数，µa为空气的线性衰减系数，µt为组织的线性衰减系数。
  4. PET与CT图像在重建后使用毛细管模体扫描生成的矩阵自动配准。将所有重建数据归档，并根据需要通过图像分析软件传输至数据库服务器。

6. 图像处理与分析

注意：配准后的 PET/CT 图像将进一步用于图像分析软件数据库服务器内的定量分析，其中每个融合扫描均保存为一个受试者数据。

  1. 根据 CT 图像识别肿瘤，并将其选为感兴趣区域。在 CT 上手动勾画肿瘤轮廓。
  2. 为实现用户无关的分割，在 PET 或 SPECT 上对新生成的肿瘤掩膜进行阈值处理。对于 PET，采用不低于 1.0 的标准摄取值（SUV）作为最小阈值；对于 SPECT，采用高于心脏或腹主动脉末端血池平均摄取值的最小阈值。
  3. 记录新生成感兴趣体积的平均值、最大值、最热的 10 个体素的平均值（即 热区平均 10）以及总摄取量。
  4. 利用这些数值计算 SUV 和靶区与背景比值（TBR），用于后续统计分析。

结果

放射性药物质量控制最重要的方面之一是高效液相色谱法（HPLC），因为该方法不仅能够显示化学纯度和放射化学纯度（本例中为98.2%），还可以通过将洗脱时间及峰形与非放射性参照化合物进行比较，来确认放射性药物的身份。该参照化合物在此例中为一种未标记的纳米抗体，其正确性已通过质谱或核磁共振等经典技术得到验证。这些技术无法直接应用于放射性化合物（因其质量过低而无法产生信号），但通过将放射性化合物与其参照物进行比较，可以获得充分证据，证明正确的化合物已被成功标记，并且在合成过程中未发生改变。请注意图1中放射性产物与参照物之间保留时间的微小差异，这对应于HPLC流路的连续测量过程（紫外信号首先被检测；随后流份需要大约0.2分钟才能到达放射性检测器，这是典型装置中的情况）。

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图 1：68Ga标记的纳米抗体NM-02（GLNM-02）质量控制的典型分析型高效液相色谱图。 冷化合物在280 nm处的紫外吸收（即上图）显示在4.18 min处出现一个峰，偏移0.22 min。在伽马检测器（即下图）中可观察到68Ga标记产物的峰。放射化学产率为98.2%。mAU = 毫光吸收单位，NM-02 = 我们的产品，UV = 紫外光通道，nm = 纳米，min = 分钟，CPS = 每秒计数，GLMN-02 = 68Ga标记的纳米抗体NM-02，68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA，γ ChA = 伽马通道。 请点击此处查看该图的放大版本。

在缺乏高效液相色谱法（HPLC）或作为其补充的情况下，薄层色谱法（TLC）可用于测定最终产物的标记率和纯度（但不能用于确定其身份，且详细程度不及HPLC）。由于操作简便，TLC在放射性合成路径尚处于优化阶段时尤为适用。图2展示了68Ga标记纳米抗体NM-02的薄层色谱图（表观放射化学纯度为99.9%）。

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图 2：用于 68Ga 标记纳米抗体 NM-02（GLNM-02）质量控制的典型分析型薄层色谱图。 图中显示了计数面积随溶剂（柠檬酸盐）在薄层板上迁移距离的变化。Rf 值为 0.2，放射化学纯度为 99.9%。C = 计数，mm = 毫米，GLNM-02 = 68Ga 标记纳米抗体 NM-02，TLC = 薄层色谱法。请点击此处查看该图的放大版本。

在准备用于发表的影像数据时，通常需要展示至少一幅独立的CT和PET图像。这种方法能够全面评估示踪剂在体内的分布情况。标准的CT灰度范围为-1000 HU至1000 HU，可在单一窗宽下清晰显示所有软组织。如图3A所示，该方法不仅能清晰界定小鼠肾脏，还可同时用于骨骼评估。

对于PET图像标尺，将下限阈值设为SUV 0.0，同时保持上限阈值不低于1.0（图3B），建议在计算SUV时采用基于体重的归一化方法（即SUVbw）。此外，在定量分析中，优先使用SUVmean而非SUVmax；若使用SUVmax，则应取SUVbw计算中最热的10个体素的平均值，而非单个体素的最大值。通过融合CT和PET层面图像，生成PET/CT的特征融合图像（图3C）。

为了进一步帮助读者独立评估全身示踪剂的生物分布，可使用与PET切片相同的标度来展示同一PET扫描的最大强度投影（图3D）。

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图3: 在体 皮下荷SKOV-3肿瘤小鼠的PET/CT图像。 图像在静脉注射 5 MBq 后 3 小时采集 68Ga标记的纳米抗体NM-02（GLNM-02）。ACT 图像的灰度范围被设定在 -1000 HU 至 1000 HU 之间，而（B) PET 图像的SUV值范围为0.0至5.0。CPET/CT 融合图像采用相同的标度。D最大强度投影（MIP）PET图像也使用0.0和5.0的SUV进行标度。所有PET图像均显示GLNM-02在肿瘤中有良好的摄取，且肾脏清除清晰可见。CT = 计算机断层扫描，PET = 正电子发射断层扫描，MIP = 最大强度投影，HU = Hounsfield单位，SUV = 标准化摄取值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

对于68Ga标记的纳米抗体NM-02这一特定情况，可在小鼠左侧 flank 观察到明显的肿瘤摄取。此外，示踪剂的肾清除也清晰可见。通过展示PET最大强度投影，膀胱内的放射性信号亦可被观察到，进一步证实了示踪剂经肾脏清除的途径。在此特定情况下，需特别指出的是，肾脏、肿瘤和膀胱无法在同一个二维切片中同时显示。在发表的研究中包含最大强度投影图像，可于同一幅图像中全面呈现示踪剂的体内分布情况。

讨论

放射性合成
此处描述的放射性合成是新型68Ga标记化合物的典型方法——合成时间短，重点在于合适的pH值，并尽可能避免金属污染。为此，必须严格遵守各组分的添加顺序。首先，必须使用3 M NH4OAc将68Ga溶液的pH值调节至pH 4；否则，若pH值过低，纳米抗体可能发生降解。有关68Ga合成的一般原理此前已有报道16，因此本文不再详述。自动化合成模块仍需进一步优化以降低辐射剂量，但这需要大量工作，超出了本文所述典型临床前探索性研究的范围。此外，自动化合成难以实现当前方法所能达到的小体积产物（< 1 mL），而小体积有利于获得更高浓度的68Ga和更高的比活度。

仍需详细进行质量控制并详细记录。对此详细程度的一个例外是pH值：虽然临床合成中的pH值测量通常使用pH计非常精确地进行，但此处使用简单的pH试纸测量即可，因为静脉注射的要求允许这样做（pH值在6至8之间均可接受14）。这种简单的方法可降低费用，并减少设备被放射性物质污染的风险。

动物模型的制剂
示踪剂的最终制剂是示踪剂一个至关重要的方面，但在临床前研究中这一方面往往描述得不够充分。尽管对于用于人体试验的药物（包括放射性药物）已有明确的法规要求，但在临床前阶段，仅有若干指南17,18，且这些指南并未具体讨论溶剂或制剂形式。这些指南常被用于起草或评估需经（动物）伦理委员会批准的法定实验方案（在德国为：LANUV19），但这些文件对制剂重要性的强调仍显不足。不良的制剂可能导致错误的（阴性）结果，但考虑到目前仍然存在的发表偏倚问题，尤其是在肿瘤学领域20，这一观点难以得到验证。

除了遵循ARRIVE指南外，我们还尽可能参照适用于人体的法规，因为适用于人体的制剂通常也适用于啮齿类动物。主要区别在于受试对象的体型，因此可安全注射的体积也不同。为此，我们尽可能采用分子量截断（MWCO）滤器来纯化化合物，因为这类滤器已被证明对纯化大分子化合物有效21。该方法可使典型的68Ga标记示踪剂最终溶解于合适溶液中，并达到适用于小鼠的较小体积（通常最大静脉注射体积为100 - 150 µL）。

在德国，GV-SOLAS（Gesellschaft für Versuchstierkunde，英文：实验动物协会）在动物保护与科研之间发挥着桥梁作用，使人类和动物均从中受益。因此，该协会针对动物实验的多个方面制定了建议，特别是在肿瘤学和麻醉领域，以在全国范围内标准化动物护理14。此后，大多数主管机构和国家伦理委员会均要求动物实验方案必须遵守这些建议。GV-SOLAS 对大多数给药途径的最大容积提出了建议：静脉注射推荐的最大剂量为每公斤体重5 mL；对于一只25 g的小鼠，相当于150 µL。因此，所有放射性示踪剂的制备均以每只动物最大注射体积150 µL为标准。静脉注射时若超过此阈值，会因血容量过多而增加急性心功能不全的风险。反复静脉注射超过该阈值，则会增加肺纤维化的风险，因为每次注射根据流速不同，均可能引起轻微的肺水肿。本文所述小鼠静脉注射剂量换算成人体等效剂量，相当于在10秒内以推注方式向一名75 kg的成年人静脉注射总计375 mL液体。在标准临床护理中，500 mL的0.9% NaCl溶液通常在1小时内输注完毕；这意味着为避免任何并发症，375 mL应于45分钟内输注完成。

GV-SOLAS 建议，肿瘤负荷不应超过 5%；如果动物正在接受治疗，负荷可延长至 10%22。 治疗组与未治疗组之间的这一差异可能导致研究偏倚，尤其是在生存分析中，接受治疗的荷瘤小鼠可能达到比对照组更高的肿瘤负荷。为避免此类情况，可将治疗组动物的肿瘤负荷也固定为 5%；然而，这可能导致在动物尚未达到所谓人道终点前就实施安乐死的伦理困境；或者（更优方案）应论证将对照组的上限提高至 10% 在伦理上是合理的，以避免产生偏倚。

由于需要以非侵入性方式每天计算肿瘤负荷，我们应用一个校正因子（即0.82），将每日计算的肿瘤体积转换为肿瘤重量。该因子是通过在动物按照实验方案处死前使用数显卡尺测量肿瘤直径，随后用天平测量实际肿瘤重量而计算得出的。此校正因子不同于肿瘤组织的密度，因为所测量的肿瘤体积还包括皮肤部分。因此，该因子可能<1.0，因为所测得的肿瘤体积大于实际肿瘤体积。由于我们称重的肿瘤相对较大（测量是在实验最后一天进行的），该因子确实会高估小肿瘤的重量。此因子仅可用于肿瘤负荷的评估。

GV-SOLAS 建议的另一个方面是，对于小鼠，将固定的肿瘤直径 15 mm 设为仁慈终点17。通常情况下，如果在含有肿瘤细胞的溶液注射后未注入空气或栓塞物，肿瘤倾向于沿皮下注射所形成的针道快速生长。因此，某些给药途径会更快达到 15 mm 的标准。鉴于经验表明，部分肿瘤呈椭圆形生长，我们采用并使用了上述肿瘤体积计算公式，以在不同给药途径之间进行无偏倚的比较。

我们所使用的动物模型遵循ARRIVE17和PREPARE18指南设计，便于实验的重复。由于不同小鼠之间的肿瘤生长速率 存在差异，该模型在一定程度上具有变异性，使得标准化和结果解读更为困难。然而，这些变异反映了癌症患者中存在的肿瘤内和肿瘤间异质性23。

该方案并非没有局限性。动物在注射过程中必须保持镇静，尤其是在进行PET/CT扫描时。镇静（特别是使用异氟烷）会影响血流，且动物可能出现低体温，因此需要使用加热垫并监测镇静深度 。这一问题可通过扫描清醒动物来避免；然而，这需要专门的内部软件和专业技术，而这些条件通常难以具备。

另一个局限性是辐射剂量。尽管单次扫描时动物所接受的剂量可忽略不计，但进行多次扫描（尤其是超过10次）可能导致累积剂量显著增加，从而可能影响肿瘤生长。当肿瘤生长作为观测指标时，必须确保所有动物接受相同次数的扫描和相同的辐射剂量，以保证组间可比性，这会增加整个项目的负担。使用PET/MRI系统替代PET/CT系统可减少辐射暴露。然而，这种方法需要更长的扫描时间，增加成本，并且获取解剖信息的方式也有所不同。

通过遵循德国GV-SOLAS等福利组织的建议，并依据ARRIVE和PREPARE等既定指南，我们致力于标准化动物模型并尽量减少实验方案中的变异性。这些努力对于确保临床前研究的可靠性和可重复性至关重要，最终有助于将有前景的放射性药物从实验室顺利转化至临床应用。

披露

FMM 是 NanoMab Technology Ltd. 和 Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH 的医学顾问。他近期获得了来自 NanoMab Technology Ltd.、西门子（Siemens）和 GE Precision Healthcare LLC 的机构资助。此外，他与 CURIUM 签有介入性研究合同。

致谢

作者感谢 Susanne Allekotte 提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
活动度检测仪 ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
离心机 MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
内毒素检测仪 Endosafe nexgen-PTSCharles River-
加热块 NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
高效液相色谱系统（含放射性检测器）Knauer & Raytest-
图像分析软件 Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-
小动物PET/CT系统 β-CUBE 和 X-CUBEMolecubes NV-
TLC MiniGITA*Elysia-Raytest-
材料
直径0.3 mm的PE10管fisher scientific22-204008
30G针头B|Braun4656300
离心过滤器；截留分子量10 kDa，0.5 mLMilliporeUFC501008
色谱纸条 iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
内毒素检测 cartridge，灵敏度0.05 EU/mL Charles RiverPTS-2005
HPLC色谱柱 Biosep SEC-s2000Phenomenex-
微量离心管（1.5 mL）Eppendorf0030125150
pH试纸 0.0 - 6.0Merck KGaA109531
pH试纸 0-14Merck KGaA109535
PS-H+固相萃取 cartridgeMacherey Nagel GmbH & Co. KG731861
无菌西林瓶 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
试剂
68Ge/68Ga-发生器NRF-iThembaLABS-
乙酸铵Merck KGaA101116
柠檬酸Merck KGaA100241
盐酸Merck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
纳米抗体 NM-02Radiopharm Theranostics-
P-SCN-Bz-DOTA-GACheMatechC115
三氟乙酸Merck KGaAT6508
超纯水Merck KGaA101262

参考文献

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PET 68Ga HPLC PET CT

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