本方案描述了用于“选择/不选择”嗅觉行为实验的嗅觉仪的构建方法。提供了分步操作说明及相应图片,以确保嗅觉仪的成功搭建。同时包含了在构建过程中可能遇到问题的故障排除信息。
本方案描述了用于“选择/不选择”嗅觉行为实验的嗅觉仪的构建方法。提供了分步操作说明及相应图片,以确保嗅觉仪的成功搭建。同时包含了在构建过程中可能遇到问题的故障排除信息。
利用嗅觉仪研究啮齿类动物在嗅觉任务中的行为和脑活动,对于理解脑回路至关重要。这些精密设备使研究人员能够精确控制和递送气味刺激,从而探究啮齿类动物复杂的嗅觉过程。尽管市面上的嗅觉仪使用方便,但在出现技术问题时往往面临挑战,通常需要支付高昂费用来获得技术支持,还可能中断研究进程。本文详细介绍了专为小鼠嗅觉行为实验设计的定制化嗅觉仪的构建方法,提供了完整的零件清单和分步操作指南。该嗅觉仪通过MATLAB进行控制,为研究人员提供了友好的操作界面。更重要的是,其开源代码允许用户对系统进行修改和调整,以定制行为学任务来满足特定的实验需求。构建定制化的嗅觉仪使用户能够掌握相关知识与能力,独立完成实验设计和故障排查,节省时间和资源。这种方法不仅提高了研究的灵活性,还有助于深入理解设备的功能,最终实现对啮齿类动物更可靠、更稳健的嗅觉研究。
嗅觉决策背后的复杂机制为理解大脑感觉处理系统的惊人复杂性提供了引人入胜的见解1,2,3。在小鼠的嗅球中,大量嗅觉感觉神经元汇聚到约2,200个肾小球上,每个肾小球均由表达相同嗅觉受体的神经元所支配4。值得注意的是,即使是单一合成气味分子,也能激活小鼠约1,100种嗅觉受体中的相当大一部分5,6。然而,挑战并不仅限于初始的气味分子检测。气味分子到达的时间动态特性受到节律性嗅闻行为的影响,进一步丰富了感觉环境,为大脑解码增添了额外的信息层次。再加上自然刺激(例如同种动物尿液)本身的复杂性——其中含有数百种气味分子——嗅觉系统面临着艰巨的任务:必须解析复杂的肾小球激活模式,以区分不同的气味7,8。
为应对这一挑战,大脑会协调多个脑区的神经活动,包括梨状皮层、外侧内嗅皮层、海马、嗅结节、前额叶皮层,甚至小脑9,10,11,12,13,14。在这些神经回路中,梨状皮层的锥体细胞整合并调节由僧帽细胞传递的信息,而其他脑区则在塑造嗅觉感知过程中发挥各自独特的作用15,16,17。此外,大脑对嗅觉刺激的处理受到情境因素的动态影响,凸显了嗅觉决策过程的适应性与复杂性。
本文描述了一种定制嗅觉仪的构建方法,该仪器可实现对自由活动小鼠在“go/no-go”任务中行为表现的计算机控制评估。实验前,小鼠需进行为期2天的饮水限制,之后每日供水量控制在1.5–2 mL。为确保小鼠未发生脱水,应保证其体重不低于训练前体重的85%。若能妥善控制脱水状况,该操作对小鼠无不良影响18。在此关联学习任务中,口渴的小鼠通过舔舐位于气味输送鼻锥内的出水口来启动一次试验。在动物启动试验后1–1.5秒内,系统会输送两种气味中的一种。若呈现的是有奖励的(S+)气味,小鼠需在连续四个0.5秒的时间窗口中每个窗口至少舔舐一次,方可获得水奖励(称为“命中”,Hit);否则无法获得奖励(称为“漏报”,Miss)。若呈现的是无奖励的(S−)气味,则不给予水奖励;若小鼠在四个时间窗口中均进行了舔舐(称为“虚报”,False Alarm, FA),则在下一次试验开始前施加一段延迟时间。若动物在任一时间窗口中未发生舔舐,则该次试验记为“正确拒绝”(Correct Rejection, CR),且不施加延迟时间。正确表现的百分比定义为:在连续二十次试验中,小鼠获得“命中”或“正确拒绝”的试验所占的百分比:
正确率 = 100 ×((命中 + 正确拒绝)/ 20)
为确保用于评估“走/不走”嗅觉行为的嗅觉仪正常工作,需解决两个关键问题。首先,嗅觉仪必须实时监测小鼠的反应,以相应地递送气味刺激和水奖励。本嗅觉仪通过测量饮水管与实验舱底板之间的电阻,或通过检测电容变化来监测舔舐行为19。随后,MATLAB 程序利用该信息决定气味递送和水奖励的时机。第二个问题是需要实现可靠且可重复的气味递送。本嗅觉仪通过控制阀门,使饱和气味的空气与载气混合,随后将混合气体输送至鼻罩。气味物质通过将气流鼓泡通入矿物油稀释的气味溶液中实现平衡。气味浓度可使用光离子化检测器进行测量,并可根据蒸气压和活度系数进行计算,具体方法遵循 Williams 和 Dewan 所述的流程19,20。
所有实验均按照科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。本研究使用的动物为雄性CaMKIIα WT小鼠,在植入螺旋电极时年龄为两个月。螺旋电极的植入操作参照Villanueva等21所述方法进行。手术后至少等待一周,再开始进行限水处理。本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 单刀单掷(SPST)瞬动按钮开关的电路板安装与焊接
2. 电源供应
3. 舔舐传感器板
4. 空气和水供应
5. 将嗅觉仪连接至计算机并安装软件
6. 动物实验
按照本文所述方案,可搭建一个用于测试小鼠在不同气味间进行“趋向/不趋向”行为的嗅觉仪。图6A展示了小鼠在“趋向/不趋向”任务训练第一天的行为表现,其中乙酸乙酯作为S+气味剂,乙酸乙酯与乙酸丙酯的混合物作为S-气味剂。正确率计算方式为小鼠获得“命中”或“正确拒绝”的试验次数所占的百分比。最初,小鼠的正确率为50%,因为它对两种气味均产生舔舐反应。然而,经过数次试验后,小鼠学会仅对S+气味舔舐,而对S-气味停止舔舐。图6B显示了“趋向/不趋向”任务正向阶段最后一天的正确率,此时动物表现达到熟练水平,正确率在80%或以上。此时,气味剂角色被反转(REV),乙酸乙酯变为S-气味剂,乙酸乙酯与乙酸丙酯的混合物变为S+气味剂。图6C显示了反向“趋向/不趋向”任务第一天的正确率,此时小鼠的表现下降至10%。F显示了反转任务最后一天小鼠的表现,此时其再次达到熟练水平。

图 1:嗅觉仪正面白板及布线示意图。(A)嗅觉仪尺寸为 22 英寸(宽)× 16 英寸(高)× 8.5 英寸(深),图中未显示布线或接口/舔管电路板,为机械加工车间交付时的初始状态。仪器上已预钻孔,用于安装气味阀门、温度计、水阀和终末阀门、水注射器、气味瓶架、气味阀架以及小鼠实验腔。(B)嗅觉仪已准备就绪,配备 8 个螺栓,用于将 SSR48-RACK 安装在左后侧。(C)已安装 SSR48-RACK 的嗅觉仪,包含连接的继电器。(D)在嗅觉仪上加装了螺丝端子条块,分别标定用于 12 V、5 V 和接地。(E)控制黑盒上钻有孔,用于安装单刀单掷(SPST)瞬动按钮开关,并用胶带按阀门控制功能对每个按钮进行标记。(F)单刀单掷瞬动按钮开关,其两根导线已用热缩管包裹并焊牢,导线按颜色编码,以保护裸露部分。(G)单刀单掷瞬动按钮开关已安装至控制黑盒,并用配套的六角螺母固定。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2:气味阀及示意图。(A)气味阀牢固安装在槽位中,并用螺丝固定。(B)气味阀与SSR48-RACK及螺钉接线端子条块的接线示意图。(C)控制黑盒、电源、SSR48-RACK和螺钉接线端子条块的接线示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

图3:供水与最终阀门安装及电源连接示意图。(A)将供水阀和最终阀门安装至嗅觉仪指定插槽,并用螺丝固定。(B)连接电源线以供电给嗅觉仪。(C)SSR48-RACK的电源布线。(D)舔舐传感器及其连接元件,包括电阻、导线、LED和运算放大器。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4:带流量计和管路的空气供应系统。(A)通过螺丝固定在机架上的流量计。(B)连接到管路的水族泵,并通过T型接头连接。(C)输出端连接管路的活性炭过滤器,以及连接至各个调压阀的接口。(D)从调压阀引出的管路连接至流量计输入端。(E)连接至流量计输出端的管路。(F)从歧管引出至最终阀门输入端的管路。(G)最终阀门,其连接的管路通向嗅觉仪的气味入口。(H)装有水的5 mL注射器,管路连接至18 G针头。(I)连接至水阀输入端的管路。请点击此处查看该图的放大版本。

图5:水阀最终连接及系统概览。(A)从水阀输出端到嗅觉仪中饮水装置的管路。(B)使用母对母电缆将嗅觉仪连接至DIO96H/50。请点击此处查看此图的放大版本。

图6:小鼠在“执行/不执行”任务中的行为表现示例。 每个实验阶段的正确反应百分比如下所示:(A)正向条件训练的第一天(S+:1% 乙酸异戊酯,S−:矿物油)。(B)正向条件训练的最后一天。(C)反转训练后的第一天(S+:矿物油,S−:1% 乙酸异戊酯)。(D)反转条件训练的最后一天。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7:气味出口中乙酸异戊酯的浓度随时间变化过程。 使用光离子化检测器(PID)测量气味出口中10%乙酸异戊酯(溶于矿物油)的浓度。垂直线表示气味递送的开始和结束时间。请点击此处查看该图的放大版本。
有关构建用于气味关联任务的嗅觉仪的全面分步指南可在文献中找到。研究人员在设备组装和操作过程中可能会遇到各种挑战,但幸运的是,已有成熟的故障排除方法来解决这些问题。一旦嗅觉仪被正确构建并完成校准,它便成为进行嗅觉相关实验的科学家们不可或缺的工具,能够精确控制和递送气味刺激。
关键步骤
应下载 MATLAB 2015 版本,因为所编写的代码与此版本兼容,使用其他版本可能导致问题。必须在 InstaCal 中确认选择了正确的板卡。以 MATLAB 管理员身份登录后,执行 daqregister('mcc') 即可完成 mcc.daq 驱动的安装。
故障排除
在每周训练开始时,运行校准软件(InstaCal),以确保计算机与嗅觉仪正确连接。打开该程序,点击板卡,然后点击数字校准。需要检查气流速率。背景气流应为 2 L/min,通往气味平衡小瓶的气流应为 50 mL/min。必须定期检查嗅觉仪出口处的气流速率。
在放置小鼠之前,必须确保测试以下参数:(1)气味阀门:按下黑盒上的按钮时,气味阀门应发出咔哒声。气管应向矿物油中产生气泡,且管路中不应有矿物油残留。(2)气味管路:如果气味未产生气泡,可能是管路在靠近阀门处受压堵塞。可能需要更换管路。(3)最终阀门和水阀:最终阀门应能正确打开,并检查管路是否功能正常。对于水阀,应清除阻碍水流的空气,使水能够流入饮水阀。(4)气流:流量计应显示已校准,并正确放置。(5)继电器指示灯:确保实验过程中继电器上的“指示灯”能正确激活。(6)水奖励继电器:当发放水奖励时,位于水阀上方的继电器应在发放奖励时闪烁。(7)气味与水奖励继电器:当气味与水奖励配对时,对应阀门编号上方的红色继电器应在奖励期间闪烁红光。
局限性
go/no-go 任务用于检测小鼠区分两种气味的能力。为完成该任务,动物需经历多个训练阶段。因此,该方法并非高通量的气味辨别检测技术。该嗅觉仪专为测试嗅觉刺激而设计,不具备多感官测试功能。然而,可通过改造用于测试其他感官输入。
本文描述了一种液体稀释式嗅觉仪,其中以50 mL/min的流速通过矿物油中稀释的气味物质的气流,与2 L/min的背景气流预先平衡。在此气味递送设计中,气味物质在载气气流中的稀释动力学决定了背景气流中气味浓度上升的速度。如图7所示,虽然浓度在200 ms内上升至最终浓度的一半,但在半秒之后浓度变化速率显著减慢。尽管该配置无法产生气味浓度的方波阶跃变化,但已成功用于研究气味辨别与检测23。如果实验方案要求气味浓度发生阶跃变化,则应将气味递送设计修改为三条持续流动的2 L/min背景气流通道,其中两条背景气流通道持续递送气味物质,第三条递送通道则递送与矿物油平衡的空气。在此情况下,可通过分流阀将两条气味通道之一或无气味空气导入气味输出口,从而在气味输出口实现气味浓度的阶跃式上升(亦见先前报道20,24)。无论采用何种设计,使用光离子化检测器记录气味浓度变化的时间进程均至关重要。
此处描述的嗅觉仪专为小鼠行为学实验设计,但该设计过去也曾用于大鼠实验。主要区别在于,大鼠实验需要增大实验腔室的尺寸25。此外,本嗅觉仪仅用于评估单只小鼠的嗅觉行为。已有研究报道一种高通量自动化嗅觉仪,可用于同时测试多只小鼠26。
意义
本方案描述了一种自制的嗅觉仪,与现有其他方法相比可降低成本。
未来应用
该嗅觉仪专为小鼠使用而设计,若需用于其他动物(如大鼠),则需进行相应修改。此外,还可整合其他功能组件,例如多通道电极记录系统(如多通道电极记录板)、Arduino Uno 控制板或摄像头等。
作者无任何利益冲突需要披露,且不存在竞争性经济利益。
本研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)资助项目K01 NS127850-01、R25 NS080685、R01 NS081248和DC000566的支持。我们感谢Restrepo实验室和Ramirez-Gordillo实验室所有成员提供的支持。
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| 50k-ohm 线性锥形电位器 | 品牌:TWTADE 可在 Amazon.com 上找到 | 允许调节嗅觉仪组件 电源:交流 220V-6A 轴径:6mm/0.2” 轴长:15mm/0.59” 安装螺纹。 旋钮尺寸 15/17mm/0.6 x 0.67”(d*H) 用于调节电源 | |
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