绝经后骨质疏松症已成为全球性的公共卫生问题。本研究旨在探讨中药逍遥丸对该病症的治疗作用及相关作用机制。
本文内容
摘要
摘要
骨质疏松症是一种常见的老年人及绝经后女性代谢性疾病，早期无明显症状。疾病后期患者易发生骨折，严重影响健康和生活质量。随着全球预期寿命的延长，骨质疏松症已成为全球性关注的健康问题。逍遥丸此前曾被
用于治疗抑郁症。此外，该药物似乎具有类雌激素活性，可影响碱性磷酸酶（ALP，成骨细胞早期特异性标志物）和I型胶原蛋白（COL-1，骨细胞外基质主要成分）的表达。研究评估了逍遥丸对去卵巢小鼠绝经后骨质疏松症（PMOM）的作用。通过中药系统药理学数据库（TCMSP）获取逍遥丸各中药成分的作用靶点信息，并结合GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank等网站的数据，利用Cytoscape和String网络构建中药复方的调控网络，以分析蛋白质相互作用。实验对小鼠进行卵巢切除术，并分别给予高剂量和低剂量逍遥丸治疗，同时设立对照组进行比较。通过骨组织免疫组织化学染色评估小鼠症状。结果表明，逍遥丸可通过IL-17信号通路缓解去卵巢小鼠PMOM的症状。该药物有望成为治疗骨质疏松症的一种新型治疗剂。
引言
世界卫生组织（WHO）将骨质疏松症（OP）定义为一种以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的疾病，导致骨脆性增加，从而提高骨折风险1。骨质疏松症的临床意义在于其可能导致骨折，而骨折与高死亡率、高发病率以及高昂的经济负担相关2。绝经后骨质疏松症（PMOP）是由于女性绝经后雌激素水平下降，导致破骨细胞活性增强，进而引起骨量丢失和骨微结构破坏，常引发严重影响健康的骨质疏松3。目前针对PMOP的治疗包括雌激素替代疗法、双膦酸盐类药物和甲状旁腺激素，但这些疗法可能产生不同程度的不良反应，长期依从性不足，且治疗成本较高4。因此，价格合理的草药治疗对大部分人群而言是一种可行的替代方案。
逍遥丸被收录于《中国药典》5，其由八味中药组成，包括柴胡、Angelica sinensis、White paeonia lactiflora、Atractylodes macrocephala、Poria cocos、Menthae Herba、甘草和生姜。这些药材均具有保肝解毒、健脾益气、养血调经的功效，该复方亦曾用于抑郁症的治疗6。然而，逍遥丸在骨质疏松症中的作用尚不明确。
早期研究表明，炎症可导致骨质流失7，且这一过程相关的骨密度下降可能在绝经后进一步加剧。此外，骨质疏松症的发生与炎症之间存在密切关联。炎症因子白细胞介素-17（IL-17）是由Th17细胞（一种CD4+ T淋巴细胞亚群）分泌的促炎因子。这类细胞与多种慢性炎症性疾病相关，并在类风湿关节炎中骨破坏的发生过程中发挥重要作用8。此外，IL-17可刺激核因子-κB配体受体激活剂（RANKL）的表达，从而调控破骨细胞生成，导致骨吸收超过骨形成9。IL-17还可促进其他促破骨细胞生成的细胞因子（如TNFα、IL-1、IL-6和IL-8）的表达。它能够与其他炎症因子产生协同作用，因而是一种重要的炎症效应因子10。
研究还表明，逍遥丸与炎症之间存在 关联。Shi 等人11和 Fang 等人12最近分别证实，逍遥丸可降低 IL-6 和 TNF-α 的水平。在另一项关于代谢相关性脂肪性肝炎的研究中，报道指出逍遥丸可上调丙酸的表达，进而抑制 TNF-α 的表达，发挥抗炎作用13。然而，目前尚不清楚逍遥丸是否能够通过 IL-17 介导的炎症反应来调控 PMOM 的发展，这正是本研究的目的。
本研究通过网络药理学和生物信息学分析，预测了逍遥丸作用靶点与骨质疏松相关基因的交集，并对交集基因进行蛋白质相互作用、GO和KEGG分析。基于预测结果，可观察白细胞介素-17（IL-17）信号通路中的关键蛋白Act1和IL-6的表达14,15，以及骨转换标志物碱性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型胶原（COL-1）的表达，以评估逍遥丸在PMOM小鼠模型中的治疗效果。
方案
右江民族医学院实验动物伦理委员会批准了本研究方案（批准号：2022101502）。实验所用雌性C57BL/6小鼠，年龄为10-12周，SPF级，体重为（22 ± 2）g，饲养于右江民族医学院SPF级动物实验中心。实验动物饲养环境温度为24-26 °C，相对湿度为55%至60%。
1. 中药系统药理学数据库与分析平台
注意：传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）是包含中药成分、与ADME相关的性质、靶点及疾病信息的中药药理学平台16,17。
- 访问 TCMSP 网络界面。搜索药材名称，输入中药名称，点击 搜索。在搜索结果中点击 拉丁名。根据 OB ≥ 30% 和 DL ≥ 0.18 的参数对成分结果进行筛选。
- 复制所有结果并以 TXT 格式保存，命名为 中药名称_ingredients.txt。
- 在“相关靶点”选项卡下的“靶点信息”中，以 Mol ID（即步骤 1.2 的结果）进行筛选。
- 复制筛选后的结果，并以 TXT 格式保存，命名为 中药名称_targets.txt。
注：通过上述步骤，已获得该传统中药（TCM）所有符合条件的活性成分及其对应的靶点信息。 - 将上述所有 ingredients.txt 文件和 targets.txt 文件放入同一文件夹，并将 Perl 脚本（补充编码文件 1）也置于该文件夹中。
- 打开 CMD，输入 cd 文件夹路径，进入该目录并运行 Perl 脚本。生成一个新的文本文件（allTargets.txt）。该新文本文件（allTargets.txt）包含药材名称、成分名称、成分 ID 和靶点信息。
2. UniProt 数据库
注意：UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）包含带有功能注释的人类蛋白质序列，可用于将靶标名称标准化为其官方名称18。
- 进入 UniProt 网站界面。点击 搜索 标签，选择 UniProtKB，然后点击 搜索。
- 在左侧边栏中进行筛选，状态选择 已审阅（Swiss-Prot），常用生物体选择 人类。点击 下载，选择 下载全部，格式选择 TSV，然后点击 下载 以获取注释文件。
- 将下载的文件解压到当前文件夹，打开解压后的文件，将其内容复制并粘贴到一个名为 ann.txt 的文本文件中。
3. 药物靶点 ID 转换
- 将第1节中获得的所有药物靶点文件 allTargets.txt 和第2节中获得的 UniProt 注释文件 ann.txt 放入一个文件夹，并将 Perl 脚本（补充代码文件 2）放入该文件夹中。
- 打开命令提示符（CMD），输入 cd + 空格 + 文件夹路径，进入该目录，然后运行 Perl 脚本以生成一个新的文本文件（allTargets.symbol.txt）。该新文本文件（allTargets.symbol.txt）包含草药名称、成分 ID、成分名称和基因 ID。
4. 数据库搜索
- GeneCards：人类基因数据库（GeneCards）
注意：GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）提供人类基因的预测和注释信息，可用于获取疾病靶点信息19,20。- 访问 GeneCards 网站界面，在搜索框中输入 osteoporosis，然后点击 搜索。
- 点击 导出，并选择 导出至 Excel。
- 打开下载的文件，复制相关性评分 ≥ 1 的基因，将其粘贴并保存到一个名为 GeneCards.txt 的文件中。
- OMIM 数据库
注意：OMIM 数据库（https://omim.org）包含人类基因、遗传疾病和性状信息21。- 访问 OMIM 网站界面，点击 GENE Map，在搜索框中输入 osteoporosis，然后点击 搜索。
- 点击 下载为，并选择 Excel 文件。
- 打开下载的文件，复制“Approved Symbol”列中的基因名称，将其粘贴并保存到一个名为 OMIM.txt 的文件中。
- PharmGkb 数据库
注意：PharmGkb（https://www.pharmgkb.org）是药物基因组学知识库，包含药品标签注释、以药物为中心的通路、药物遗传学摘要，以及基因、药物与疾病之间的关系22。- 访问 PharmGkb 网站界面，在搜索框中输入 osteoporosis，点击 搜索，并在左侧边栏中勾选 基因。
- 手动录入所有结果，并将其保存到一个名为 PharmGkb.txt 的文件中。
- TTD：治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database, TTD）
注意：TTD 数据库（https://idrblab.org/ttd/）提供有关蛋白质和核酸靶点、靶向疾病、通路信息以及每个靶点对应药物的信息23。- 访问 TTD 网站界面，在搜索框中输入 osteoporosis，然后点击 搜索。
- 在结果中点击“Target ID”下的 Target Info，复制“Target Name”，将其粘贴并保存到一个名为 TTD.txt 的文件中。共获得 33 个结果，每个结果均以相同方式保存。
- DrugBank 在线数据库（DrugBank）
注意：DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com）包含药物及其靶点信息、药物相互作用、药物作用机制以及药物代谢信息24。- 访问 DrugBank 网站界面，在搜索选项卡中选择 适应症，在搜索框中输入 osteoporosis，然后点击 搜索。
- 在结果中点击 骨质疏松症（Osteoporosis） 条目以查看详细信息，点击 药物与靶点（DRUGS AND TARGETS） 标签页，然后点击表格“TARGET”列中的 适当链接。
- 点击 蛋白质详情（Details in Protein），复制基因名称（Gene Name），将其粘贴并保存到一个名为 DrugBank.txt 的文件中。每个结果均以相同方式保存。
5. 维恩图
- 疾病相关基因合并与维恩图映射
- 将保存的 txt 文件以及脚本放在同一文件夹中。
- 打开 R 代码（合并疾病相关基因），将上述 txt 文件所在路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码，并保存。设置基因，将文件命名为 Disease.txt。
- 打开 Draw Venn Diagram 网站；在输入区域，依次将第 4 至第 8 节中保存的文本内容复制粘贴到列表中，使用相应的数据库命名，并点击 提交。
- 点击图像下方的 将图像另存为 PNG，并将文本结果保存在同一文件夹中。
- 药物靶点与疾病相关基因的交集
- 将第 3 节获得的 allTargets.symbol.txt 文件与步骤 5.1.3 获得的 Disease.txt 文件放在同一文件夹中。
- 打开 R 代码（药物靶点与疾病相关基因取交集），将上述 txt 文件所在路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码，并保存。设置基因，将文件命名为 Drug_Disease.txt。
- 打开 Draw Venn Diagram 网站。在输入区域，将 allTargets.symbol.txt 和 Disease.txt 的内容分别复制粘贴到列表中，并以其各自文件名命名。
- 点击图像下方的 将图像另存为 PNG，并将文本结果保存在同一文件夹中。
6. 中药配伍调控网络的构建
- 将第3节中获得的allTargets.symbol.txt文件与Disease.txt文件及相应的Perl脚本放置在同一文件夹中补充编码文件 3).
- 打开命令提示符（CMD），输入 cd 文件路径，按 Enter 键，运行 Perl 脚本。将生成四个新的 txt 文件：net.geneLists.txt、net.molLists.txt、net.network.txt 和 net.type.txt。其中 network.txt 文件包含中药成分 ID、靶基因、靶点关系及成分名称；net.type.txt 文件包含节点名称、属性及所属类别；net.geneLists.txt 为基因列表，net.molLists.txt 为成分列表。
- 将新获得的文本文件复制到同一个新文件夹中。
- 打开 Cytoscape 3.9.1 软件，点击 文件，点击 导入，并选择 网络表单文件选择 net.network.txt，将 Component ID 的第一列设为源节点，Genes 的第二列设为目标节点，Targeting Relationship 的第三列设为相互作用类型，然后单击 好的.
- 从“节点表”窗口导入 net.type.txt。点击 选择标签页，选择 节点，选择 从 ID 列表文件，选择 net.geneLists.txt，然后单击 开放.
- 点击 布局选项卡，选择 度排序圆形布局，并选择 仅选择的节点将节点的高度和宽度均调整为70。
- 点击 高度方向上的第二个盒子，选择 度布局 在“列”中选择 连续映射 在“映射类型”中，双击 高度调节窗口 在当前映射的右侧调整高度的上限和下限至合适范围。
- 使用宽度选项重复该操作。
- 点击 布局 再次按 Tab 键并单击 布局工具 > 调整比例尺 以避免节点重叠。
- 点击 右上窗口 取消选中软件中的节点网络，单击 选择 标签，选择 节点，选择 从 ID 列表文件，选择 net.molLists.txt，然后单击 开放.
- 点击 布局选项卡，选择 组属性布局，选择 仅选择的节点，然后单击 类型.
- 点击 标签字体大小 在左侧列中，将默认值设置为 12。单击 默认值 位于左栏的图像/图表1中。
- 选择 图表 在弹出窗口中，单击 饼图，并选择 项目 在“可用列”列中，除“学位”外，对所选列进行布局，然后单击 应用.
- 点击 边界绘制 在左侧列中，将默认值设置为 #003EF8。单击 边缘 左侧边栏底部的选项卡，将宽度设置为 0.8。
- 单击顶部工具栏中的“文件”，然后选择 导出，然后选择 网络到图像.
- 在弹出窗口中，选择 PNG 格式，选择 保存目录并命名图像网络，将图像大小的缩放调整至最大 500%，选择 透明背景，然后单击 好的 完成图像保存。
7. 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）构建
- 打开 STRING 网站（https://string-db.org/），点击 Multiple Protein，在“上传文件”中点击 Browse，选择步骤 5.2.3 中获得的 Drug_Disease.txt 文件，并在“Organisms”中选择 Homo sapiens。点击 Search，然后点击 Continue。
- 点击 Settings，将“最小必需相互作用评分”设置为最高置信度（0.900），并在网络显示选项中勾选 Hide Disconnected Nodes。点击 Update。
- 调整网络图中的节点，确保无重叠或遮挡现象。
- 点击 Exports，然后点击 Download as a high-resolution bitmap，以 PNG 格式下载蛋白质互作网络图。同时下载 TSV 格式的简明表格文本输出文件。将两个文件保存至同一文件夹中。TSV 文件包含基因名称、STRING 内部 ID 以及不同属性的评分。
8. PPI 网络核心构建
- 将第7节中获得的TSV文件和所需的Perl脚本放入一个新文件夹中。
- 打开Cytoscape 3.9.1软件，点击文件，选择导入，点击从文件导入网络，选择上述TSV文件，将第一列node1设为源节点，第二列node2设为目标节点，然后点击确定。
- 在左侧边栏中点击样式，在“宽度”中点击默认值，将其设置为60。拖动节点，使网络中无节点重叠或遮挡。
- 在顶部工具栏中点击应用程序，点击CytoNCA，然后点击打开。
- 在左侧列中，于介数、接近度、度、特征向量、基于局部平均连接性的方法和网络下均选择无权重，然后点击分析。
- 分析完成后，在右下窗口中点击节点表格，点击导出，将其保存到该文件夹中，并命名为score1。
注意：需在Cytoscape软件中安装CytoNCA插件。操作方法为：点击顶部工具栏中的应用程序，点击应用程序管理器，在搜索框中输入CytoNCA，在返回结果的中间列中勾选CytoNCA，然后点击安装。 - 打开score1，将名称列调整至第一列，复制表格中的信息，粘贴到一个新的文本文件中，命名为score1.txt，并保存。
- 打开R代码，将score1.txt文件所在路径复制并粘贴到R代码中setwd所在行。
- 打开R软件并运行修改后的代码，得到两个新文件：score2.txt和score2.gene.txt。score2.txt文件包含所有项目得分均高于中位数的基因及其在各项目中的具体得分；score2.gene.txt文件包含所有项目得分均高于中位数的基因。
- 继续在Cytoscape中操作，在右下窗口点击分析面板1，在窗口左侧点击从文件上传，选择score2.gene.txt，点击打开，然后在弹出窗口中点击确定。
- 在底部点击选择节点，然后在弹出窗口中点击确定。
- 在顶部工具栏中点击文件，选择导出，点击网络导出为图像，将图像大小中的缩放(%)调整至最大500%，勾选透明背景，将文件保存到同一文件夹中，命名为network1。
- 在下方窗口的右侧边栏中点击创建子网络以生成子网络，对子网络进行分析，点击顶部工具栏中的应用程序，点击CytoNCA，然后点击打开。
- 在左侧边栏中，于介数、接近度、度、特征向量、基于局部平均连接性的方法和网络下均选择无权重，然后点击分析。
- 分析完成后，在右下窗口中点击节点表格，点击导出，将其保存到一个名为score2的新文件夹中。
- 打开score2，将名称列调整至第一列，复制表格中的信息，粘贴到一个新的文本文件中，命名为score2.txt，并保存。
- 打开R代码，将score2.txt文件所在路径复制并粘贴到R代码中setwd所在行。
- 打开R软件并运行修改后的代码，得到两个新文件：score3.txt和score3.gene.txt。score3.txt文件包含所有项目得分均高于中位数的基因及其在各项目中的具体得分；score3.gene.txt文件包含所有项目得分均高于中位数的基因。
- 继续在Cytoscape中操作，在右下窗口点击分析面板1，在窗口左侧点击从文件上传，选择score3.gene.txt，点击打开，然后在弹出窗口中点击确定。
- 在底部点击选择节点，然后在弹出窗口中点击确定。
- 在顶部工具栏中点击文件，选择导出，点击网络导出为图像，将图像大小中的缩放(%)调整至500%，勾选透明背景，将文件保存到本步骤所用的同一文件夹中，命名为network2。
- 在下方窗口的右侧边栏中点击创建子网络以生成子网络。
- 在顶部工具栏中点击文件，选择导出，点击网络导出为图像，将图像大小中的缩放(%)调整至最大500%，勾选透明背景，将文件保存到本步骤所用的同一文件夹中，命名为network3。
9. 基因 ID 转换
- 将 Drug_Disease.txt 文件与所需的代码文件放在同一个新建的文件夹中。
- 打开 R 代码（补充编码文件 4），将 Drug_Disease.txt 文件所在路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的代码，使用 org.Hs.eg.db 包转换基因 ID，并在完成运行后生成一个新文件 id.txt。该 id.txt 文件包含基因的符号及其对应的 ID。
10. GO 富集分析
- 将上一步生成的 id.txt 文件放入与 GO 富集分析代码相同的文件夹中。
- 打开 R 代码（补充编码文件 5），并将工作目录设置为 id.txt 所在路径以及 GO 代码的存储路径。
- 打开 R 软件，运行修改后的代码，使用 clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 绘图，生成 GO 富集分析的柱状图和气泡图。运行完成后，将得到三个新文件：GO.txt、barplot.pdf 和 bubble.pdf。
注意：GO.txt 是富集结果文件，包含富集分类（BP、CC、MF）、GO ID、GO 名称、基因比例、背景比例、富集显著性 p 值、校正后的 p 值（p.adjust 值）、基因 ID（名称）以及在每个 GO 条目中富集的基因数量。barplot.pdf 为柱状图，bubble.pdf 为气泡图。
11. KEGG 富集分析
- 将 id.txt 文件放置在与 KEGG 富集分析代码相同的文件夹中。
- 打开 R 代码（补充编码文件 6），并将工作目录设置为 id.txt 和 KEGG 代码所在路径。
- 启动 R 软件，运行修改后的代码，使用 clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot 和 ggplot2 软件包绘制 GO 富集分析柱状图、气泡图和通路图。运行完成后将生成三个新文件：KEGG.txt、barplot.pdf 和 bubble.pdf。
注意：KEGG.txt 文件为富集结果文件，包含通路 ID、通路描述、基因比例、背景比例、富集显著性 p 值、校正后 p 值（p.adjust，qvalue）、基因 ID（名称）以及每个通路中富集的基因数量。barplot.pdf 为柱状图，bubble.pdf 为气泡图。 - 在 KEGG.txt 文件中搜索 IL-17，结果显示仅存在一条通路；复制该通路的 ID。
- 打开 R 代码，将 IL-17 通路 ID 粘贴至 KEGGID 位置，并使用 pathview 软件包对通路图进行标注。运行修改后的 R 代码，获得两个新文件：hsa04657.pathview.png 和 hsa04657.png。
注意：hsa04657.png 文件为通路图，hsa04657.pathview.png 为标注后的通路图，其中以红色标注的基因为相互作用网络中存在的基因。
12. 逍遥丸的制备
注意：制备方法参见《中国药典》5。
- 取柴胡 100 g、当归（Angelica sinensis）100 g、白芍药（Paeonia lactiflora）100 g、炒白术（Atractylodes macrocephala）100 g、茯苓（Poria cocos）100 g、炙甘草（Radix glycyrrhizae preparate）80 g 和薄荷草（Menthae herba）20 g。
- 使用石磨或粉碎机将药材研磨成细粉；按上述比例混合多种药材，粉碎成细粉，使其自然混合均匀。使用内径为 180 µm ± 7.6 µm 的 80 目药筛对粉碎后的粉末进行过筛，然后充分混匀。
- 取生姜 100 g，加水后煎煮两次，每次 20 分钟。滤去药渣，药液备用。
- 取药匾，用小刷子蘸取姜水，刷在药匾表面，取上述药粉撒于姜水上，转动药匾使药粉全部润湿，并能聚集成球形。
注意：药匾的制备是中药丸剂制作过程中的关键步骤。通常将毛竹劈成条状并编织成骨架，再用竹青（藤皮）编织成表面，使其呈圆形。药匾表面需薄涂一层桐油，再刷上一层漆，干燥后形成防水层。使用此方法制成的药丸将呈圆润光滑的形态。 - 再次刷上姜水，撒上药粉，旋转药匾使药物逐渐滚圆并增大，随后置于阴凉处干燥。
13. 动物模型的建立
- 经过7天的适应性饲养后，将实验小鼠随机分为4组，即假手术组（Sham，仅切除卵巢周围的脂肪组织）和三组卵巢切除小鼠，包括模型组（OVX）以及低、高浓度逍遥丸给药组。
- 通过腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过观察小鼠是否出现全身肌肉松弛、呼吸深慢及活动减缓来确认其进入麻醉状态。术前为小鼠眼部涂抹眼膏。
- 将动物置于俯卧位，使用动物专用剃毛器剃除背部肾区毛发，并用75%乙醇进行局部消毒。
- 在靠近肾脏背侧区域两侧各做一条长约1 cm的纵向切口，切开筋膜并分离肌肉与腹膜。
- 定位子宫角上部及输卵管进行结扎。将镊子插入切口进行探查，找到被脂肪组织包裹、呈鲜红色花椰菜状的卵巢，卵巢下方有螺旋状排列的输卵管，连接卵巢与子宫角25。使用手术剪切除卵巢，并进行缝合。
- 在假手术组中，仅切除卵巢附近少量脂肪组织作为对照。观察动物直至其恢复意识。术后将动物单独饲养于不同笼具中，直至完全恢复。
- 为预防感染，术后连续3天给予小鼠庆大霉素。术后根据小鼠实际状况保证正常饮食和良好的生长环境。若出现伤口感染、食欲减退等异常情况，应立即联系实验动物中心负责人。
14. 药物给药
注意：根据《药理学实验方法学》26，人与动物剂量换算中，70 kg 成人使用逍遥丸 9 g 相当于一个剂量单位（单次给药剂量）。
- 对于低剂量组和高剂量组，每组8只动物分别使用0.683 g/kg和2.73 g/kg的剂量。用左手固定小鼠，使小鼠的口腔与食道呈一条直线。右手持灌胃针，从小鼠口腔角落沿咽后壁轻轻插入食道。
- 此时可略微调整灌胃针的方向，以刺激诱发吞咽动作。注入药物，并每日执行一次，持续12周。
- 对于假手术组和模型组，根据动物体重确定剂量，每日给予生理盐水一次，持续12周。
- 通过颈椎脱臼法处死小鼠，并剪除后肢。剥离肢体皮肤，分离肌肉与股骨。将小鼠股骨置于EDTA脱钙液中处理1个月，每日更换新鲜溶液。
15. 苏木精-伊红染色（HE染色）
- 将股骨组织脱蜡 8 分钟，然后放入梯度乙醇中 3 分钟；用流水冲洗 1 分钟。
- 向切片上滴加苏木精染色液，完全覆盖组织，染色 5 分钟，然后用自来水冲洗。
- 将盐酸分化液滴加至载片上的组织，确保完全覆盖组织。当观察到组织褪色时即停止，用自来水冲洗。
- 滴加伊红染液，使其完全覆盖组织，作用时间为 30 秒至 2 分钟。用流水洗去多余染液。
- 依次使用 75% 无水乙醇进行梯度脱水 5 分钟，再用无水乙醇脱水 5 分钟，最后用脱蜡液透明 3 分钟。
- 根据组织大小，在载片上滴加适量中性树胶，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
16. 微型计算机断层扫描与免疫组织化学分析
- 去除不同组别小鼠股骨标本周围的多余肌肉和韧带，并将样本组织置于4%多聚甲醛中固定24小时。
- 将骨组织自然晾干，通过骨组织扫描进行显微CT检测，以获取三维显微CT数据。
- 从保存的小鼠石蜡包埋块中连续切片，厚度为6 µm，将切片置于70 °C–72 °C烘箱中烘烤30–60分钟。
- 脱蜡8分钟，随后依次用75%无水乙醇处理5分钟、无水乙醇处理5分钟，PBS冲洗5分钟，重复3次。
- 采用EDTA高压修复15分钟，随后用PBS洗涤5分钟，重复3次。
- 向组织滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育10分钟，再用PBS洗涤5分钟，重复3次。
- 使用免疫组化笔画圈标记，再用PBS洗涤3分钟，重复3次。
- 加入一抗（抗ALP兔多克隆抗体（1:200）、抗COL-1兔多克隆抗体（1:200）、抗IL-17兔多克隆抗体（1:275）、抗Act1抗体（1:500）、抗IL-6兔多克隆抗体（1:500）），4℃孵育过夜，随后用PBS缓冲液冲洗5分钟，重复3次。
- 滴加二抗（HRP标记的Affinipure羊抗兔IgG（H+L；1:2000）），室温孵育60分钟，再用PBS缓冲液洗涤3分钟，重复3次。
- 加入即用型DAB显色液，孵育3–5分钟，随后用PBS冲洗。
- 用苏木精复染3分钟，随后用PBS冲洗。
- 使用分化液处理约10秒，随后用PBS冲洗。
- 加入返蓝液处理10秒，随后用PBS冲洗。
- 依次用75%无水乙醇处理5分钟、无水乙醇处理5分钟，透明3分钟，最后用中性树胶封片。
结果
逍遥丸的活性成分及其作用靶点
通过检索TCMSP数据库，并根据口服生物利用度（OB）≥ 30% 和类药性（DL）≥ 0.18 的标准进行筛选，共发现逍遥丸中存在 125 种活性成分。其中，成分 6、4、9、13、2、6、83 和 2 分别来源于白芍Paeonia lactiflora、白术Atractylodes macrocephala、薄荷Menthae herba、柴胡、当归Angelica sinensis、茯苓Poria cocos、甘草和生姜。部分活性成分见表1。此外，从TCMSP数据库中共获得有效活性成分的 879 个作用靶点，经基因ID转换并去除重复值后，共保留 232 个靶点。
中医药-活性成分-交集靶点-疾病网络分析
通过以“骨质疏松症”为关键词检索多个数据库，获取与该疾病相关的基因。在GeneCards数据库中，根据相关性评分≥1的条件筛选后获得1692个基因；在OMIM数据库中获得35个基因；PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中分别获得3、33和386个基因。随后，对这五个数据库的结果取交集用于进一步分析（图1A）。其中一个出现在四个数据库中的基因为CALCR。将疾病相关基因与药物靶点取交集后，共获得102个交集基因（图1B）。基于疾病靶点与药物活性成分之间的相互作用关系，利用Cytoscape软件构建了中医药-活性成分-交集靶点-疾病网络，从而获得了药物组分与疾病相关基因多态性调控之间的关联关系（图2A）。
在String数据库中，通过分析疾病基因与药物靶点的交集处的蛋白质相互作用，获得其相互作用网络图（图2B），并进一步筛选出其中最核心的蛋白质（图2C-D）。结果显示，在疾病基因与药物靶点中，FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 和 STAT3 之间的相互作用最强（图2E）。
GO功能与KEGG通路富集分析
GO富集分析共显示2177个条目，包括1990个生物过程（BP）条目、58个细胞组分（CC）条目和129个分子功能（MF）条目。在生物过程方面，基因主要富集于对营养水平的响应、对氧化应激的响应以及细胞对氧化应激的响应。分子功能主要涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活的转录因子活性以及细胞因子活性（图3A-B）。
在KEGG通路富集分析中，共获得168条相关信号通路，其中较为显著的包括AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路以及Th17细胞分化（图3C-D）。结果提示，逍遥丸可能通过多种途径对PMOM发挥治疗作用。炎症与骨质疏松密切相关，且可能因绝经而加剧，其中IL-17是一种重要的炎症因子7。因此，下一步计划是探讨逍遥丸是否能够从IL-17介导的炎症角度治疗骨质疏松。
卵巢组织切除前后骨组织的结构变化
HE染色显示，假手术组小鼠股骨中骨小梁排列紧密，连续性良好，骨小梁间隙小，骨折罕见，骨髓腔大小正常。与假手术组相比，OVX组小鼠股骨骨小梁排列稀疏，骨小梁骨折严重，连续性中断，骨髓腔明显扩大，呈现典型的骨质疏松改变（图4A）。
各组之间的显微CT比较
与假手术组小鼠相比，OVX组小鼠的股骨显示出不完整的骨小梁网状结构、部分空虚的骨髓腔以及骨皮质变薄。假手术组小鼠的股骨则表现出丰富的骨小梁、良好的连续性以及狭窄的骨髓腔（图4B）。
逍遥丸对小鼠的行为学影响
在研究期间，除OVX组外，其余各组小鼠的生活习性均较好，毛色正常，活动度高，健康状况良好。给予逍遥丸治疗后1周内，各小鼠的尿液和粪便均恢复正常。未见小鼠出现咬伤、伤口感染、胃肠道梗阻、缝线脱落、切口皮肤坏死或死亡等情况。OVX组小鼠则易出现脱毛、毛色变暗、活动度降低、反射时间延长、排泄增多以及饮水和进食减少等现象。
药物干预后小鼠病理切片的HE染色
假手术组中，股骨组织致密，网状结构排列规则，骨髓腔大小和连续性正常，相邻骨小梁之间的间距相对较小。与假手术组相比，OVX组小鼠的股骨皮质和松质骨出现明显缺损，骨小梁减少，间隙增大，连续性中断，结构变薄，骨髓腔增宽，骨皮质变薄。与OVX组相比，药物治疗组（低剂量和高剂量）小鼠的股骨小梁结构趋于完整，间距减小，连接性增加，骨髓腔变窄，结构更加致密（图5A）。
药物干预后小鼠影像学指标的检测
与假手术组相比，OVX组小鼠的股骨骨小梁稀疏、断裂，骨皮质变薄。与OVX组相比，高剂量逍遥丸组小鼠的骨小梁断裂减少，网状结构得到恢复，骨髓腔部分明显缩小。然而，低剂量逍遥丸处理的小鼠仍存在骨小梁断裂，尽管骨小梁数量有所增加，骨髓腔有所减小。假手术组小鼠的骨小梁结构显示出更高的连续性和完整性（图5B）。
药物干预后各组组织的免疫组化结果
Act1 和 IL-6 是 IL-17 信号通路中的关键蛋白，ALP 和 COL-1 是成骨相关基因。ALP、COL-1、IL-6、IL-17 和 Act1 蛋白的表达会在骨组织中形成棕黄色或黄色颗粒。免疫组化结果显示，逍遥丸治疗后，给药组 ALP 和 COL-1 的平均光密度值高于 OVX 组，差异具有统计学意义（p < 0.05）。给药组 IL-17、Act1 和 IL-6 的平均光密度值低于 OVX 组，差异亦具有统计学意义（p < 0.05；图6）。逍遥丸可逆转卵巢切除所致的 ALP 和 COL-1 表达下降，同时降低 IL-17 信号通路中多个关键蛋白（IL-17、IL-6 和 Act1）的表达水平，提示该药物可能通过此通路发挥治疗作用。
图1：中药活性成分与疾病相关基因交集的网络分析。（A）来自 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD 和 DrugBank 数据库的疾病相关基因的交集。这些数据库分别以蓝色、红色、绿色、黄色和棕色表示，包含基因数分别为 1692、35、3、33 和 386 个。交集部分表示五个数据库共有的疾病相关基因，重叠区域显示各数据库间共有基因的数量。（B）药物靶点（蓝色表示该数据集，即在 TCMSP 数据库中经过 ID 转换并去除重复后收集的药物作用靶基因集合）与疾病相关基因（红色表示该数据集，包含上述五个数据库中的全部基因）的交集结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：中药活性成分与疾病相关基因调控网络及核心蛋白的相互作用。（A） 中药活性成分与疾病相关基因的调控网络，展示了逍遥丸中每种活性成分所对应的基因调控关系，每种成分均与其调控的基因相连。（B） STRING 中交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用分析结果（网络节点代表蛋白质，边代表蛋白质之间的关联，多重连接表示两个蛋白质之间存在多种相互作用）。（C-E） 通过 String 获得的蛋白质相互作用经过多次筛选。（C） 首次筛选后获得的蛋白质相互作用网络，高亮部分为其核心区域。（D） 第二次筛选的结果，高亮部分为核心区域。（E） 蛋白质相互作用网络中最核心的蛋白质互作子网络。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：GO 和 KEGG 富集分析。（A-B）交集基因的 GO 富集分析结果分为三个条目：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），每个条目仅显示富集最显著的前 10 个基因。（C-D）交集基因的 KEGG 富集分析结果（显示富集最显著的前 30 个通路）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：卵巢切除小鼠模型的建立与评估。（A）假手术组与卵巢切除组之间干骺端骨形态的比较（10倍放大）。在OVX组中，骨小梁断裂严重，连续性中断，骨髓腔显著扩大；而在假手术组中，骨小梁断裂罕见，骨髓腔大小正常。（B）假手术组与卵巢切除组股骨的显微CT扫描图像。在OVX组中，骨小梁网状结构不完整，骨髓腔部分呈空腔状；在Sham组中，骨小梁丰富且连续，骨髓腔狭窄。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：逍遥丸治疗后的HE染色与微计算机断层扫描（micro-CT）检测结果。（A）各组小鼠经逍遥丸治疗后股骨切片的HE染色（10倍放大）。在OVX组中，骨小梁数量减少，连续性中断，结构稀疏，骨髓腔扩大。Sham组中，骨小梁连续性良好，股骨组织结构致密，骨髓腔正常。与OVX组相比，药物处理组的骨小梁结构较为完整，连接性增加，骨髓腔缩小，结构较模型组更为致密。（B）各组小鼠经逍遥丸治疗后股骨micro-CT结果比较。卵巢切除组小鼠股骨骨小梁稀疏且断裂，而Sham组骨小梁更为连续且完整。与卵巢切除组相比，高剂量药物处理组小鼠的断裂骨小梁减少，网状结构得到恢复，骨髓腔部分缩小；低剂量药物处理组小鼠骨小梁数量增多，骨髓腔减小，但骨小梁断裂现象仍然存在。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：免疫组织化学检测逍遥丸对骨质疏松小鼠IL-17信号通路及成骨标志基因蛋白表达的影响（40倍放大）。 ALP、COL-1、IL-6以及IL-17和Act1蛋白的阳性反应表现为骨组织中出现棕黄色或黄色颗粒。药物组中ALP和COL-1的表达高于OVX组（p < 0.05）。药物组中IL-17、Act1和IL-6的表达低于OVX组（p < 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 中药名称 | 分子编号 | 分子名称 |
| 白芍（Paeonia lactiflora） | MOL001918 | paeoniflorgenone |
| 白芍（Paeonia lactiflora） | MOL000211 | Mairin |
| 白术（Atractylodes macrocephala） | MOL000022 | 14-乙酰基-12-当归酰基-2E,8Z,10E-苍术三醇 |
| 白术（Atractylodes macrocephala） | MOL000049 | 3β-乙酰氧基苍术酮 |
| 薄荷（Menthae Herba） | MOL000471 | 芦荟大黄素（aloe-emodin） |
| 薄荷（Menthae Herba） | MOL005190 | 柚皮素查尔酮（eriodictyol） |
| 柴胡（Chai Hu） | MOL000354 | 异鼠李素（isorhamnetin） |
| 柴胡（Chai Hu） | MOL013187 | Cubebin |
| 当归（Angelica sinensis） | MOL000449 | 豆甾醇（Stigmasterol） |
| 当归（Angelica sinensis） | MOL000358 | β-谷甾醇（beta-sitosterol） |
| 茯苓（Poria cocos） | MOL000282 | 麦角甾-7,22E-二烯-3β-醇（ergosta-7,22E-dien-3beta-ol） |
| 茯苓（Poria cocos） | MOL000283 | 过氧化麦角甾醇（Ergosterol peroxide） |
| 甘草（Licorice） | MOL002311 | 甘草醇（Glycyrol） |
| 甘草（Licorice） | MOL004990 | 7,2',4'-三羟基-5-甲氧基-3-芳基香豆素（7,2',4'-trihydroxy - 5-methoxy-3 - arylcoumarin） |
| 生姜（Fresh ginger） | MOL006129 | 6-甲基姜二乙酸酯2（6-methylgingediacetate2） |
| 生姜（Fresh ginger） | MOL001771 | 海绵甾-5-烯-3β-醇（poriferast-5-en-3beta-ol） |
表1：选定中药中的活性成分。 第一列为中药名称，第二列为中药活性成分的编号，第三列为中药中活性成分的名称。
补充编码文件 1：草药名称、成分和靶标 ID 合并代码。 请点击此处下载该文件。
补充编码文件 2：药物靶点 ID 转换。 请点击此处下载该文件。
补充编码文件3：用于网络分析的文件。 请点击此处下载该文件。
补充编码文件 4：基因符号到基因 ID 的转换。 请点击此处下载该文件。
补充编码文件 5：GO 富集分析。 请点击此处下载该文件。
补充代码文件 6：KEGG 富集分析。 请点击此处下载该文件。
讨论
据统计，骨质疏松症每年在美国导致150万例骨折，其中绝大多数发生在绝经后女性27。随着人口老龄化加剧，预计全球未来大部分髋部骨折将发生在亚洲，到2050年，全球髋部骨折总数将达到820万例28。预防骨折的成本几乎与治疗成本相当，而药物治疗不可避免地会带来一些副作用29。因此，在一个负责任的社会中，迫切需要一种更具成本效益的方法来应对这一问题。
逍遥丸由八种成分组成。目前针对其成分对骨质疏松症作用的研究仍在进行中。 Poria cocos 在卵巢切除诱导的骨质疏松小鼠模型中抑制破骨细胞生成及溶骨活性30甘草与熟地黄两种成分的组合可能通过抑制NF-κB信号通路发挥抗氧化作用31传统的中草药滋补品， 当归补血汤，可能通过抑制骨转换并调节下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴功能，从而在卵巢切除大鼠模型中预防骨丢失，因此在骨质疏松症的治疗中具有潜在应用价值32所有这些结果表明，逍遥丸可能对骨质疏松症具有治疗作用。本研究的结果还提示，逍遥丸可能通过以抗炎方式调节IL-17信号通路的活性，发挥抗骨质疏松作用。
本研究从构建的药物靶点与骨质疏松相关基因调控网络中获得了168条相关信号通路，并进一步探讨了IL-17信号通路。IL-17家族包含六个成员，即IL-17A至IL-17F，其中IL-17A是最早被发现且最重要的成员33。早期研究认为IL-17与人类的炎症性和自身免疫性疾病相关。后续研究表明，其在维持屏障完整性方面具有作用，同时也被发现与癌症相关15。然而，尽管IL-17在骨重建的生理过程中并不发挥作用，但在异常骨条件下其表现有所不同。此外，IL-17可作为弱激活因子，并能与其他细胞因子协同作用以增强效应输出，这一点在其与TNFα共激活时得到证实15,34。
我体外 实验已证明，IL-17 可诱导成骨性间充质干细胞（MSCs）的增殖与分化35，并且还能抑制BMP-2诱导的大鼠原代成骨细胞分化36IL-17 可刺激成骨细胞表达 RANKL，从而促进破骨细胞生成，但这一效应似乎依赖于成骨细胞的存在37,38本研究中，不同浓度的逍遥丸对PMOM模型小鼠均产生治疗作用，尤以高浓度效果显著。与对照组相比，这些小鼠体内与IL-17信号通路相关的IL-17、Act1和IL-6水平均显著降低。富集分析结果进一步提示，逍遥丸干预可涉及IL-17通路的参与。
本研究还检测了部分骨转换标志物。碱性磷酸酶（ALP）是一种四聚体膜结合酶，可由成骨细胞分泌，通过降解矿化抑制剂焦磷酸盐，在类骨形成和矿化过程中发挥重要作用39。骨组织细胞外基质中约90%的有机成分为I型胶原（COL-1），在骨矿化过程中，胶原起着关键作用40。本研究结果显示，药物组小鼠经免疫组化检测的ALP和COL-1蛋白表达水平高于模型组，提示逍遥丸改善骨质疏松的作用可能通过上调成骨相关基因指标实现。有学者证实，逍遥散可上调肝细胞雌激素受体（ERα）的表达及转录活性41。逍遥散中的当归（Angelica sinensis）、白芍（Paeonia lactiflora）和甘草提取物已被证明具有类雌激素活性。本研究所用的逍遥丸系采用现代制剂工艺由逍遥散原方制备而成，含有相同成分。因此可推测，逍遥丸可能通过在成骨细胞上发挥类雌激素作用，增强其活性，从而上调ALP和COL-1等成骨基因的表达，改善骨质量。
本研究通过背侧卵巢切除术摘除小鼠双侧卵巢，成功建立了小鼠PMOM模型。该动物模型是本研究后续所有实验的基础。在手术摘除小鼠卵巢时，需确保OVX组和药物组小鼠的卵巢被完全切除，而假手术组仅切除卵巢附近的脂肪组织，同时必须注意 避免 伤口感染。
小鼠经逍遥丸治疗后，骨小梁数量和连接密度均得到改善，表明该药物对骨质疏松具有治疗作用。本研究采用免疫组织化学和免疫细胞化学方法评估治疗效果；各种试剂的作用时间并非绝对，尤其是在显色过程中，需实时观察并及时终止反应，以确保最佳结果。在抗体孵育过程中，应首先设置抗体浓度梯度，经观察与比较后，选择最适浓度用于后续实验。
然而，本研究存在一些局限性。网络药理学数据仅来源于单一数据库，关于药物成分的分析也仅基于一个数据库。此外，本研究未将逍遥丸的疗效与阳性药物进行比较，因此无法评估逍遥丸与现有治疗方式之间的具体差异。
对于PMOM，可选的一线治疗方案是双膦酸盐类药物。然而，这些药物的使用可能导致胃肠道禁忌症，甚至更严重的非典型股骨骨折和颌骨骨坏死42,43。二线治疗方案包括使用地诺单抗和激素治疗。地诺单抗已被证明可减少髋部、椎体及非椎体骨折的发生。然而，一旦停药可能出现反弹效应，停药时间越长，骨密度丢失越严重42,44,45。绝经期激素治疗可降低脊柱骨质疏松性骨折的风险，但其疗效具有年龄限制，且长期使用的风险似乎超过其益处46。序贯治疗是PMOM的一种长期治疗选择，先使用促骨形成药物，随后使用抗骨吸收药物，可实现骨量的最大程度增加。具体用药方案通常需根据每位患者的具体情况个体化确定42。
从这一角度来看，可以认为传统中草药在治疗骨质疏松症方面具有潜在优势。中草药的作用模式是多通路、多靶点的，而非仅通过单一机制发挥作用47。一些学者已对部分中草药的疗效和安全性进行了评估，结果表明，与单用西药相比，中西医结合治疗组的骨折数量低于仅使用西药的对照组48。与化学药物相比，中草药副作用较少、价格相对低廉，适合长期使用。中草药不仅能修复骨微结构、增加骨量，还能减轻或消除腰脊无力和腰背疼痛等症状49。本研究可能有助于为发现新型药物和治疗方法提供一条可行途径。
逍遥丸在治疗绝经后骨质疏松症（PMOM）方面似乎具有良好的应用前景。本研究表明，该药可通过抑制炎症反应，在PMOM小鼠模型中改善骨量和骨质量。一些学者甚至提出，中草药联合针灸可能对治疗PMOM有效50。同时，中西医结合疗法已被证实具有疗效51。上述两种潜在治疗方法均具有一定合理性，但任何将逍遥丸与针灸及西医治疗联合使用方案的有效性，均需通过临床试验加以验证。骨质疏松症的临床意义主要在于其导致的骨折风险，因此未来的研究也应重点关注骨折的预防。
综上所述，本研究通过网络药理学和动物实验证明，服用逍遥丸后，PMOM小鼠的骨代谢显著改善，骨量增加。该现象的作用机制可能与抑制IL-17信号通路以及增强成骨相关因子ALP和COL-1的活性有关。本研究为逍遥丸在骨质疏松相关疾病治疗中的临床应用奠定了理论基础和实验依据。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到百色市科学研究与技术发展计划项目（20224128）的资助。作者感谢伦敦帝国理工学院的Dev Sooranna博士和YMUN对稿件的编辑。YYX和ZYW对本研究贡献相同。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1ml 取样器 | 广西北仑河医药工业集团有限公司 | JYQ001 | 用于小鼠麻醉 |
| 4%多聚甲醛 | 北京索莱宝科学技术 & 技术有限公司 | P1110 | 用于组织固定 |
| 6-0 可吸收缝线（带角针） | 上海浦东金环医疗用品有限公司 | HZX-06 | 用于术后缝合 |
| 吸水棉球 | 优胜者 | MIANQIU-500g | 用于灭菌和止血 |
| 粘附载玻片 | 江苏世泰实验设备有限公司 | 188105 | 用于组织切片 |
| 阿米妥钠 | Sigma Aldrich（上海）贸易有限公司 | A-020-1ML | 小鼠麻醉 |
| 蓝染液 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | G1866 | 苏木精分化液作用后细胞核呈蓝色 |
| C57BL/6 小鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | （SCXK 2033-0063） | 用于动物实验 |
| 碳钢手术刀片 | Premier Medical Equipment Co. | SP239 | 小鼠手术 |
| CIKS/TRAF3IP2 兔多克隆抗体 | BIOSS 抗体 | bs-6202R | 与组织中的 Act1 结合 |
| 科氏苏木精溶液（用于常规染色） | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | G1140 | 用于石蜡切片染色 |
| I型胶原多克隆抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | 与组织中的 COL-1 结合 |
| DAB 底物试剂盒，20x | 北京索莱宝科技有限公司 &有限公司 | DA1010 | 用于组织显色 |
| 一次性手术单 50*60CM | 南昌徐汇医疗器械有限公司 | SP4529777 | 用于小鼠手术 |
| EDTA 脱钙溶液（pH 7.2） | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | E1171-500ml | 用于组织脱钙 |
| 增强型内源性过氧化物酶封闭缓冲液 | 碧云天生物技术 | P0100B | 内源性过氧化物酶的封闭 |
| 环保型脱蜡透明液体 | Servicebio | G1128-1L | 用于脱蜡石蜡切片 |
| 乙醇 | CHRON CHEMICALS | 64-17-5 (CAS) | 石蜡切片脱水步骤 |
| 通用型抗体稀释液 | Epizyme Biotech | PS119L | 用于抗体稀释 |
| 苏木精分化液 | Servicebio | G1039-500ML | 用于苏木精染色后分化，并去除组织中过度结合及非特异性吸附的染料 |
| 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | G1120-3*100ml | 用于组织染色 |
| 高品质不锈钢手术刀柄 | Premier Medical Equipment Co. | SP0088 | 用于小鼠手术 |
| HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | 与一抗结合并放大信号 |
| IL-17A 多克隆抗体 | Proteintech | 13082-1-AP | 与组织中的 IL-17 结合 |
| IL-6 多克隆抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | 在组织中与 IL-6 结合 |
| 免疫组化笔 | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | ZLI-9305 (YA0310) | 用于免疫组织化学中绘制圆形 |
| 医用外科缝线 非吸收性（线球）5-0 3.5米 | 扬州源立康医疗设备有限公司 | FHX-5-2 | 用于术后缝合 |
| 医用缝合针 角针 4*10 3/8 | 巢湖宾雄医疗器械有限公司 | FHZ612-4 | 用于术后缝合 |
| 中性树胶 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | G8590 | 作为切片封片剂 |
| PBS(1X) | 深圳墨宏科技有限公司 | B0015 | 用于玻片清洗和部分溶液稀释的缓冲液 |
| 无蛋白快速封闭缓冲液（1X） | Epizyme Biotech | PS108P | 避免蛋白质的非特异性结合 |
| 兔抗骨碱性磷酸酶抗体 | BIOSS 抗体 | bs-6292R | 与组织中的碱性磷酸酶结合 |
| 生理盐水 | 右江民族医学院附属医院 | LHN500 | 通过灌胃法给予动物 |
| 剃须/电动剪刀 | 杭州华元宠物用品有限公司 | DTJ-002 | 用于小鼠脱毛 |
| 不锈钢医用持针器 14厘米 粗针 | Premier Medical Equipment Co. | SP784 | 用于小鼠手术 |
| 不锈钢眼科镊 10.5 cm 弯型（无钩） | Zhuoyouyue | YKNWW-10.5 | 用于小鼠手术 |
| 不锈钢眼科剪/外科手术剪 10厘米直头 | Premier Medical Equipment Co. | ZYJD-10-ZJ | 用于小鼠手术 |
| 不锈钢尖端胃部穿刺针 12 号规格 55 毫米弯头 | GWJ-12-55W | 用于小鼠灌胃 | |
| Tris-EDTA抗原修复液（50倍浓缩） | Proteintech | PR30002 | 用于石蜡切片的抗原修复 |
| 木质解剖板 25*16 cm | JP16*24 | 用于小鼠手术 | |
| 逍遥丸 | 九芝堂股份有限公司 | YPG-041 | 用于动物药物递送 |
| <强>其他 | |||
| R 4.3.1 | 数据处理 | ||
| Cytoscape3.9.1 | 国家网络生物学资源中心 | 构建中药调控网络 | |
| ImageJ 1.54f | 美国国立卫生研究院 | 免疫组织化学结果的图像处理 | |
| Adobe Photoshop 24.0.0 | Adobe | 用于图像合并 | |
| Graphpad Prism 9.5 | GraphPad Software | 数据的统计分析 | |
| Cellsens Dimension | OLYMPUS | 用于切片与拍照 | |
| OLYMPUS BX53 | OLYMPUS | 用于HE染色和免疫组织化学切片摄影 |
参考文献
- Kanis, J. A., Melton, L. J. 3rd, Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
- Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655(2023).
- Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609(2021).
- Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850(2023).
- Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
- Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456(2021).
- Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
- Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8(2018).
- Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
- Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324(2019).
- Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332(2020).
- Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
- Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747(2023).
- Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
- Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
- Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767(2023).
- UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
- Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913(2021).
- Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
- Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
- Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
- Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
- Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
- Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, Academic Press. 253-284 (2012).
- Chen, S. X. R. B. X. Pharmacology experimental methodology. , People's Medical Publishing House Co. Ltd. (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
- Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383(2020).
- Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527(2021).
- Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779(2018).
- Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402(2023).
- Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
- Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302(2019).
- Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395(2017).
- Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111(2024).
- Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
- Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
- Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757(2024).
- Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612(2022).
- Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
- Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870(2023).
- Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25(2023).
- Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046(2024).
- ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
- Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326(2022).
- Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
- Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
- Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
- Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508(2022).
重印与许可
