完整 果蝇 幼虫中的激光细胞消融揭示了突触竞争

激光消融是解剖各种生物体神经回路的首选工具。它在蠕虫和苍蝇等模型遗传系统中开发，已应用于整个动物王国，以研究神经系统的结构、功能和发育 ^1,2,3。在这里，采用单神经元消融来研究神经元在果蝇回路组装过程中如何相互作用。果蝇的逃逸系统是最受欢迎的分析回路，因为它包含成年果蝇中最大的神经元和最大的突触，并且该回路在过去几十年中得到了很好的表征⁴。神经元-神经元相互作用在 Giant Fiber 电路的组装中的作用是本研究的重点。

自 1960 年代 Hubel 和 Wiesel 的工作以来，一种相互作用一直是神经科学的焦点，即"突触竞争"^5,6。在该协议中，激光消融用于重新审视通过单细胞消融在果蝇巨纤维系统 （GFS） 中的竞争作用，在那里可能会发现该现象的分子基础。

由于各种原因，包括可视化目标神经元、消融方法的精度以及标本的存活率，对发育中的果蝇中的神经元进行消融一直很困难。为了克服 GFS 中的这些问题，使用 UAS/Gal4 系统⁷ 标记感兴趣的神经元，并使用双光子显微镜去除突触前巨纤维或突触后跳跃运动神经元 （TTMn）。

在这项研究中，为了确定相邻的双侧神经元在调整 GFS 中的突触连接和突触强度中的作用，在蛹发育前删除了双侧神经元对之一（突触前 GF 或突触后运动神经元）。在这个发育阶段，GF 轴突发生尚未完成⁸。然后检查成人突触回路的 GF 结构和功能，特别注意剩余 GF 的输出。

用于该方案的所有动物都属于黑腹果蝇物种。围绕该物种的使用不存在道德问题。开展这项工作不需要道德审查。材料表中列出了研究中使用的果蝇物种、试剂和设备的详细信息。

1. 培育 果蝇 并选择正确的幼虫阶段

1. 选择驱动待消融细胞表达的 Gal4 驱动系，并将其与 UAS-GFP 报告基因系重组或交叉。在 25 °C 的标准果蝇食物上饲养果蝇。
   注:对于巨纤维 （GF） 消融，R91H05-Gal4 或 A307-Gal4 与 UAS-GFP 重组。与 UAS-GFP 重组的 ShakB（致死）-GAL4 用于 TTMn 消融（参见 材料表）。
2. 选择已经开始从食物中出来并爬上食品瓶侧面的幼虫。这些幼虫处于游荡阶段，这是进行 GF 细胞消融的首选阶段。
   注意:消融可以在任何幼虫阶段进行。最后一个幼虫阶段对于操纵 GFS 的发育很重要，因为 GF 细胞体可以在大脑中很容易识别，但 GF 轴突在这个阶段还没有与其目标建立联系。

2. 准备^第 3 龄幼虫

注意:使用类似于 Burra 等人 ⁹ 的方法麻醉幼虫。为了缩短手术时间，一次只准备一只幼虫。短时间接触麻醉剂将提高实验动物的存活率¹⁰。

1. 准备一个带紧盖子的玻璃盘。在培养皿中放入一个棉球，在通风橱下，加入约 3-5 ml 乙醚（危险、易燃液体、实验服、手套、护目镜）。用盖子盖住盘子。
2. 从果蝇瓶中收集单个 3^龄 幼虫。在^{第 3 幼} 虫阶段，幼虫离开食物培养基并沿着食物瓶¹¹ 的侧面爬行。
   1. 确保幼虫仍在移动并且尚未开始形成蛹。静止并显示身体缩短的幼虫开始化蛹，不适合消融。用小画笔捡起幼虫。
      注意:^{第 3 个} 幼虫阶段在第二次蜕皮后开始，发育 72 小时（产卵后），持续到 25 °C 下饲养的果蝇在 120 小时形成蛹。
3. 将一只幼虫转移到一个小的敞口容器中。将容器放入装有乙醚的玻璃盘中，并盖紧盘子。打开玻璃皿时，请将其放在通气管下或通风橱中，以防止烟雾逸出。
   1. 每隔 30 秒，从培养皿中取出装有幼虫的盖子，并在解剖显微镜下检查幼虫的活动性。幼虫通常会在 1 分钟内固定。一旦口钩停止抽搐，幼虫就可以上马了。3 分钟后丢弃任何未完全固定的幼虫。
      注意:微量离心管的倒盖顶部（从管上取下盖子）可用作容器。

3. 将幼虫安装在载玻片上进行消融

1. 将麻醉的幼虫放在玻璃显微镜载玻片上。将幼虫浸入一滴昆虫盐水中;这将冲走一些可能粘附在幼虫上的食物残渣。
2. 在解剖显微镜下，用纸巾去除大部分盐水。将幼虫背侧朝上进行 GF 消融，或将腹侧朝上进行 TTMn 消融。慢慢地将玻璃盖玻片放到幼虫上。在盖玻片的侧面加入盐水，以填充载玻片和盖玻片之间的空间。
3. 对于 GF 消融术，在解剖显微镜上检查大脑在高倍率下的位置。确保大脑水平躺着，并且可以通过角质层看到。通常，大脑会被脂肪组织覆盖，使可视化和细胞消融变得不可能。
   1. 要移位覆盖大脑的任何脂肪组织，请用镊子对盖玻片施加轻微的压力，然后将盖玻片从一侧移动到另一侧。如果脂肪组织无法以这种方式从大脑中移走，请改用不同的幼虫。

4. 定位目标细胞

注意:用于本研究的多光子系统安装在正置显微镜上。使用系统特定的软件来控制采集和激光刺激设置。该系统配备了落射荧光光源来定位样品。物镜是水浸透镜，放大倍率为 25 倍，工作距离为 2 mm，NA 为 1.10。

1. 将样品放在多光子显微镜的载物台上，并使用 GFP 滤光片在落射荧光模式下定位样品。对于 GF 消融术，可以在大脑中识别细胞体，如图 1A、C、D 所示。对于 TTMn 消融，可以从腹侧神经索 （VNC） 的腹侧识别出一组四个细胞，如图 1A、B 所示。完成聚焦后，将单元格置于视野中心并切换到 2 光子模式。

5. 设置烧蚀参数

1. 调整激光设置和检测器增益，以使用 Galvano 扫描仪查看表达 GFP 的细胞。870 nm 的波长最适合可视化 GFP 信号。在视野中居中单元格。
2. 使用圆形感兴趣区域 （ROI） 定义烧蚀区域。确保 ROI 覆盖细胞的大部分表面（图 1E，G）。
3. 在软件中设置消融方案。设置一个采集帧，然后是 Stimation，然后是另一个采集帧。
4. 以较低的值 （10%-20%） 开始刺激激光功率设置并运行刺激协议。成功的消融可以通过 ROI 位置的细胞胞体中心的透明圆圈和 ROI 周围荧光的增加来识别（图 1F）。
   1. 如果消融不成功，只是漂白了细胞（图 1H），则以 5% 的增量或一次一个循环的数量增加激光功率，然后再次运行该协议。对于方案中使用的系统，施加的激光功率在 10% 到 40% 之间。
      注:消融的激光功率设置在很大程度上取决于细胞在组织中的定位深度和其他因素，例如角质层折叠。如果细胞明亮且清晰可见，则激光功率将处于范围的下限。每个系统的激光功率会有所不同，具体取决于激光器型号和激光器的使用年限。

图 1:在完整的 果蝇 L3 幼虫中鉴定用于激光消融的神经元。 （A） 大脑中巨纤维 （GF） 胞体的位置示意图，以及腹侧神经索 （VNC） 中含有尾转子运动神经元 （TTMn） 的运动神经元簇。（B） shakB（致死）-Gal4 驱动 GFP 在幼虫 VNC 中表达的最大强度投影。中线由虚线表示。圆圈表示包含激光消融靶向 TTMn 的神经元簇。比例尺:50 μm。（C） 在 A307-Gal4 控制下表达 GFP 的幼虫脑的部分投影视图。圆圈表示激光消融靶向的 GF 胞体。比例尺:50 μm。（D） R91H05-Gal4 驱动 UAS-GFP 的大脑最大强度投影。两个 GF（圆圈）都可以通过位置、形状和大小来识别。比例尺:50 μm。（E） 激光消融前的 GF 胞体放大视图。洋红色圆圈表示激光烧蚀的目标区域。比例尺:10 μm。（F） 提供局部激光功率并成功消融后的 GF 胞体放大视图。比例尺:10 μm。（G） 激光消融前 GF 胞体放大视图。洋红色圆圈表示激光烧蚀的目标区域。比例尺:10 μm。（H） 在提供局部激光功率和不成功的消融（漂白）后 GF 胞体放大视图。比例尺:10 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

6. 恢复幼虫

1. 成功消融细胞后，取下盖玻片，用画笔轻轻地从载玻片上拾取幼虫。将幼虫放入食品小瓶中。幼虫将在 30 分钟内再次开始爬行。
   注意:保持较短的手术时间可以提高动物的存活率。根据经验，实验可以在不到 10 分钟的时间内完成。
2. 在标准条件下继续饲养幼虫，直到它们从蛹壳中闭合。

7. 测试 GFS 在成年果蝇中的功能

注:以下步骤在 Allan 和 Godenschwege¹² 以及 Augustin 等人 ¹³ 中进行了详细解释。

1. 在羽化后 2-5 天测试成蝇。用 CO₂ 麻醉苍蝇，并通过将腿推入蜡中将它们固定在牙蜡上。将翅膀以 90° 角展开并用蜡将它们固定到位。通过将喙推入耳垢中来固定头部。
2. 将刺激线放入双眼，将地线插入腹部，并将玻璃记录电极放入两侧的跳跃肌 （TTM） 中。
3. 用单一刺激刺激 GF 回路，以测量两块肌肉的反应潜伏期。分别用 100 Hz 和 200 Hz 的刺激序列刺激电路，以测量两块肌肉的后续频率。

8. 用于共聚焦成像的巨型纤维系统的解剖和标记

注意:苍蝇 CNS 解剖和染料注射在 Boerner 和 Godenschwege¹⁴ 中详细介绍。

1. 用镊子轻轻地从牙蜡上去除果蝇，然后在解剖镜下将其转移到硅胶弹性体衬里的培养皿中。
2. 用剪刀去除腿、翅膀和长鼻，并使用昆虫别针将苍蝇背面向上固定在弹性体涂层中。
3. 从中腹部沿中线做一个侧切口，穿过整个胸部，然后向上延伸到颈部，将胸部连接到头部。用昆虫针打开苍蝇。在不损害神经系统的情况下从果蝇身上去除器官和腺体。
   注意:此时，可以注射染料 GF 轴突以标记 GF 和电偶联神经元¹³。
4. 从头部取下头囊，露出大脑。

9. 神经系统的免疫组化

1. CNS 解剖后，在室温 （RT） 下将果蝇固定在 PBS 中的 4% PFA 中 45 分钟。在 RT 下在 PBS 中洗涤 20 分钟（3 次）。
2. 在 RT 下，在 PBS 中的 3% BSA 和 0.5% 去污剂溶液中封闭样品 1 小时。
3. 在 4 °C 下，在 3% BSA 的 PBS 溶液中，含 0.3% 洗涤剂溶液和兔抗 GFP （1:500） 孵育 2-3 晚。在 RT 下在 PBS 中洗涤 20 分钟（6 次）。
4. 在 4 °C 下用抗兔 Alexa 488 在 PBS 中孵育过夜。在 RT 下在 PBS 中洗涤 20 分钟（6 次）。
5. 用递增的乙醇系列（50%、70%、90%、100% 乙醇）脱水样品，每步 10 分钟。取下销钉并修剪腹部和飞行肌肉。将包含神经系统的胸部的其余部分转移到载玻片上，并用水杨酸甲酯等安装介质覆盖。将盖玻片放在样品上并用指甲油密封。
6. 在共聚焦显微镜上对神经系统进行成像，以分析 GF 末端的解剖结构。

该方法可用于操纵 果蝇神经系统中特定神经元网络的发育。这里的主要研究问题是突触连接的形成。去除突触前 GF 或突触后 TTMn 能够研究该中央突触的反应性突触发生以及对突触功能和发育至关重要的分子机制。如方案中所述，对其中一个 GF 或其中一个 TTMns 进行了激光细胞消融，并分析了成年果蝇蛹发育后对突触的影响。

为确保该程序不会对动物生存产生负面影响，模拟消融术同时进行。对于模拟消融，动物的处理方式与实验动物相同，但激光脉冲的激光功率为 0%。在 82.4% 的情况下，模拟消融的动物发育成成年果蝇。模拟消融果蝇的 GF 能够以低于 1 毫秒的潜伏期做出反应，并在 100% 的刺激下遵循 79.3 Hz 的刺激。GF 解剖结构与未经治疗的果蝇没有区别。

对于每只实验动物，都进行了解剖学验证消融。在 GF 消融的动物中，未消融的 GF 被染料注射并成像（见下文）。如果在宫颈结缔术 （CvC） 中只有一个 GF 轴突可见，则假定另一个 GF 消融。也可以通过大脑消融侧不存在 GFP 标记的胞体来验证消融（图 2A，圆圈）。为了评估 TTMn 消融，分析了成人 VNC 中的 GFP 信号，其中 TTMn 胞体和树突很容易识别。由于缺少胞体和树突，一侧没有 TTMn 很容易识别（图 2B，圆圈）。

为了测试受治疗果蝇中 GFS 的功能，记录了由 TTMn 支配的跳跃肌肉 12,13 的突触电位（图 3A）。GF 与 TTMn 内侧树突15 形成混合电化学突触。GF 末端是无支链的，并在突触区域显示出与 TTMn 树突相对的典型横向弯曲（图 3D，图 4A 箭头）。在对照果蝇中，每个 GF 仅支配其同侧运动神经元。在来自 TTM 纤维的记录中，通过分析 1 Hz 刺激下的响应潜伏期和 100 Hz 刺激下的后续频率来评估连接强度（图 3B、C）。对照果蝇的平均响应潜伏期小于 1 毫秒，并且可以在 100 Hz 刺激后获得 78.1% 的刺激（图 3B）。进行生理记录后，解剖标本以显示 CNS 和 GF，它们被染料注射了 TRITC-葡聚糖和神经生物素的混合物。大的葡聚糖分子标记 GF 轴突和末端，但不通过间隙连接。神经生物素可以穿过 GF 和 TTMn 之间的间隙连接，并且在突触后树突中检测到神经生物素信号（图 3E，F，箭头）。这种 Neurobiotin 染料偶联证实了两个神经元之间的电耦合。神经生物素也可以在 VNC 中的许多其他神经元中检测到，这些神经元通过间隙连接连接到 GF16（图 3E，F）。

在 L3 中消融 1 个 GF 后进行相同的生理和解剖测试。消融果蝇中大多数 （13/15） 剩余 GF 的轴突显示末端分裂为两个分支:一个在通常的同侧位置，另一个穿过中线到完整 GF 对侧的同源位置（图 3G，箭头）。每个分支都染料偶联到一个 TTMn 树突上（图 3H，I，箭头）。来自 TTM 的生理记录证实了一个 GF 与两个 TTMn 的这种突触连接，尽管比正常情况更弱。两侧的 TTM 响应潜伏期都大于 1 毫秒，在 100 Hz 时的以下频率为完整 GF 同侧 TTMn 的 37.1% 和对侧 TTM 的 28%（图 3C）。

由于一个 GF 的消融导致剩余的 GF 支配两个目标神经元，因此下一个实验旨在观察当一个 GF 缺乏正常的同侧目标运动神经元时相邻 GF 的反应。在这个实验中，一个突触后神经元被删除，并评估了剩余 TTMn 的解剖和功能以及 GF 末端的形态。当在成年对照动物中可视化 TTMns 和 GFs 时，假定的突触接触区域清晰可见（图 4A，箭头）。每个 TTMn 内侧树突都贴近同侧 GF 突触前末梢。来自两侧的 TTMn 树突的小突起接触中线（图 4C;插图）。染料与神经生物素的偶联在两个 TTMn 中都明显可见（图 4D，箭头）。

当一个 TTMn 消融时，剩余的 TTMn 内侧树突的形态发生了变化。这些标本中的内侧树突在中线上延伸出一根长而粗的分支（图 4I，K;黄色箭头）。此外，朝向两个 GF 末端的较薄的突起向前延伸（图 4E，G;黄色箭头）。GF 位于 TTMn 的同侧，显示出其通常的解剖结构，末端沿 TTMn 树突突出。

缺乏目标运动神经元的 "孤儿" GF 的反应是主要感兴趣的。在大多数情况下 （61.5% 的动物），孤立的 GF 表现出一个分裂的末端，一个末端位于同侧，另一个末端穿过中线并突出到对侧 TTMn 树突（图 4J，箭头）。当相邻的 GF 被消融时，GF 的这些交叉分支总是比在互补实验中看到的要小（图 3F）。同侧末端接触延伸到中线的 TTMn 分支（图 4I，黄色箭头）。在 23% 的标本中，孤立的 GF 越过中线（图 4F，箭头）并沿 TTMn 前支之一投影（图 4E，黄色箭头）并与剩余的 TTMn 染料偶联（图 4H，箭头）。

在 TTMn 消融果蝇中观察到另外两种表型 （图 4M）。在 13 只果蝇中的一只中，两个 GF 都正常弯曲并保持在神经系统各自的一侧。在另一种情况下，孤立的 GF 表现出 bendless 表型，其中孤立的 GF 没有形成末端，并在它通常弯曲的区域之前停止。对于所有四种表型，完整 TTMn 一侧的 TTM 记录与野生型 （WT） 生理学相当，响应潜伏期低于 1 毫秒，并在 100 Hz 下以 100% 或接近 100% 的频率跟随。删除一个目标可以允许两个 GF 共享剩余的目标 TTMn。在大多数情况下，两个 GF 都将与剩余的 TTMn 建立连接。通常，孤立的 GF 会表现出双侧末端。在对照苍蝇中，GF 永远不会越过中线;然而，在大约 85% 的 TTMn 消融果蝇中，一个 GF 越过中线接触对侧 TTMn。两个 GF 对一个 TTMn 的神经支配不会对突触功能产生负面影响。

值得注意的是，相邻 GF 的缺失比目标运动神经元的缺失具有更大的影响。在没有对侧 GF 的情况下形成的双侧末端比移除靶区时的变化大得多，功能更明显。

图 2:成虫 CNS 成功消融的例子。 （A） 幼虫 GF 消融后成年果蝇大脑的最大强度投影。GFP（绿色）由 A307-GAL4 驱动。圆圈表示消融 GF 缺失的区域。箭头指向大脑另一侧表达 GFP 的剩余 GF。GF 填充了 TRITC-Dextran（红色）。轴突向后向 VNC 突出。比例尺:20 μm。（B） 在 L3 中消融一个 TTMn 的成人 VNC 的最大强度投影。剩余的 TTMn（箭头）在 shakB（致命）驱动器下表达 GFP。缺失的 TTMn 区域由圆圈表示。比例尺:20 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:一根巨纤维 （GF） 的幼虫消融导致剩余 GF 的突触前末梢双侧分支。（A） 测试成体巨纤维系统 （GFS） 结构和功能的实验装置示意图。在刺激完整动物的大脑时，记录电极测量胎大旋颂肌 （TTM） 的潜伏期和后续频率。神经系统解剖后，将染料注射到宫颈结缔术 （CvC） 处的 GF 轴突中。（B，C）100 Hz 时 TTM 响应延迟和跟随频率的样本轨迹（n 表示从每种情况下记录的 TTM 数量，并显示平均延迟和跟随频率）。（B） 具有两个完整 GF 的对照动物显示 TTM 潜伏期低于 1 毫秒，并且在 100 Hz 时频率接近 100%。（C） 消融动物中剩余的单个 GF 支配两个 TTMns。两个 TTMn 的潜伏期都比对照组长，并且在 100 Hz 后，频率显着降低。（D-I）共聚焦图像堆栈的最大强度投影用于染料填充的 GF。TRITC-葡聚糖（红色的 D、G、F、I）和神经生物素（灰色的 E、H、F、I）共同注射。神经生物素可以穿过 GF 和 TTMn 之间的间隙连接，标记突触后神经元。虚线表示中线。（D） 具有末端弯曲的对照动物的典型 GF 解剖结构。（东、女）神经生物素标记许多与 GF 电偶联的突触后神经元。反式突触标记的 TTMn 树突由箭头表示。（G） 消融后，剩余的 GF 长出一个额外的末端（箭头），它穿过中线支配对侧的 TTMn。（H，I） 两个 TTMn（箭头）都染料偶联到同一个 GF 上。比例尺:20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4.一个尾转子运动神经元 （TTMn） 的幼虫消融导致两个巨纤维 （GF） 对剩余 TTMn 的神经支配。（A-L）在 shakB（致死）-Gal4 的控制下，用 GFP（绿色）标记的 TTMns 的共聚焦图像堆栈的最大强度投影，并且 GF 是充满 TRITC-葡聚糖（品红色）和神经生物素（红色）的染料。虚线表示神经系统的中线。（A-D）两个 TTMns 完整的对照样品。GF 使其典型的末端从中线弯曲以接触 TTMn （A，B），每个 GF 接触一个 TTMn。TTMn 树突在中线 （C） 相遇。每个 GF 都与其 TTMn（D，白色箭头）偶联。（E-H）左侧 TTMn 消融。其余 TTMn 的内侧树突沿中线突出（G，黄色箭头）。孤立的 GF 穿过突触区域的中线（白色箭头）并接触对侧 TTMn 树突 （E，F）。GF 与剩余的 TTMn （H，箭头） 偶联。（I-L）左侧 TTMn 消融的另一种 GF 表型示例。其余 TTMn 的内侧树突沿中线突出（I 和 K，黄色箭头）。左侧孤立的 GF 成为双侧末端;一个分支向对侧突出，另一个保持同侧（J，箭头）以连接到 TTMn。比例尺:20 μm。（M） 在 TTMn 消融动物中观察到的四种不同 GF 表型的示意图。n 表示每个类别中的动物数量。给出的是完整 TTMn 一侧在 100 Hz 处 TTM 响应延迟和跟随频率 （FF） 的标准误差平均值。请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可披露的。