本方案展示了在完整的Drosophila幼虫中对单个神经元进行激光细胞消融的技术。该方法可用于研究在发育中的神经系统中降低神经元之间竞争所产生的影响。
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摘要
摘要
该方案描述了在完整中枢神经系统（CNS）中利用双光子激光系统进行单个神经元消融的方法 黑腹果蝇 幼虫。利用这种非侵入性方法，可实现对发育中神经系统的细胞特异性操控。通过破坏神经网络中单个神经元的发育，可用于研究神经系统如何补偿突触输入的缺失。在巨大纤维系统中对单个神经元进行特异性消融 果蝇，重点关注两个神经元：突触前的巨纤维（GF）和突触后的胸-转节肌运动神经元（TTMn）。GF与同侧的TTMn形成突触连接，该连接对逃逸反应至关重要。在3龄幼虫中消融其中一个GFrd 在幼虫脑中，当巨纤维（GF）刚开始轴突生长时，永久性地移除该细胞，会导致中枢神经系统（CNS）发育过程中该细胞缺失。剩余的GF对缺失的邻近细胞产生反应，并向对侧TTMn形成异位突触终末。这种非典型的、双侧对称的突触终末通过染料偶联实验被证实可同时支配双侧TTMn，并通过电生理检测证实可同时激活两个运动神经元。综上所述，单个中间神经元的消融揭示了双侧成对神经元之间的突触竞争，这些神经元能够补偿其中一个神经元的缺失，并恢复逃逸环路中的正常反应。
引言
激光消融是研究多种生物神经回路的首选工具。该技术最初在蠕虫和果蝇等模式遗传系统中发展起来，现已广泛应用于动物界，以研究神经系统的结构、功能和发育过程1,2,3。本文采用单个神经元消融技术，探究神经元在果蝇神经回路组装过程中如何相互作用。Drosophila的逃逸系统是常用的回路分析模型，因其包含成年果蝇中最大的神经元和最大的突触，且该回路在过去的几十年中已被深入表征4。本研究的重点是神经元间相互作用在巨纤维回路组装中所起的作用。
自20世纪60年代Hubel和Wiesel的研究以来，神经科学领域一直关注的一种相互作用是 "突触竞争"5,6在本方案中，采用激光消融技术，通过巨大纤维系统（GFS）中的单细胞消融重新探讨竞争的作用。 果蝇，可能在其中发现这些现象的分子基础。
在发育中的果蝇中消融神经元一直存在多种困难，包括难以观察目标神经元、消融方法的精确性以及样本的存活率。为了解决GFS中的这些问题，采用UAS/Gal4系统7来标记目标神经元，并利用双光子显微镜去除突触前的巨纤维或突触后的跳跃运动神经元（TTMn）。
在本研究中，为了确定邻近的双侧神经元在调节巨纤维系统（GFS）中的突触连接性和突触强度方面所起的作用，在蛹发育阶段开始前选择性地删除了一侧的双侧配对神经元（即突触前巨纤维（GF）或突触后运动神经元）。在此发育阶段，GF轴突的发生尚未完成8。随后检测成虫中突触回路的GF结构与功能，尤其关注剩余GF的输出情况。
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方案
所有用于本方案的动物均为该物种 黑腹果蝇. 该物种的使用不存在伦理问题，开展本研究无需获得伦理审批。相关细节如下 果蝇 研究中使用的物种、试剂和设备均列于下文 材料表.
1. 繁殖 果蝇 并选择正确的幼虫阶段
- 选择一种Gal4驱动品系，使其在待消融的细胞中表达，并将其与UAS-GFP报告品系进行重组或杂交。将果蝇饲养于标准果蝇培养基中，25 °C条件下培养。
注意：对于巨纤维（GF）消融，使用R91H05-Gal4或A307-Gal4与UAS-GFP重组；TTMn消融则采用ShakB(lethal)-GAL4与UAS-GFP重组（见材料表）。 - 挑选已开始从培养基中钻出并沿培养管壁爬行的幼虫。此类幼虫处于游走期，是进行GF细胞消融的理想阶段。
注意：消融可在任何幼虫阶段进行。末龄幼虫阶段对巨纤维系统（GFS）发育操作尤为重要，因为此阶段GF细胞体在脑中易于识别，而GF轴突尚未与靶细胞建立连接。
2. 准备3龄幼虫
注意：幼虫麻醉采用与 Burra 等人类似的方法9。为缩短操作时间，每次仅处理一只幼虫。短暂接触麻醉剂有助于提高实验动物的存活率10。
- 准备一个带紧密盖子的玻璃培养皿。在培养皿中放入一个棉球，在通风橱内加入约3-5 ml乙醚（危险、易燃液体，需穿实验服、戴手套和护目镜）。用盖子盖好培养皿。
- 收集单个 3rd 来自果蝇培养瓶的龄期幼虫。在第3龄rd 幼虫期，幼虫离开食物培养基并沿食物管壁向上爬行11.
- 确保幼虫仍在活动，尚未开始化蛹。身体静止且出现缩短现象的幼虫已开始化蛹，不适合用于消融实验。使用小号画笔轻轻挑取幼虫。
注意：3rd 幼虫阶段始于孵化后72小时（产卵后）的第二次蜕皮，持续至120小时蛹壳形成，适用于在指定条件下培养的果蝇 25 °C.
- 确保幼虫仍在活动，尚未开始化蛹。身体静止且出现缩短现象的幼虫已开始化蛹，不适合用于消融实验。使用小号画笔轻轻挑取幼虫。
- 将一条幼虫转移至一个小型敞口容器中，将容器放入盛有乙醚的玻璃培养皿内，并紧密盖上皿盖。打开玻璃培养皿时，应将其置于通风罩或排风罩下方，以防止乙醚蒸气逸出。
- 每隔30秒，将带有幼虫的盖子从培养皿中取出，在解剖显微镜下检查幼虫的活动能力。幼虫通常在1分钟内被完全固定。当口钩停止抽动时，幼虫即可用于制片。若幼虫在3分钟后仍未完全固定，应予以弃用。
注意：可将微型离心管倒置的管盖顶部（管盖已从管体移除）用作容器。
- 每隔30秒，将带有幼虫的盖子从培养皿中取出，在解剖显微镜下检查幼虫的活动能力。幼虫通常在1分钟内被完全固定。当口钩停止抽动时，幼虫即可用于制片。若幼虫在3分钟后仍未完全固定，应予以弃用。
3. 用于消融的幼虫载玻片制备
- 将麻醉后的幼虫置于玻璃载玻片上。用一滴昆虫生理盐水浸没幼虫，以冲洗掉可能附着在幼虫体表的食物残渣。
- 在解剖显微镜下，用纸巾吸去大部分生理盐水。将幼虫背面向上放置用于巨纤维（GF）消融，或腹面向上放置用于胸突运动神经元（TTMn）消融。缓慢将玻璃盖玻片压在幼虫上。从盖玻片边缘加入生理盐水，使载玻片与盖玻片之间的空隙充满液体。
- 进行巨纤维（GF）消融时，在解剖显微镜的高倍镜下检查脑部位置。确保脑组织平展且可通过体壁清晰观察。通常脑部会被脂肪组织覆盖，导致无法观察和进行细胞消融。
- 若脑部被脂肪组织覆盖，可用镊子轻轻按压盖玻片，并左右移动盖玻片以移开脂肪组织。若无法通过此方法清除脑部覆盖的脂肪组织，则应更换另一只幼虫。
4. 定位靶细胞
注意：本研究使用的多光子系统安装在直立显微镜上。使用系统专用软件控制图像采集和激光刺激参数。该系统配备落射荧光光源，用于定位样品。物镜为水浸式物镜，放大倍数为25倍，工作距离长达2 mm，数值孔径（NA）为1.10。
- 将样品置于多光子显微镜的载物台上，使用GFP滤光片在落射荧光模式下定位样品。对于GF消融，可在脑部识别细胞体，如图1A、C、D所示。对于TTMn消融，可从腹侧在腹神经索（VNC）中识别出由四个细胞组成的细胞簇，如图1A、B所示。聚焦完成后，将细胞置于视野中央，并切换至双光子模式。
5. 设置消融参数
- 调整激光设置和检测器增益，使用伽伐尼扫描镜观察表达 GFP 的细胞。870 nm 的波长最适用于观察 GFP 信号。将细胞置于视野中央。
- 使用圆形兴趣区域（ROI）定义消融区域。确保 ROI 覆盖细胞表面的大部分区域（图 1E、G）。
- 在软件中设置消融程序。设置一帧图像采集，随后进行刺激，再进行另一帧图像采集。
- 将刺激激光功率从较低值开始设置（10%–20%），然后运行刺激程序。成功的消融可在细胞胞体中心的 ROI 位置观察到一个清晰的圆形区域，并且 ROI 周围荧光增强（图 1F）。
- 如果消融未成功，仅导致细胞漂白（图 1H），则每次将激光功率增加 5% 或循环次数增加 1 次，然后重新运行程序。本方案所用系统的激光功率范围为 10% 至 40%。
注意：消融所需的激光功率设置在很大程度上取决于细胞在组织中的深度以及其他因素（如角质层折叠情况）。若细胞明亮且清晰可见，则所需激光功率处于该范围的较低端。不同系统因激光器型号和使用年限不同，其所需激光功率也会有所差异。
- 如果消融未成功，仅导致细胞漂白（图 1H），则每次将激光功率增加 5% 或循环次数增加 1 次，然后重新运行程序。本方案所用系统的激光功率范围为 10% 至 40%。
图1：在完整生物体中鉴定用于激光消融的神经元 果蝇 L3期幼虫 (A) 脑内巨大纤维（GF）胞体位置及腹神经索（VNC）内包含胸-转节肌运动神经元（TTMn）的运动神经元簇的示意图。BshakB（致死型）-Gal4 驱动 GFP 在幼虫腹神经索中表达的最大强度投影。虚线表示中线。圆圈标示包含TTMn并作为激光消融靶点的神经元簇。比例尺： 50 µm. (C) 在 A307-Gal4 驱动下表达 GFP 的幼虫大脑部分投射图。圆圈指示的是靶向激光消融的 GF 胞体。比例尺： 50 µm. (D) R91H05-Gal4 驱动 UAS-GFP 的脑部最大强度投影。两个GF（圆圈）均可通过位置、形状和大小进行识别。比例尺： 50 µm. (E) GF胞体激光消融前的放大视图。品红色圆圈指示激光消融的目标区域。比例尺： 10 µm. (F) 激光局部照射并成功消融后，GF 胞体的放大视图。比例尺： 10 µm. (G) GF胞体激光消融前的放大视图。品红色圆圈指示激光消融的目标区域。比例尺： 10 µm. (H) GF胞体在局部激光照射后未成功消融（漂白）的放大视图。比例尺： 10 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
6. 回收幼虫
- 成功消融细胞后，取下盖玻片，用画笔轻轻将幼虫从载玻片上拾起，放入食物管中。幼虫将在30分钟内重新开始爬行。
注意：缩短操作时间可提高动物的存活率。熟练后，实验可在不到10分钟内完成。 - 在标准条件下继续培养幼虫，直至其从蛹壳中羽化。
7. 在成年果蝇中测试GFS的功能性
注意：以下步骤在Allan和Godenschwege12以及Augustin等13的研究中已有详细说明。
- 在羽化后2-5天对成年果蝇进行测试。用CO2麻醉果蝇，并通过将足插入牙科蜡中将其固定。将翅膀展开至90°角，并用蜡固定。通过将喙插入蜡中固定头部。
- 将刺激电极插入两只眼睛，接地电极插入腹部，并将玻璃记录电极插入两侧的跳跃肌肉（TTMs）。
- 使用单次刺激激活GF神经回路，以测量两侧肌肉的反应潜伏期。分别使用100 Hz和200 Hz的刺激串激活该回路，以测量两侧肌肉的跟随频率能力。
8. 巨大纤维系统的解剖与标记，用于共聚焦成像
注意：果蝇中枢神经系统解剖和染料注射步骤详见 Boerner 和 Godenschwege14。
- 用镊子轻轻将果蝇从牙科蜡上取下，并在解剖显微镜下转移至铺有硅胶弹性体的培养皿中。
- 用剪刀去除果蝇的足、翅和喙，并用昆虫针将果蝇背面向上固定在弹性体涂层上。
- 从腹部中段开始，沿中线向头颈部方向做一侧切口，贯穿整个胸部并延伸至颈部，使胸部与头部相连。用昆虫针将果蝇展开，去除体内的器官和腺体，注意不要损伤神经系统。
注意：此时可向巨纤维（GF）轴突注射染料，以标记巨纤维及其电耦合的神经元13。 - 去除头部的头壳，暴露脑组织。
9. 神经系统的免疫组织化学
- 中枢神经系统解剖后，在室温下用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定果蝇45分钟，随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗3次。
- 在含3%牛血清白蛋白（BSA）和0.5%去污剂的PBS溶液中，于室温下封闭样本1小时。
- 在含3% BSA和0.3%去污剂的PBS溶液中，加入兔抗GFP抗体（1:500），于4 °C孵育2至3个夜晚。随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗6次。
- 在PBS中加入Alexa 488标记的抗兔二抗，于4 °C孵育过夜。随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗6次。
- 使用递增浓度的乙醇系列（50%、70%、90%、100%乙醇）对样本进行脱水处理，每步10分钟。移除固定针，并切除腹部和飞行肌。将包含神经系统的胸段其余部分转移至载玻片上，用甲基水杨酸酯等封片剂覆盖，加盖盖玻片，并用指甲油封片。
- 使用共聚焦显微镜对神经系统成像，以分析巨纤维（GF）末端的解剖结构。
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结果
该方法可用于操控果蝇（Drosophila）神经系统中特定神经元网络的发育。本研究的核心问题是突触连接的形成。通过去除突触前的GF神经元或突触后的TTMn神经元，可研究该中枢突触的反应性突触发生过程，以及对突触功能和发育至关重要的分子机制。如实验方案所述，对其中一个GF神经元或一个TTMn神经元进行激光消融，随后分析果蝇在蛹发育阶段结束后成虫中突触的变化情况。
为确保该操作对动物存活无负面影响，同时进行了假手术消融对照实验。在假手术消融中，动物的处理方式与实验组动物相同，但激光脉冲的输出功率设置为0%。在82.4%的情况下，接受假手术消融的动物能够发育为成年果蝇。假手术消融果蝇的巨纤维（GF）能够以低于1 ms的潜伏期作出反应，并对79.3%的刺激实现100 Hz频率的跟随。其巨纤维的解剖结构与未经处理的果蝇无差异。
对于每只实验动物，均通过解剖学方法验证消融效果。在消融了巨纤维（GF）的动物中，对未消融的GF进行染料注射并成像（见下文）。若在颈连合（CvC）中仅观察到一条GF轴突，则认为另一侧GF已成功消融...
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讨论
使用双光子显微镜进行细胞消融被证明是一种高效调控果蝇（Drosophila）神经环路发育的方法。由于该方法具有非侵入性，对动物造成的损伤极小。实验数据支持这种针对已知神经环路的细胞特异性操控具有良好的应用价值。
消融成功的关键在于选择最合适的Gal4驱动系。由于巨纤维系统（GFS）已被广泛研究，已有多种特异性的Gal4驱动品系被报道7。大多数Gal4驱动表达范围非常局限，但仍会在许多其他神经元中表达。一个挑战是在完整动物体内可靠地识别靶细胞。对于GFP标记清晰可见的个体，可在较低激光功率下进行消融，通常仅需一次尝试即可完成。而在脑部被脂肪组织覆盖或GFP表达较弱的个体中，靶细胞的清除则需要更高的激光功率，并进行多次激光照射循环。巨纤维（GF）细胞体位于大脑背侧约100 µm深度处。对于靶细胞位置更深的实验，可在幼虫发育早期阶段进行消融，此时神经系统体积较小，可能更为有利。
在实验室先前的实验中，探索了不同的细胞消融方法。利用UAS/Gal4系统驱动毒素表达也可导...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
在FAU Stiles-Nicholson脑科学研究所高级细胞成像中心的双光子显微镜上进行了实验。我们感谢朱庇特生命科学倡议提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| 抗绿色荧光蛋白，兔源抗体 | 赛默飞世尔科技 | A11122 | 1:500 浓度 |
| Apo LWD 25x/1.10W 水浸长工作距离物镜 | 尼康 | MRD77220 | 水浸长工作距离 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | 西格玛 | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II 激光器 | Coherent | ||
| 棉球 | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, 四甲基罗丹明, 10,000 MW, 赖氨酸可固定 (fluoro-Ruby) | 赛默飞世尔科技 | D1817 | |
| 果蝇生理盐水 | 配方来自 Gu 和 O'Dowd, 2006 | ||
| 乙醚 | 赛默飞世尔科技 | E134-1 | 危险，易燃液体 |
| 果蝇食物 B (布卢明顿配方) | LabExpress | 7001-NV | |
| 水杨酸甲酯 | 赛默飞世尔科技 | O3695-500 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 22363204 | |
| 显微镜盖玻片 18x18 #1.5 | 赛默飞世尔科技 | 12-541A | |
| Neurobiotin 示踪剂 | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R 多光子显微镜 | 尼康 | 安装于直立式 FN1 显微镜支架上 | |
| NIS Elements 高级研究软件 | 尼康 | 图像采集与数据分析软件 | |
| 多聚甲醛 (PFA) | 赛默飞世尔科技 | T353-500 | |
| PBS (磷酸盐缓冲盐水) | 赛默飞世尔生物试剂 | BP2944-100 | 片剂 |
| R91H05-Gal4 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 51633 | |
| Superfrost 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | 赛默飞世尔科技 | 422355000 | 去垢剂溶液 |
| UAS-10xGFP | 布卢明顿果蝇品系中心 | 32185 |
参考文献
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