多发性硬化症患者诱导多能干细胞来源的少突胶质前体细胞中铁死亡与缺氧相关基因的鉴定

摘要

本研究通过生物信息学分析，为缺氧、铁死亡和免疫浸润在多发性硬化症（MS）发病机制中的相互作用提供了新的见解。通过采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，我们鉴定了三个关键的枢纽基因（ITGB1、ITGB8 和 VIM）。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种以脱髓鞘为特征的慢性炎症性疾病，髓鞘再生失败导致慢性阶段出现进行性轴突丢失。少突胶质前体细胞（OPCs）对髓鞘再生至关重要。近期研究表明，缺氧和铁死亡均在OPCs功能异常分化过程中发挥关键作用。本研究旨在鉴定来源于多发性硬化症患者诱导性多能干细胞（iPSCs）的OPCs中与缺氧和铁死亡相关的关键基因及其免疫浸润特征，并围绕这些关键基因构建诊断模型。

我们分析了来自 GSE196575 和 GSE147315 数据集的基因表达数据，并将多发性硬化症（MS）患者与健康个体进行了比较。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），我们确定了与缺氧、铁死亡及 MS 相关的主要模块基因和关键基因。通过基因集变异分析（GSVA）计算的铁死亡 Z 分数和缺氧 Z 分数在 MS 患者的诱导多能干细胞来源的少突胶质前体细胞（iPSC-derived OPCs）中高于对照组。通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析发现，这些相关基因主要与 PI3K/Akt/mTOR 通路相关。

关键基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络揭示了10个核心枢纽基因（COL4A1、COL4A2、ITGB5、ITGB1、ITGB8、ITGAV、VIM、FLNA、VCL 和 SPARC）。该基因的强表达 ITGB1，ITGB8， 和 VIM 在GSE151306数据集中得到了验证，支持其作为关键枢纽基因的作用。此外，通过基于文本句子解析转录调控关系数据库（TRRUST）构建了转录因子（TFs）与枢纽基因之间的相互作用网络，鉴定了五个关键转录因子。本研究结果有助于阐明多发性硬化症（MS）的潜在新型生物标志物或治疗靶点。

引言

多发性硬化症（MS）是一种以脱髓鞘为特征的慢性炎症性疾病，全球约有250万人受其影响。大多数被诊断为MS的患者表现为复发-缓解型（RR）病程。在复发阶段，急性炎症不可避免地导致髓鞘和轴突的丧失。相反，在缓解期，脱髓鞘病灶可通过再髓鞘化得到修复，从而为轴突提供营养支持，并防止轴突进行性丢失¹。在MS的慢性阶段，再髓鞘化失败会导致轴突进行性变性²。

髓鞘再生过程与少突胶质前体细胞（OPCs）密切相关，涉及OPCs的增殖和迁移，并分化为成熟的少突胶质细胞（OLs），后者是中枢神经系统（CNS）中形成髓鞘的细胞³。在疾病早期阶段，OPCs在脱髓鞘病灶周围生成的新OLs数量相对保持完整，能够有效促进髓鞘再生⁴。然而，在多发性硬化（MS）晚期阶段，OPCs的迁移和分化能力不足，导致新OLs数量减少，髓鞘再生受损⁵，进而引起神经变性和功能障碍的累积。

目前提出了两种假说来解释多发性硬化症（MS）中的神经退行性变。外源性假说认为，由活化的T细胞引发的免疫反应导致脱髓鞘以及神经退行性变⁶。而内源性假说则认为，少突胶质前体细胞（OPCs）⁷、少突胶质细胞（OLs）⁸以及中枢神经系统（CNS）中其他细胞的内在异常可能参与了神经退行性变的发生。过去，内源性假说被认为仅适用于MS的较晚期阶段，例如原发性或继发性进展型MS（PPMS和SPMS）。然而，近期已在复发型-缓解型MS（RRMS）中观察到与炎症或复发无关的神经退行性变^9,10，提示内在的细胞异常可能在包括RRMS在内的所有疾病阶段均发挥作用。

此外，铁死亡（ferroptosis）是一种与铁介导的脂质代谢紊乱相关的独特细胞死亡通路，在神经退行性病变中发挥关键作用。该通路由过量铁引发的细胞内氧化还原状态失衡所驱动，导致脂质过氧化物积累和活性氧（ROS）的产生，最终引起氧化性细胞死亡¹¹。阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病通常起源于神经元细胞的氧化损伤，而这种损伤常由病灶区域内异常升高的铁浓度所触发。在多发性硬化症（MS）中，由于中枢神经系统细胞富含脂质且耗氧量高，其对氧化损伤的易感性增加，同时伴有线粒体功能障碍，从而促进脂质过氧化——这是铁死亡的关键因素。少突胶质细胞（OLs）对脂质过氧化高度敏感，这是铁死亡的重要特征之一¹²。脊髓炎症病灶周围铁的沉积¹³，以及少突胶质细胞对脂质过氧化¹⁴和自由基¹⁵的敏感性，凸显了多发性硬化症对铁死亡的易感性。

缺氧是多发性硬化症（MS）发病机制中的另一个关键因素，可导致少突胶质细胞丢失。急性MS病灶中存在类似缺氧性损伤的证据，以及活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的生成，表明此类应激因素可能引发线粒体功能障碍及继发的能量缺乏¹⁶。这种代谢应激不仅影响少突胶质细胞（OLs），还会通过破坏能量传递而损害邻近的轴突¹⁷，因为髓鞘内的通道可在髓鞘与轴周间隙之间传递能量。

中枢神经系统（CNS）中来自多发性硬化症（MS）患者的原代人少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）极难获取。因此，由诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来的入源性OPCs和OLs已成为研究MS内在病变的有力工具。鉴于铁死亡和缺氧在MS发病机制中的关键作用及其对少突胶质细胞谱系的影响，本研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）提取模块信息¹⁸，以阐明MS中与这些现象相关的基因表达模式。通过筛选基因间的相关系数，我们能够识别出相同或相似的共表达网络或模块，从而揭示MS新的生物标志物或潜在治疗靶点。此外，通过聚焦调控关键基因的转录因子（TFs），本研究为深入探索MS的发病机制及潜在干预策略奠定了基础。

方案

1. 数据下载与预处理

1. 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）下载数据集 GSE196575 和 GSE147315。
2. 使用在线分析平台（参见材料表）合并这两个数据集并去除批次效应。
   1. 选择表达模块 | 数据合并模块。上传两个表达矩阵文件作为输入文件，然后点击运行，系统将自动输出合并后的矩阵。
   2. 创建一个样本注释文件，以电子表格形式保存。
   3. 选择表达模块 | 去除批次效应模块。输入注释文件和合并后的矩阵，然后点击运行，生成已去除批次效应的合并矩阵（合并矩阵2）。
3. 使用在线分析平台提供的合并数据集、批次效应校正和标准化功能对表达数据进行标准化处理。选择表达模块和标准化模块，输入第1.2.3步中生成的合并矩阵2，然后点击运行按钮（参见材料表）。
4. 完成上述全部流程后输出表达矩阵文件。根据GEO网站提供的干预信息提取分组信息，并将上述信息输入一个".txt" 格式的文档中，以创建合并数据集的分组信息文件。

2. 差异表达基因分析

1. 使用 R 语言中的 limma 软件包进行差异基因表达分析。输入表达矩阵文件和分组信息文件。设置筛选标准为|logFC| = 1 和 p < 0.05，以鉴定与多发性硬化相关的差异表达基因（DEGs）。

3. 功能富集分析（GO 和 KEGG）

1. 通过在线平台的 GO 和 KEGG 模块对差异表达基因（DEGs）进行功能富集分析。
   1. 将模式生物设置为 Homo sapiens，背景基因文件使用 Ensemble_109 版本，数据类型选择基因为基因。
   2. 避免使用过于宽泛的 GO 术语；使用 ToppFun 进一步优化分析。应用筛选条件，将术语限制为最多关联 500 和 1,000 个基因。
      注：主文稿中展示的是 500 个基因筛选条件下的结果。完整的 GO 分析结果见补充图 S2。在线 KEGG 平台界面见补充图 S3。

4. 铁死亡与缺氧基因集变异分析（GSVA）

1. 从 FerrDb 获取总共 538 个铁死亡相关基因，从 MsigDB 获取 200 个缺氧相关基因。
2. 为这两个基因集创建 GMT 格式文件。
3. 使用 GSVA 模块计算合并数据集中每个样本的铁死亡 Z 值和缺氧 Z 值，并以 表达矩阵文件、分组信息文件 和 GMT 文件 作为输入。
4. 比较不同组之间的 Z 值（补充图 S4）。

5. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

1. 提取步骤 4.4 中计算的每个样本的铁死亡和缺氧 Z 分数。将上述铁死亡和缺氧的 Z 分数作为性状文件，与表达矩阵文件一起用于鉴定与铁死亡和缺氧相关的关键基因模块。
2. 使用 WGCNA 模块，设置 R² = 0.9 和 软阈值 β = 18，构建加权基因共表达网络。重点关注与铁死亡和缺氧均显著相关的模块（补充图 S4）。

6. 鉴定与多发性硬化症患者铁死亡和缺氧相关的差异表达基因

1. 通过在线分析平台上的维恩图工具，将疾病相关的差异表达基因（DEGs）与铁死亡和缺氧相关基因模块取交集（补充图S3），鉴定出在多发性硬化症（MS）中同时与铁死亡和缺氧相关的基因。

7. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析

1. 将交集基因输入 STRING 数据库的 Multiple Proteins 模块。
2. 将 organism 设置为 Homo sapiens，然后点击 Search。
3. 使用网页中央的 CONTINUE 选项生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
4. 以 TSV 格式导出相互作用网络信息，并将其导入生物信息学网络分析软件（Supplementary Figure S5）。
5. 使用 Cytohubba 插件基于 MCC 算法识别排名前 10 的枢纽基因。

8. 使用 GSE151306 数据集进行验证

1. 从 GEO 下载 GSE151306 数据集。
2. 在 R studio 软件中使用 limma 包（R 语言代码可在 GitHub 获取：https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS），验证不同组间枢纽基因的表达情况，并输入表达矩阵文件、验证集的分组文件以及枢纽基因列表。

9. 核心基因的 ROC 曲线绘制

1. 使用 R 语言中的 pROC 包绘制差异表达枢纽基因的 ROC 曲线。
2. 在验证数据集中验证这些枢纽基因的诊断价值（R 语言代码已在 GitHub 提供：https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS）。

10. 转录因子-枢纽基因调控网络的预测

1. 访问 TRRUST v2 数据库，网址为 https://www.grnpedia.org/trrust/。
2. 使用 为查询基因寻找关键调控因子 模块，识别调控 10 个枢纽基因的转录因子。
   1. 将 物种 设置为 Human。将转录因子和枢纽基因输入 STRING 的 Multiple Proteins 模块，将 organisms 设置为 Homo sapiens，然后点击 CONTINUE 以生成调控网络。

结果

包含四名健康个体作为对照组和九名多发性硬化症患者（PwMS）的合并数据集被分析，并在另一包含四名PwMS和四名健康对照的数据集中进行了验证。分析流程如图所示 图1, 所有样品的详细信息均列于下表 补充表 S1通过分析，共鉴定出706个差异表达基因（DEGs，p < 0.01）的基因中，与对照组相比，多发性硬化症患者中有378个基因表达上调，328个基因表达下调（图2）。功能富集分析揭示了这些差异表达基因在多种生物学过程中的显著参与。值得注意的是，经500个基因筛选出的最显著富集的GO条目包括黏着斑、细胞-基质连接、整合素介导的信号通路、整合素结合和钙黏蛋白结合（图3A- C）。KEGG 通路分析进一步揭示，这些基因主要参与 PI3K-Akt 信号通路和 Hippo 信号通路（图3D），这在与多发...

讨论

由于少突胶质前体细胞（OPC）在髓鞘再生过程中发挥关键作用，其迁移、分化和死亡长期以来被认为在多发性硬化症（MS）的发病机制中至关重要，并且是MS治疗的重要靶点。在所有三种类型的MS中均观察到与炎症无关的进行性神经变性¹⁹，且在脱髓鞘病灶中心发现少突胶质细胞显著减少²⁰，提示少突胶质细胞谱系的原发性功能障碍可能加速MS的进展。

本研究中，我们对来自多发性硬化症患者（PwMS）和健康对照的诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的少突前体细胞（OPCs）中与铁死亡和缺氧相关的基因进行了靶向mRNA序列的生物信息学分析，该分析基于来自四个数据集的整合数据 健康对照组和9例多发性硬化症患者（PwMS）。我们发现了706个差异表达基因（DEGs），其中378个上调，328个下调。进一步鉴定了铁死亡和缺氧相关基因，并通过计算各样本的Z分数，比较其在诱导多能干细胞分化而来的少突胶质前体细胞（iPSC-induced OPCs）中于多发性硬...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioInfoTools	/		在线分析网站 http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape	/		生物信息学网络分析软件
GSE196575、GSE147315 和 GSE151306	/		来自 GEO 数据集的 RNA-seq 数据
Omicshare	GENE DENOVO		在线分析工具 https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studio	RStudio, Inc		R 集成开发环境软件