此处，我们描述了一种 体外 分离与分化小鼠气道上皮细胞的模型，重点关注其对慢性香烟烟雾提取物（CSE）的适应性。该模型可用于全面表征CSE的多组学影响，从而可能揭示细胞在长期烟雾暴露下的应答机制。
本文内容
摘要
摘要
慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要归因于烟草烟雾暴露。研究气道上皮细胞如何在功能上适应烟草烟雾，对于理解COPD的发病机制至关重要。本研究旨在建立一种 体外 利用原代小鼠气道上皮细胞建立模型，以模拟烟草烟雾对机体的真实影响。与永生化细胞系不同，原代细胞保留了更多 体内类特性，包括生长模式、衰老和分化。这些细胞表现出敏感的炎症反应和高效的分化能力，因而能紧密模拟生理条件。在本模型中，原代小鼠气道上皮细胞在气液界面条件下培养28天，并使用最适浓度的香烟烟雾提取物（CSE）处理，导致未分化的单层细胞转变为假复层柱状上皮，提示细胞已适应CSE环境。随后采用综合性的多组学分析，以阐明CSE影响气道基底细胞分化的分子机制。这些发现加深了我们对烟草烟雾暴露下慢性阻塞性肺疾病（COPD）进展相关细胞过程的理解。
引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有复杂特征的异质性肺部疾病，而COPD患者的发病年龄正逐渐趋于年轻化1。吸烟是COPD的主要危险因素2，对气道上皮细胞具有深远影响，而气道上皮细胞是抵御烟草烟雾的第一道屏障。尽管已知这种关联，烟草烟雾诱导气道上皮细胞发生改变的具体机制仍缺乏充分研究。深入理解这些分子层面的改变，对于发现COPD的早期诊断标志物和治疗靶点至关重要。
为弥补这一空白，我们开发了一种利用小鼠气道上皮细胞的新型体外模型。通过长期用香烟烟雾提取物（CSE）刺激这些细胞，我们能够监测细胞的动态变化，探究气道上皮细胞在长期烟草刺激下的改变及其潜在机制。在该模型中，采用Transwell系统建立气道上皮细胞的气液界面，并从上皮细胞分化的早期阶段开始施加香烟烟雾提取物刺激，持续至第28天分化完成。以往的研究仅关注气道上皮细胞的分化过程及短期刺激（以细胞系为主），且局限于单一调控通路3,4,5,6。然而，本方案采用原代小鼠气道上皮细胞，并优化了细胞分离提取流程，使细胞活性优于既往的气道上皮细胞培养方法。该模型聚焦于细胞分化过程的改变，并结合转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表观基因组学的综合分析。通过免疫荧光染色和先进的多组学技术，我们旨在阐明气道上皮细胞对慢性烟草烟雾暴露的细胞应答，从而加深对慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制的理解。该模型可用于研究多种污染物长期刺激所引起的气道上皮细胞分化模式及其机制的变化。
方案
整个实验方案共需44天，包括1天用于制备从小鼠气管分离的气道上皮细胞，15天用于细胞增殖，以及28天在气液界面进行CSE刺激。所有实验动物均饲养于首都医科大学实验动物中心的SPF屏障动物房，并已通过首都医科大学实验动物与实验室动物伦理委员会（AEEI-2020-100）的审查和批准，符合ARRIVE指南的要求7。
1. 从小鼠气管中分离原代小鼠气道上皮细胞
- 准备
- 通过将1 mL的50倍补充剂和0.05 mL氢化可的松储备液加入48.95 mL扩增基础培养基中，配制完全扩增培养基。4 °C保存，并在4周内使用。
- 将7.5 mg蛋白酶和5 mg脱氧核糖核酸酶I溶解于5 mL Ham's F-12培养基中，制备蛋白酶溶液。过滤除菌后，4 °C保存，并在4周内使用。
- 通过向5 mL完全扩增培养基、PBS和蛋白酶溶液中分别加入0.05 mL 100倍青霉素/链霉素和0.01 mL 500倍庆大霉素/两性霉素，配制抗生素溶液（终浓度为100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10 µg/mL庆大霉素和0.25 µg/mL两性霉素B）。4 °C保存，并在4周内使用。
- 对手术器械进行灭菌，并准备生物安全柜用于细胞分离。同时，确保标准细胞培养设备已准备就绪。
- 通过将鼠尾胶原（溶于0.02 N乙酸，浓度为100 µg/mL）加入100 mm培养皿和24 mm Transwell小室（0.05 mL/cm2），制备鼠尾胶原包被的培养皿。在紫外线下敞口过夜以灭菌。
- 原代小鼠气道上皮细胞的分离
- 使用C57BL/6小鼠（6–8周龄，雄性，SPF级饲养）进行气管上皮细胞分离。以1%戊巴比妥钠溶液过量注射（约200 mg/kg）实施安乐死。使用五只小鼠以获得足够的细胞产量。
- 将小鼠浸入75%乙醇溶液中进行表面消毒，但避免将鼻部和口部浸入酒精，以防酒精流入气管。
- 解剖小鼠。
- 使用手术刀和镊子，用一套器械从下颌至腹腔切开并分离小鼠表皮。
- 使用另一套手术器械分离两侧甲状腺，并去除气管与周围肌肉组织及食管之间的连接。
- 随后小心切开胸腔，用镊子深入胸腔，取出整个肺组织，并找到气管末端。
- 处理气管。
- 从甲状软骨至气管支气管分叉处切取气管，放入含四种抗生素的预冷扩增培养基中。
- 振荡离心管以尽可能冲洗掉气管表面的血液，保持在冰上，并开始下一只小鼠的手术操作。
- 将所有收集的气管转移至含四种抗生素的预冷PBS缓冲液中（200 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素、20 µg/mL庆大霉素和0.5 µg/mL两性霉素B），用于消化前的预处理。
- 使用一套手术器械去除气管表面的血凝块和其他组织，然后将其切成1 cm2大小的片段。
- 将气管组织在37 °C的蛋白酶溶液中孵育40分钟。
- 40分钟后，轻轻摇动离心管数次，用40 µm细胞筛去除残留组织。用5 mL扩增培养基冲洗筛网上的气管碎片，将细胞悬液在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 将获得的细胞重悬于8 mL扩增培养基中。
- 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对活细胞进行计数。
- 将P0代细胞悬液接种于预先包被鼠尾胶原的100 mm培养皿中（接种密度为1 × 104个活细胞/cm2），并在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
2. 原代小鼠气道上皮细胞的扩增培养与传代
- 每3天更换一次P0代细胞培养液，直至细胞达到70%-80%融合度，通常在6天内完成。此时，小鼠气管上皮细胞可形成完整单层，呈现铺路石样外观（图1A-D）。
- 将足量的PBS、完全扩增培养基以及无动物组分（ACF）细胞解离试剂盒预热至37 °C。
- 用3 mL PBS轻柔冲洗细胞。
- 进行酶解解离。
- 向培养皿中加入3 mL ACF酶解解离液，37 °C孵育5分钟。吹打后轻柔使细胞脱落，并将细胞悬液转移至3 mL ACF酶抑制液中。
- 再次加入3 mL ACF酶解解离液，继续孵育5分钟，以确保细胞最大程度解离。
- 在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟收集细胞悬液，弃去上清液。
- 用1 mL扩增培养基重悬细胞。
- 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对活细胞进行计数。
- 将P1代细胞悬液接种于多块预先包被大鼠尾胶原的100 mm培养皿中（接种密度为5 × 104 个活细胞/cm2），置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。
3. 小鼠原代气道上皮细胞在气液界面的分化及香烟烟雾提取物刺激
- 确认细胞类型。
- 使用针对细胞角蛋白的免疫荧光检测（IFA）验证分离细胞的上皮来源。将细胞接种于经大鼠尾胶原包被的玻片上，待细胞融合度达到80%后，使用多聚甲醛固定至少12小时。
- 用PBS溶液清洗玻片3次，每次5分钟，在室温（RT）下用含3% BSA和0.1% Triton X-100的PBS溶液封闭1小时。
- 在4 °C下用商品化的广谱抗细胞角蛋白抗体（1:500稀释）孵育玻片过夜。
- 次日，用PBS溶液清洗玻片3次，每次5分钟，然后在避光条件下，室温下用二抗缓冲液（1:1000稀释）孵育2小时。
- 孵育结束后，用PBS清洗玻片3次（每次5分钟），加入DAPI（1:1000稀释），室温孵育15分钟后，再用PBS清洗一次，持续5分钟。
- 在荧光显微镜下观察玻片，并将表达模式与阳性对照（A549细胞系）和阴性对照（Raw264.7细胞系）进行比较（图2）。
- 接种细胞以进行分化。
- 按照前述方法消化并离心P2代细胞，将细胞沉淀重悬于适量扩增培养基中，以便以1 × 104 个活细胞/cm2 的密度接种。
- 将1 mL细胞悬液加入Transwell聚碳酸酯膜插入式培养板的顶端室中，在基底室中加入1.5 mL增殖培养基。
- 将细胞在37 °C培养，每隔3天完全更换顶端室和基底室的培养基，使用扩增培养基，直至细胞达到融合状态，通常需要3–6天。
- 通过向44.15 mL ALI基础培养基中加入5 mL ALI 10x补充剂、500 µL ALI维持补充剂、100 µL肝素溶液和250 µL氢化可的松储备液，配制50 mL完全分化培养基。
- 制备香烟烟雾提取物（CSE）。
- 将一支香烟的烟雾通入12.5 mL分化培养基中，然后经0.22 µm孔径滤膜过滤，以制备CSE。为确保不同实验及不同批次CSE之间的标准化，使用分光光度计在320 nm处测定吸光度，并将光密度（OD）值定义为1时记为100%8。
- 使用含有适当浓度CSE的分化培养基刺激原代小鼠气道上皮细胞，以检测其对细胞分化的影响。
- 让细胞分化28天，在此期间定期更换基底室培养基，并每周两次清洗顶端面：移除顶端室培养基，并用含适当浓度CSE的分化培养基替换基底室培养基。
- 暴露后分析细胞。
- 在暴露于含CSE的分化培养基后，可在任意时间点（即0–28天）收集细胞及培养上清液，用于检测形态学变化（如免疫荧光检测（IFA）或苏木精-伊红染色（HE）），或进行生物信息学分析（如转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）。
结果
分化
小鼠气道上皮细胞在气液界面培养条件下，使用分化培养基培养28天后成功实现分化。通过免疫荧光染色检测纤毛细胞标志物乙酰化α-微管蛋白（绿色；图3A）和杯状细胞标志物Mucin5AC（红色；图3B），证实了纤毛细胞和杯状细胞的存在。
确定用于细胞分化的CSE浓度
用不同浓度的CSE刺激分离的上皮细胞24小时。结果显示，当CSE浓度高于6%时，上皮细胞的活力下降（p <0.05，图4A）。为了在长期刺激下维持细胞活性，使用含2%、4%和6% CSE的培养基刺激上皮细胞分化28天。此外，结果表明，随着CSE浓度的增加，上皮细胞未出现显著的细胞死亡（图4B），但细胞间的跨膜电阻（TEER）（图4C）和脱落细胞数量（图4D）呈现逐渐变化的趋势。另外，当小鼠气道上皮细胞长期暴露于CSE时，分化细胞和纤毛细胞的总体数量减少（图4E-H）。因此，选择含6% CSE的分化培养基，在不影响细胞活力的前提下，干扰上皮屏障功能并减少纤毛细胞数量，同时进行为期28天的上皮细胞分化。
多组学分析
用含0%或6% CSE的诱导培养基刺激两组细胞28天后收获细胞。提取总mRNA用于转录组分析。在完成文库构建、测序、质量控制、reads比对至参考基因组及基因表达定量后，分析两组间基因的差异表达。采用clusterProfiler R软件包对差异表达基因进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，并对基因长度差异进行了校正。 (图 5A)京都基因与基因组百科全书（KEGG）是一个综合性数据库，通过整合来自基因组测序和高通量实验方法等大规模数据集的分子水平数据，有助于理解细胞、个体及生态等不同层次上复杂生物系统的功能与作用。图5B）。对于蛋白质组学分析，从两种不同培养基（分别含有0%或6% CSE）培养28天后的细胞中提取总蛋白。在进行蛋白质质量检测、除盐、蛋白质酶解、肽段串联质谱标签（TMT）标记、组分分离、液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析、蛋白质鉴定和定量之后，可确定两组间差异表达的蛋白质。GO分析使用interproscan程序针对非冗余蛋白数据库（图6A），并使用 KEGG 分析通路（图6B）。在代谢组学实验中，分别收集培养于含0%或6% CSE分化培养基中28天后的两组气道上皮细胞的培养上清液。经HPLC-MS/MS分析、代谢物鉴定与定量后，可确定两组之间的差异代谢物。KEGG数据库（图7A），人类代谢组数据库（图7B）以及 Lipidmaps 数据库（图7C）用于注释所有代谢物。利用KEGG数据库分析这些差异代谢物的功能及代谢通路（图7D）。在表观基因组学研究中，ATAC-seq 按照先前报道的方法进行9从两组细胞中提取细胞核，细胞在含有0%或6% CSE的差异培养基中培养28天后进行提取，将细胞核沉淀重悬于Tn5转座酶反应混合液中。转座反应在指定条件下孵育。 37 °C 孵育30 min。添加接头、文库构建、质量评估、簇生成及测序后，可确定两组间的差异表观基因组。差异峰相关基因的GO富集分析直接反映了在生物过程、细胞组分和分子功能中富集的GO条目内，差异峰相关基因的数量分布。图8A）。利用 KEGG 数据库分析这些差异基因的功能及相关通路（图8B).
编码紧密连接蛋白的基因
转录组学数据显示，经香烟烟雾提取物（CSE）长期刺激后，多种编码紧密连接蛋白的基因表达下调，包括 Cgn、Cldn2、Cldn3、Cldn8、Cldn10、Cldn20、Cldn23、Jam2 和 Ocln（图9A），其中Cldn3和Ocln表达降低的结果进一步通过Western blot和免疫组织化学（IHC）得到验证（图9B-E这些数据表明，暴露于香烟烟雾提取物（CSE）显著降低了气道上皮细胞紧密连接蛋白的表达。
细胞因子和趋化因子的表达
除了紧密连接的破坏外，转录组学还显示，在长期香烟烟雾提取物（CSE）刺激后，一些细胞因子和趋化因子的表达上调，包括Cxcl5、Csf3、Il1a、Il34、Ccl20和Il33，而Ccl5的表达则下调（图10A）。Luminex检测进一步证实，小鼠气道上皮细胞培养上清中CXCL-5、CSF-3和IL-1α的浓度升高（图10B-D），而CCL-5浓度降低（图10E）。这些结果表明，CSE暴露可选择性地调控细胞因子和趋化因子的表达。
图1：原代小鼠气道上皮细胞的生长情况。（A）新分离的细胞呈圆形且透明。（B）分离后第2天，细胞扩展并形成小的细胞岛。（C）第4天时，形成较大的细胞岛。（D）第6天时，融合度超过90%，呈现铺路石样形态。（4倍放大；比例尺：250 µm）。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：上皮细胞标志物的免疫荧光检测。原代小鼠气道上皮细胞、A549（阳性对照）和Raw264.7（阴性对照）中细胞角蛋白的表达。细胞核经DAPI染色（63倍放大；比例尺：40 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：纤毛细胞和杯状细胞标志物的免疫荧光检测。 所用标志物分别为乙酰化（A）α-微管蛋白和（B）黏蛋白5AC，用于分别确认纤毛细胞和杯状细胞（100倍放大；比例尺：A图中为10 µm，B图中为50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4CSE浓度对上皮细胞的影响。 (A) 不同CSE浓度下24小时的细胞活力。B) 细胞在28天时的存活率。 (C) TEER 测量。 (D脱落细胞计数。E-H) 不同浓度CSE（0%、2%、4% 和 6%）处理下纤毛细胞（绿色）和杯状细胞（紫色）的免疫荧光染色（20倍放大；比例尺： 50 µm). 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：基因表达的 GO 与 KEGG 富集分析。（A）富集的生物过程、细胞组分和分子功能中 GO 条目的显著性。（B）差异表达基因在 KEGG 通路中的比例。请点击此处查看该图的高清版本。
图6：蛋白质表达分析。（A）显示差异表达蛋白质的GO富集条形图。（B）基于差异表达蛋白质的KEGG通路分析。请点击此处查看该图的高清版本。
图 7：代谢物 KEGG 通路分析。 （A）使用 KEGG 数据库对所有代谢物进行注释。（B）使用人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）对所有代谢物进行注释。（C）使用 Lipidmaps 数据库对所有代谢物进行注释。（D）差异表达代谢物在各类 KEGG 通路中的分布情况。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：差异峰相关基因表达分析。（A）GO富集条形图，显示差异蛋白表达。（B）基于差异表达蛋白的KEGG通路分析。请点击此处查看该图的高清版本。
图9：小鼠气道上皮细胞在有或无CSE刺激条件下紧密连接蛋白的表达。 （A）转录组中紧密连接蛋白表达的热图。（B-E）通过Western Blot和免疫组织化学法检测小鼠气道上皮细胞中（B、C）Cldn3和（D、E）Ocln的表达水平（80倍放大；比例尺：50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
图10细胞因子表达分析 (A细胞因子表达的转录组热图。B-E) 使用或不使用CSE刺激的细胞中CXCL-5、CSF-3、IL-1α和CCL-5水平的Luminex检测。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的慢性气道炎症性疾病。烟草烟雾暴露可导致慢性气道炎症、气道重塑以及肺组织结构破坏，这是多种结构细胞与免疫细胞相互作用的结果10。作为肺部固有免疫系统的第一道防线，气道上皮细胞在疾病发展过程中发挥着至关重要的作用11。从这一角度来看，阐明上皮细胞在有害物质刺激下如何发生改变并调控下游细胞，是当前亟待解决的科学问题。
近期，已有数种克服了部分局限性的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型被报道12。在这些模型中可观察到中等程度的中性粒细胞性气道炎症、Th1/Th17型炎症特征、显著的黏液过度分泌、气道重塑增加、肺功能下降以及肺泡腔扩大。尽管这些模型仅需1个月即可建立类似COPD的改变，但香烟烟雾暴露1个月内小鼠体内发生的变化仍不明确。采用长期CSE刺激的优势在于更易于校准，这意味着气道上皮细胞可在不致死的情况下暴露于尽可能严重的香烟刺激，类似于吸烟者气道上皮细胞所处的状态。因此，监测导致气道炎症及肺气肿形成的动态病理变化，对于深入理解与吸烟相关的COPD发病机制至关重要。为此，我们建立了一种体外模型以模拟吸烟状态，并尝试监测CSE暴露过程中气道上皮细胞的动态变化。此外，相对纯化的气道上皮细胞相较于整体组织更便于进行多组学研究，有助于我们发现气道上皮细胞在CSE暴露下的分子与细胞应答，并高通量地识别COPD的关键通路和治疗靶点。
本实验方案参考了 Hilaire 等人13 和 You 等人14 的方案，并进行了部分修改，用于分离小鼠气管上皮细胞。在本研究采用的方案中，小鼠气道上皮细胞在含有香烟烟雾提取物（CSE）的培养基中，通过气液界面培养方法进行扩增并分化为包含纤毛细胞和杯状细胞的假复层结构，从而建立了一种慢性CSE适应模型。以下事件是本模型的关键要点。
考虑到颈椎脱位可能对颈部造成机械性牵拉并物理损伤上皮细胞，而水合氯醛麻醉也可能影响气道，因此本研究采用戊巴比妥钠进行安乐死15。在小鼠手术过程中，仅将颈部及以下部位浸入消毒液中，以防止酒精进入鼻腔，从而提高气道上皮细胞的存活率16。本研究的初步数据显示，接受气管插管或酒精浸泡处理的气道上皮细胞存活率较低，且无法有效扩增。此外，为获得不含红细胞的气道上皮细胞，在分离主气道时必须谨慎操作，避免手术过程中血液污染。
即使在特定病原体阴性小鼠中，呼吸道仍定植有大量微生物。在P0代原代小鼠气道上皮细胞的扩增培养基中添加适当的抗生素，对于防止细菌或真菌病原体污染至关重要。青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素的混合溶液17 有效确保P0代小鼠气道上皮细胞在无菌条件下的扩增 体外 环境。初步实验表明，若无法有效抑制细菌污染，P0代小鼠气道上皮细胞将在首次传代前死亡。
在消化方法中，测试了4 °C和37 °C两种温度。初步实验结果表明，与4 °C相比，37 °C消化在时间效率、细胞活力和细胞得率方面表现更优。
在接种上皮细胞之前，将鼠尾胶原蛋白溶解于乙酸中，用于培养皿包被，以增强上皮细胞的黏附能力18。然而，胶原蛋白包被的浓度过高或过低均不适宜；浓度过低无法提供足够的黏附条件，而浓度过高则会导致培养表面出现结晶残留物。
关键步骤是尽可能保持更多的上皮细胞存活，并避免成纤维细胞污染。为实现这一目标，我们建议：1）使用无动物成分的细胞解离试剂盒可轻柔地分离上皮细胞，减少不必要的细胞损伤；2）使用含有氢化可的松的差异培养基可抑制成纤维细胞的生长，同时促进上皮细胞的增殖。
传统的气道上皮细胞 submerged 单层培养在呼吸系统研究和毒理学研究中一直被广泛应用。然而，这些方法难以准确模拟体内气道上皮组织所具有的分化特征 体内为解决这一局限性，我们选择了一种替代的气道上皮模型。该模型基于在微孔膜支架（如Transwell系统提供的支架）上培养原代气道细胞，并于气液界面条件下进行。19在该ALI培养体系中，将顶端表面暴露于环境空气中对于促进细胞分化至关重要，从而更接近地模拟了 体内 条件20.
如果分化效果不佳，必须评估可能的原因。这包括气道上皮细胞可能经历了过度传代，从而影响其分化能力。此外，在每两周一次的培养基更换过程中，必须确保完全清除顶腔内的黏液和液体积聚，因为残留物可能会阻碍分化过程。
尽管该模型存在某些局限性，它仍然是研究中的一个重要工具。其中一个局限性在于，使用含香烟烟雾提取物（CSE）的培养基刺激气道上皮细胞可能无法完全模拟 体内 吸烟者气道上皮细胞所经历的条件。此外，分化后的纤毛上皮细胞的活力 体外 通常仅限于一个月。尽管存在这些限制，该模型仍有效整合了多个关键方面：支持在气液界面研究气道上皮细胞的分化、长期适应香烟烟雾提取物（CSE）的条件，以及在特定时间范围内应用多组学分析。这一综合方法为未来探索气道上皮细胞的生理与病理机制提供了先进且系统的框架，同时有助于识别气道疾病的潜在生物标志物和治疗靶点。我们希望本研究的经验能为拟采用该模型开展相关研究的人员提供有益的参考。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（82090013）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100倍青霉素/链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | |
| 24 mm Transwell，带0.4 µm 孔径聚酯膜插件，无菌 | BIOFIL | TCS016012 | |
| 40 µm 细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 500倍庆大霉素/两性霉素溶液 | Gibco | R01510 | |
| 乙酰化 α-微管蛋白 | CST | #5335 | |
| 乙酰-α-微管蛋白 (Lys40) (D20G3)XP 兔单克隆抗体 | cellsignal | #5335 | |
| 无动物成分细胞解离试剂盒 | Stemcell | 05426 | |
| 广谱细胞角蛋白抗体 | abcam | ab7753 | |
| 香烟 | 万宝路 | ||
| Claudin3 | immunoway | YT0949 | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | DN25 | |
| Ham’s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
| 肝素溶液 | Stemcell | 07980 | |
| 氢化可的松储备液 | Stemcell | 07925 | |
| Mucin 5AC | abcam | ab212636 | |
| Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
| PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | |
| PneumaCult-ALI 基础培养基 | Stemcell | 05002 | |
| PneumaCult-ALI 10倍补充剂 | Stemcell | 05003 | |
| PneumaCult-ALI 维持补充剂 | Stemcell | 05006 | |
| PneumaCult-Ex Plus 50倍补充剂 | Stemcell | 05042 | |
| PneumaCult-Ex Plus 基础培养基 | Stemcell | 05041 | |
| Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 大鼠尾胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| 台盼蓝 | Stemcell | 07050 |
参考文献
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