香烟烟雾提取物刺激小鼠气道上皮细胞多组学分化和变化的体外模型

摘要

在这里，我们描述了一种用于分离和分化小鼠气道上皮细胞的 体外 模型，重点关注它们对慢性香烟烟雾提取物 （CSE） 的适应。该模型可用于全面表征 CSE 的多组学影响，这可能为了解慢性烟雾暴露下的细胞反应提供见解。

摘要

慢性阻塞性肺病 （COPD） 主要归因于烟草烟雾暴露。研究气道上皮细胞如何在功能上适应烟草烟雾对于了解 COPD 的发病机制至关重要。本研究是使用原代小鼠气道上皮细胞建立一个 体外 模型，以模拟烟草烟雾的现实影响。与已建立的细胞系不同，原代细胞保留了更多的 体内样特性，包括生长模式、衰老和分化。这些细胞表现出敏感的炎症反应和有效的分化，因此与生理状况密切相关。在该模型中，原代小鼠气道上皮细胞在气液界面下以最佳浓度的香烟烟雾提取物 （CSE） 培养 28 天，这导致单层未分化细胞转化为假复层柱状上皮，表明 CSE 驯化。然后应用全面的多组学分析来阐明 CSE 影响基底气道细胞分化的机制。这些见解有助于更深入地了解支撑 COPD 进展以应对烟草烟雾暴露的细胞过程。

引言

慢性阻塞性肺疾病 （COPD） 是一种具有复杂特征的异质性肺部疾病，而 COPD 患者逐渐趋于年轻化¹。吸烟是^{COPD 2} 的主要危险因素，对气道上皮细胞有深远影响，气道上皮细胞是抵御烟草烟雾的初始屏障。尽管存在这种已知的关联，但烟草烟雾诱导气道上皮细胞变化的详细机制仍未得到充分探索。彻底了解这些分子改变对于确定 COPD 的早期诊断标志物和治疗靶点至关重要。

为了解决这一差距，我们开发了一种使用小鼠气道上皮细胞的新型体外模型。这些细胞受到香烟烟雾提取物 （CSE） 的长期刺激，使我们能够监测动态细胞变化并探索气道上皮细胞在长期烟草刺激下的变化及其潜在机制。在该模型中，transwell 用于提供气道上皮细胞的气液界面，在上皮细胞分化的早期刺激香烟烟雾提取物，直到 28 天分化结束。以前的研究仅调查了气道上皮细胞的分化和短期刺激 （细胞系优势）。它们仅限于单一的调节途径 3,4,5,6。然而，这里介绍的方案使用原代小鼠气道上皮细胞，并优化了细胞提取过程，以获得比以前的气道上皮细胞培养方法更好的细胞活性。该模型侧重于细胞分化的改变以及全面的转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表观基因组学分析。采用免疫荧光和先进的多组学技术，我们旨在阐明气道上皮细胞对慢性烟草烟雾暴露的细胞反应，从而有助于更深入地了解 COPD 发病机制。该模型可用于探究各种污染物长期刺激引起的气道上皮细胞分化模式的变化及其机制。

方案

整个方案需要 44 天，包括从小鼠气管中分离的气道上皮细胞的制备 1 天、细胞增殖的 15 天和气液界面 CSE 刺激的 28 天。所有实验动物均饲养在首都医科大学动物实验中心的 SPF 屏障动物室，并经首都医科大学动物实验与实验动物伦理委员会 （AEEI-2020-100） 审查批准，符合 ARRIVE 指南⁷ 的要求。

1. 从小鼠气管中分离原代小鼠气道上皮细胞

1. 制备
   1. 通过将 1 mL 50x 添加剂和 0.05 mL 氢化可的松原液与 48.95 mL 扩增基础培养基混合来制备完全扩增培养基。储存在 4 °C 并在 4 周内使用。
   2. 将 7.5 mg 蛋白酶和 5 mg 脱氧核糖核酸酶 I 溶解在 5 mL Ham's F-12 中，制备蛋白酶溶液。过滤消毒并在 4 °C 下储存，并在 4 周内使用。
   3. 通过将 0.05 mL 100x 青霉素/链霉素和 0.01 mL 500x 庆大霉素/两性霉素添加到 5 mL 完全扩增培养基、PBS 和蛋白酶溶液（100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、10 μg/mL 庆大霉素和 0.25 μg/mL 两性霉素 B）中来制备抗生素溶液。储存在 4 °C 并在 4 周内使用。
   4. 对手术器械进行消毒，并准备用于细胞分离的生物安全柜。同时，确保标准细胞培养设备已准备好使用。
   5. 通过将大鼠尾胶原蛋白（100 μg/mL 在 0.02 N 乙酸中）添加到 100 mm 培养皿和 24 mm transwell （0.05 mL/cm²） 中来制备大鼠尾部胶原蛋白涂层的培养皿。在紫外线下打开过夜进行消毒。
2. 原代小鼠气道上皮细胞的分离
   1. 使用 C57BL/6 小鼠 （6-8 周龄，雄性，SPF 升高） 进行气管上皮细胞分离。用 1% 戊巴比妥钠溶液过量（约 200 mg/kg）安乐死。使用五只小鼠以获得足够的细胞产量。
   2. 将小鼠浸入 75% 乙醇溶液中对小鼠进行绝育，不要将鼻子和嘴巴浸入酒精中，以防止酒精流入气管。
   3. 解剖鼠标。
      1. 使用手术刀片和镊子，这是一套用于切割和打开从小鼠下颌到腹腔的表皮的装置。
      2. 使用另一套手术器械撕开两侧的甲状腺，去除气管、周围肌肉组织和食道之间的连接。
      3. 之后，小心切开胸部，用镊子深入胸腔，取出整个肺，找到气管末端。
   4. 处理气管。
      1. 从甲状软骨到气管支气管支气管分支切出气管，并将其放入含有四种抗生素的预冷膨胀培养基中。
      2. 摇动管子，尽可能多地冲洗掉气管表面的血液，将其保持在冰上，然后开始为下一只小鼠进行手术。
   5. 将所有收集的气管转移到含有四种抗生素（200 U/mL 青霉素、200 U/mL 链霉素、20 μg/mL 庆大霉素和 0.5 μg/mL 两性霉素 B）的预冷 PBS 缓冲液中，以便在消化前进行预处理。
   6. 使用一套手术器械去除气管表面的凝块和其他组织，然后将它们切成 1 cm² 的大小。
   7. 将气管组织在蛋白酶溶液中于 37 °C 孵育 40 分钟。
   8. 40 分钟后，摇动试管数次，并使用 40 μm 细胞过滤器去除剩余的组织。在装有 5 mL 扩增培养基的过滤器上冲洗切碎的气管，在 4 °C 下以 400 x g 离心细胞悬液 5 分钟，然后弃去上清液。
   9. 将获得的细胞重悬于 8 mL 扩增培养基中。
   10. 使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。
   11. 将 P0 细胞悬液接种在预涂有大鼠尾胶原的 100 mm 培养皿（1 x 10⁴ 个活细胞/cm²）上，并在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养细胞。

2. 原代小鼠气道上皮细胞的扩增培养和传代

1. 每 3 天更换一次 P0 细胞培养物的培养基，直到细胞达到 70%-80% 汇合度，通常在 6 天内。此时，小鼠气管上皮细胞可以形成具有鹅卵石外观的完整单层（图 1A-D）。
2. 将足量的 PBS、完全扩增培养基和无动物成分 （ACF） 细胞解离试剂盒预热至 37 °C。
3. 用 3 mL PBS 轻轻冲洗细胞。
4. 进行酶解离。
   1. 向培养皿中加入 3 mL ACF 酶解离溶液，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。移液后，轻轻去除细胞，并将细胞悬液转移到 3 mL ACF 酶抑制溶液中。
   2. 重复加入 3 mL ACF 酶解离溶液，并再次孵育 5 分钟，以确保细胞分离程度最高。
5. 将细胞悬液在 400 x g 下在 4 °C 下旋转 5 分钟。 丢弃上清液。
6. 将细胞重悬于 1 mL 扩增培养基中。
7. 使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。
8. 将 P1 细胞悬液接种在几个预先涂有大鼠尾胶原的 100 mm 培养皿（5 x 10⁴ 个活细胞/cm²）上，并在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养细胞。

3. 原代小鼠气道上皮细胞在气液界面的分化和 CSE 刺激

1. 确认细胞类型。
   1. 使用免疫荧光检测 （IFA） 和细胞角蛋白抗体验证分离细胞的上皮来源。将细胞接种在涂有大鼠尾胶原的载玻片上，并在细胞达到 80% 汇合后使用多聚甲醛将其固定至少 12 小时。
   2. 用 PBS 溶液洗涤载玻片 3 次 5 分钟，并在室温 （RT） 下与 3% BSA 和 0.1% triton X-100 在 PBS 溶液中孵育 1 小时。
   3. 将玻片在 4 °C 下与市售 1:500 稀释度的抗泛细胞角蛋白抗体孵育过夜。
   4. 第二天，用 PBS 溶液洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，然后用稀释度为 1:1000 的二抗缓冲液在 RT 下在黑暗中孵育 2 小时。
   5. 孵育后，用 PBS 洗涤玻片 3 次（每次洗涤 5 分钟），并向其中添加稀释度为 1:1000 的 DAPI。在 RT 孵育 15 分钟后，用 PBS 洗涤玻片一次 5 分钟。
   6. 在荧光显微镜下观察载玻片，并将表达模式与阳性对照（A549 细胞系）和阴性对照（Raw264.7 细胞系）进行比较（图 2）。
2. 接种细胞以进行分化。
   1. 如前所述分离并离心 P2 细胞，并将细胞沉淀重悬于适当体积的扩增培养基中，以便于接种 1 x 10⁴ 个活细胞/cm²。
   2. 将 1 mL 细胞悬液移液到 transwell 聚碳酸酯膜插入物的顶腔上。向 transwell 的基底隔室中，添加 1.5 mL 增殖培养基。
3. 将细胞在 37 °C 下孵育，并使用扩增培养基每 3 天完全更换基底和顶端腔中的所有培养基，直至达到汇合。这通常需要 3-6 天。
4. 向 44.15 mL ALI 基础培养基中加入 5 mL ALI 10x 添加剂、500 μL ALI 维持添加剂、100 μL 肝素溶液和 250 μL 氢化可的松储备液，制备 50 mL 完全分化培养基。
5. 准备 CSE。
   1. 将一支香烟通过 12.5 mL 分化培养基起泡，然后通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤以制备 CSE。为确保 CSE 实验和批次之间的标准化，请在分光光度计上测量 320 nm 处的吸光度，并将 1 的光密度 （OD） 定义为 100%⁸。
6. 使用含有适当浓度 CSE 的分化培养基刺激原代小鼠气道上皮细胞，以检测对细胞分化的影响。
7. 让细胞分化 28 天，在此期间更换基底腔培养基，并通过去除顶腔培养基并用含有适当浓度 CSE 的分化培养基替换基底腔培养基，每周洗涤顶端侧两次。
8. 分析暴露后的细胞。
   1. 暴露于含有 CSE 的分化培养基后，在任何时间点（即 0-28 天）收获细胞和培养上清液，以检测形态变化（即免疫荧光测定 （IFA） 或苏木精-伊红染色 （HE） 或用于生物信息学分析程序（即转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）。

结果

分化
小鼠气道上皮细胞在气液界面用分化培养基培养 28 天后成功分化。纤毛标志物乙酰化 α-微管蛋白（绿色; 图 3A）和杯状细胞标记物 Mucin5AC，分别为 6（红色; 图 3B）。

测定用于细胞分化的 CSE 浓度
用不同浓度的 CSE 刺激分离的上皮细胞 24 小时。结果表明，当 CSE 浓度高于 6% 时，上皮细胞的细胞活力下降 （p <0.05，图 4A）。为了在长期刺激下保持细胞活性，使用含有 2% 、 4% 和 6% CSE 的培养基刺激上皮细胞分化 28 d。此外，结果表明，随着 CSE 浓度的增加，上皮细胞中没有明显的细胞死亡（图 4B），但细胞间跨膜抗性 （TEER） 的数量（图 4C）和脱落细胞的数量逐渐变化（图 4D）。此外，当小鼠气道上皮细胞培养物长期暴露于 CSE 时，注意到分化细胞和纤毛细胞的总体减少（图 4E-H）。因此，选择含有 6% CSE 的分化培养基来失调上皮屏障功能并减少纤毛细胞数量，而不会降低细胞活力，同时分化上皮细胞 28 天。

多组学分析
收获两组用含有 0% 或 6% CSE 的差异培养基刺激 28 天的细胞。提取总 mRNA 用于转录组学分析。文库制备、测序、质量控制、读取定位到参考基因组和基因表达定量后，分析两组间基因的差异表达。使用 clusterProfiler R 软件包对表现出差异表达的基因的基因本体论 （GO） 进行富集分析，并进行调整以解决基因长度差异 （图 5A）。京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 是一个综合数据库，通过整合来自广泛数据集的分子水平数据，包括细胞、生物体和生态学，促进理解各个层面的复杂生物系统功能和作用，例如基因组测序和高通量实验方法产生的数据集（图 5B).对于蛋白质组学，在培养后 28 天，使用含有 0% 或 6% CSE 的差异培养基从两组细胞中提取总蛋白。经过蛋白质质量检测、脱盐、蛋白质酶解、肽的串联质量标签 （TMT） 标记、馏分分离、LC-MS 分析、蛋白质鉴定和蛋白质定量，可以定义两组之间的差异表达蛋白质。使用 interproscan 程序针对非冗余蛋白质数据库进行 GO 分析（图 6A），并使用 KEGG 分析通路（图 6B）。对于代谢组学，在培养后 28 天用含有 0% 或 6% CSE 的分化培养基从两组气道上皮细胞中收集培养上清液。在对代谢物进行 HPLC-MS/MS 分析、鉴定和定量后，可以确定两组之间的差异代谢物。使用 KEGG 数据库（图 7A）、人代谢组数据库（图 7B）和 Lipidmaps 数据库（图 7C）注释所有代谢物。KEGG 数据库用于分析这些差异代谢物和代谢途径的功能（图 7D）。对于表观基因组学，ATAC-seq 的执行与先前报道的相同⁹。培养后 28 天，用含有 0% 或 6% CSE 的差异培养基从两组细胞中提取细胞核，并将细胞核沉淀重悬于 Tn5 转座酶反应混合物中。将转座反应在 37 °C 下孵育 30 分钟。添加接头、文库制备、质量评估、聚类和测序后，可以定义两组之间的差异表观基因组学。差异峰相关基因的 GO 富集分析直接反映了在生物过程、细胞成分和分子功能中富集的 GO 项目中差异峰相关基因的数量分布（图 8A）。KEGG 数据库用于分析这些差异基因和通路的功能 （图 8B）。

编码紧密连接蛋白的基因
转录组学数据显示，长期刺激 CSE 后，编码紧密连接蛋白的许多基因表达降低，包括 Cgn、Cldn2、Cldn3、Cldn8、Cldn10、Cldn20、Cldn23、Jam2 和 Ocln（图 9A），其中 Cldn3 和 Ocln 表达降低通过 Western-Blot 和免疫组织化学 （IHC） 进一步证实（图 9B-E).这些数据表明，暴露于 CSE 显着降低了气道上皮细胞紧密连接蛋白的表达。

细胞因子和趋化因子表达
除了紧密连接的破坏外，转录组学还表明，长期刺激 CSE 后，一些细胞因子和趋化因子的表达，包括 Cxcl5、Csf3、Il1a、Il34、Ccl20 和 Il33 的表达增加，但 Ccl5 的表达降低（图 10A）。Luminex 测试进一步证实，小鼠气道上皮细胞上清液中 CXCL-5 、 CSF-3 和 IL-1α 的浓度增加 （图 10B-D），但 CCL-5 降低 （图 10E）。这些结果表明，暴露于 CSE 选择性地作用于细胞因子和趋化因子的表达。

图 1:原代小鼠气道上皮细胞的生长。 （A） 新分离的细胞呈圆形和透明。（B） 分离后第 2 天，扩增的细胞形成小细胞岛。（C） 到第 4 天，形成更大的细胞岛。（D） 到第 6 天，超过 90% 与鹅卵石形态融合。（4 倍放大倍率;比例尺:250 μm）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:上皮细胞标志物的免疫荧光测定。 原代小鼠气道上皮细胞、A549（阳性对照）和 Raw264.7（阴性对照）中的细胞角蛋白表达。用 DAPI 染色的细胞核（63 倍放大倍率;比例尺:40 μm）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:纤毛细胞和杯状细胞标志物的免疫荧光测定。 使用的标记物是乙酰化 （A） α-微管蛋白和 （B） 粘蛋白 5AC，分别用于确认纤毛细胞和杯状细胞（100 放大倍率;比例尺:图 A 中为 10 μm，图 B 中为 50 μm）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:CSE 浓度对上皮细胞的影响。（A） 不同 CSE 浓度下 24 小时的细胞活力。（B） 28 天时的细胞活力。（C） TEER 测量。（D） 脱落细胞的计数。（E-H）在 0%、2%、4% 和 6% CSE 浓度下对纤毛细胞（绿色）和杯状细胞（紫色）进行免疫荧光检测（20 倍放大倍率;比例尺:50 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:基因表达的 GO 和 KEGG 富集分析。 （A） GO 术语在富集的生物过程、细胞成分和分子功能中的意义。（B） KEGG 通路中差异表达基因的比例。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:蛋白质表达分析。 （A） 显示差异蛋白表达的 GO 富集条形图。（B） 基于差异表达蛋白的 KEGG 通路分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:代谢物 KEGG 通路分析。 （A） 使用 KEGG 数据库注释所有代谢物。（B） 使用人类代谢组数据库注释所有代谢物。（C） 使用 Lipidmaps 数据库注释所有代谢物。（D） 差异表达代谢物在各种 KEGG 通路中的分布。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8:差异峰相关基因表达分析。 （A） 显示差异蛋白表达的 GO 富集条形图。（B） 基于差异表达蛋白的 KEGG 通路分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 9:有或没有 CSE 刺激的小鼠气道上皮细胞中紧密连接蛋白的表达。（A） 转录组中紧密连接蛋白表达的热图。（B-E）Western Blot 和免疫组化检测小鼠气道上皮细胞中 （B，C） Cldn3 和 （D，E） Ocln 的表达水平 （80 倍;比例尺:50 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。

图 10:细胞因子表达分析。 （A） 细胞因子表达的转录组热图。（B-E）Luminex 测定有/没有 CSE 刺激的细胞中的 CXCL-5、CSF-3、IL-1α 和 CCL-5 水平。请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

COPD 是一种常见的慢性气道炎症性疾病。暴露于烟草烟雾会导致慢性气道炎症、气道重塑和肺结构破坏，这是各种结构细胞和免疫细胞相互作用的结果¹⁰。气道上皮细胞作为肺部先天免疫系统的前线，在疾病的发展过程中起着非常重要的作用¹¹。从这个角度来看，阐明上皮细胞在有害物质的刺激下如何改变和调节下游细胞，是一个亟待解决的科学问题。

最近，已经报道了几种克服了一些局限性的 COPD 动物模型¹²。在这些模型中可以观察到中度水平的中性粒细胞气道炎症、Th1/Th17 炎症特征、明显的粘液分泌过多、气道重塑增加、肺功能下降和气腔扩大。尽管这些模型只需要 1 个月即可建立 COPD 样变化，但暴露于香烟烟雾的小鼠在 1 个月内发生的情况仍不清楚。使用长期 CSE 刺激的优点是更容易校准，这意味着气道上皮细胞可以暴露在尽可能严重的香烟刺激下而不会死亡，就像吸烟者的气道上皮细胞一样。在这种情况下，监测导致气道炎症和肺气肿形成的动态病理变化对于进一步了解与吸烟相关的 COPD 发病机制至关重要。因此，我们建立了一个 体外 模型来模拟烟雾状态，并试图监测 CSE 暴露于气道上皮细胞过程中的动态变化。此外，相对纯化的气道上皮细胞使多组学研究比整个组织更容易，这可以帮助我们找到暴露于 CSE 的气道上皮细胞中的分子和细胞反应，并高通量确定 COPD 的关键途径和治疗靶点。

在这里，描述小鼠气管上皮细胞分离的方案改编自 Hilaire 等人 ¹³ 和 You 等人 ¹⁴ 的方案，并进行了一些修改。在本研究中使用的方案中，小鼠气道上皮细胞使用气液界面和含有 CSE 的培养基繁殖并分化为含有纤毛细胞和杯状细胞的假复层结构，从而建立慢性 CSE 驯化模型。以下事件是当前模型的关键点。

考虑到颈椎脱位会机械性地拉伤颈部并物理损伤上皮细胞，并且水合氯醛麻醉也会影响气道，戊巴比妥钠被用于安乐死¹⁵。在对小鼠进行外科手术期间，仅浸入颈部和下部区域以防止酒精进入鼻腔可以增加气道上皮细胞的活力¹⁶。本研究的初步数据表明，经气管插管或酒精浸泡的气道上皮细胞活力低且无法扩增。此外，要获得没有红细胞的气道上皮细胞，在外科手术中必须小心，以避免在隔离主要气道时受到血液污染。

即使在无特异性病原体的小鼠中，气道也定植了重要的微生物。在 P0 原代小鼠气道上皮细胞的扩增培养基中添加适当的抗生素对于避免细菌或真菌病原体的污染至关重要。青霉素、链霉素、两性霉素 B 和庆大霉素¹⁷ 的混合物溶液在无菌 体外 环境中有效确保 P0 小鼠气道上皮细胞的扩增。初步实验表明，如果没有有效抑制细菌污染，P0 鼠气道上皮细胞会在第一次传代之前死亡。

在消化方法中，测试了 4 °C 和 37 °C。初步实验结果表明，37 °C 下的消化在时间效率、细胞活力和细胞产量方面优于 4 °C。

在上皮细胞接种之前，将大鼠尾部胶原蛋白溶于乙酸中，用于培养皿包衣，以改善上皮细胞粘附¹⁸。但是，胶原蛋白涂层的密度不宜太高或太低;密度不足无法提供足够的粘附条件，而过大的密度会导致培养表面出现结晶残留。

一个关键步骤是保持更多的上皮细胞存活并避免成纤维细胞污染。为了实现这些，我们建议 1） 使用无动物成分的细胞解离试剂盒可以温和地分离上皮细胞并减少不必要的细胞损伤，以及 2） 使用含有氢化可的松的差异培养基可以抑制成纤维细胞的生长并促进上皮细胞的增殖。

传统的气道上皮细胞浸没式单层培养一直是呼吸研究和毒理学研究的主要内容。然而，这些方法无法准确复制 体内发现的气道上皮组织的分化特征。为了解决这一限制，我们选择了另一种气道上皮模型。该模型基于在气液界面处的微孔膜支架（例如 transwell 系统提供的支架）上培养初级气道细胞¹⁹。在这种 ALI 培养装置中，顶端表面暴露于环境空气中有助于促进细胞分化，从而更接近地模拟 体内 条件²⁰。

如果鉴别无效，则评估潜在原因至关重要。这包括气道上皮细胞可能经历了过度传代的可能性，这可能会损害它们的分化能力。此外，必须确保在每两周一次的培养基更换过程中完全消除根尖腔内的粘液和液体积聚，因为残留内容可能会阻碍分化过程。

虽然这种模型存在一定的局限性，但它仍然是一个有价值的研究工具。一个限制是，使用含 CSE 的培养基刺激气道上皮细胞可能无法完全复制吸烟者气道上皮细胞所经历的 体内 条件。此外，分化的纤毛上皮细胞 在体外 的活力通常仅限于一个月。尽管存在这些限制，该模型还是有效地整合了几个关键方面:它有助于研究气液界面处的气道上皮细胞分化、对 CSE 的长期适应以及在一定时间范围内应用多组学分析。这种全面的方法为未来研究气道上皮细胞的生理和病理机制提供了一个复杂而全面的框架。此外，它还有助于识别气道疾病的潜在生物标志物和治疗靶点。我们希望我们的经验能为那些想用这个模型进行相关研究的人提供有用的信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x 青霉素/链霉素溶液	Gibco	15140122
24 mm Transwell 含 0.4 µm 孔聚酯膜插件，无菌	BIOFIL	TCS016012
40 µm 细胞过滤器	Falcon	352340
500x 庆大霉素/两性霉素溶液	Gibco	R01510
乙酰化 &α;-微管蛋白	CST	#5335
乙酰-&α;-微管蛋白 （Lys40） （D20G3）XP 兔单克隆抗体	cellsignal	#5335
动物成分游离试剂盒	干细胞	05426
抗泛细胞角蛋白抗体	abcam	ab7753
香烟	Marlboro
Claudin3	免疫方式	YT0949
来自牛胰腺的脱氧核糖醛酶 I	Sigma-Aldrich	DN25
来自牛胰腺的脱氧核黄绿酶 I	Sigma	DN25
Ham's F-12	Sigma-Aldrich	N6658
肝素溶液	Stemcell	07980
氢化可的松原液	Stemcell	07925
粘蛋白 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140122
肺炎 Cult-ALI 干细胞基础培养基		05002
PneumaCult-ALI 10x Stemcell		05003
PneumaCult-ALI 维持补充剂	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x 补充剂	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus 基础培养基	干细胞	05041
链霉蛋白酶 E	Sigma-Aldrich	P5147
大鼠尾部胶原蛋白	康宁	354236
台盼蓝	干细胞	07050