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方法文章

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

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DOI：

10.3791/67057

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2024年7月12日

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

本文内容

摘要

此处，我们描述了一种 体外 分离与分化小鼠气道上皮细胞的模型，重点关注其对慢性香烟烟雾提取物（CSE）的适应性。该模型可用于全面表征CSE的多组学影响，从而可能揭示细胞在长期烟雾暴露下的应答机制。

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要归因于烟草烟雾暴露。研究气道上皮细胞如何在功能上适应烟草烟雾，对于理解COPD的发病机制至关重要。本研究旨在建立一种 体外 利用原代小鼠气道上皮细胞建立模型，以模拟烟草烟雾对机体的真实影响。与永生化细胞系不同，原代细胞保留了更多 体内类特性，包括生长模式、衰老和分化。这些细胞表现出敏感的炎症反应和高效的分化能力，因而能紧密模拟生理条件。在本模型中，原代小鼠气道上皮细胞在气液界面条件下培养28天，并使用最适浓度的香烟烟雾提取物（CSE）处理，导致未分化的单层细胞转变为假复层柱状上皮，提示细胞已适应CSE环境。随后采用综合性的多组学分析，以阐明CSE影响气道基底细胞分化的分子机制。这些发现加深了我们对烟草烟雾暴露下慢性阻塞性肺疾病（COPD）进展相关细胞过程的理解。

引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有复杂特征的异质性肺部疾病，而COPD患者的发病年龄正逐渐趋于年轻化1。吸烟是COPD的主要危险因素2，对气道上皮细胞具有深远影响，而气道上皮细胞是抵御烟草烟雾的第一道屏障。尽管已知这种关联，烟草烟雾诱导气道上皮细胞发生改变的具体机制仍缺乏充分研究。深入理解这些分子层面的改变，对于发现COPD的早期诊断标志物和治疗靶点至关重要。

为弥补这一空白，我们开发了一种利用小鼠气道上皮细胞的新型体外模型。通过长期用香烟烟雾提取物（CSE）刺激这些细胞，我们能够监测细胞的动态变化，探究气道上皮细胞在长期烟草刺激下的改变及其潜在机制。在该模型中，采用Transwell系统建立气道上皮细胞的气液界面，并从上皮细胞分化的早期阶段开始施加香烟烟雾提取物刺激，持续至第28天分化完成。以往的研究仅关注气道上皮细胞的分化过程及短期刺激（以细胞系为主），且局限于单一调控通路3,4,5,6。然而，本方案采用原代小鼠气道上皮细胞，并优化了细胞分离提取流程，使细胞活性优于既往的气道上皮细胞培养方法。该模型聚焦于细胞分化过程的改变，并结合转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表观基因组学的综合分析。通过免疫荧光染色和先进的多组学技术，我们旨在阐明气道上皮细胞对慢性烟草烟雾暴露的细胞应答，从而加深对慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制的理解。该模型可用于研究多种污染物长期刺激所引起的气道上皮细胞分化模式及其机制的变化。

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方案

整个实验方案共需44天，包括1天用于制备从小鼠气管分离的气道上皮细胞，15天用于细胞增殖，以及28天在气液界面进行CSE刺激。所有实验动物均饲养于首都医科大学实验动物中心的SPF屏障动物房，并已通过首都医科大学实验动物与实验室动物伦理委员会（AEEI-2020-100）的审查和批准，符合ARRIVE指南的要求7。

1. 从小鼠气管中分离原代小鼠气道上皮细胞

  1. 准备
    1. 通过将1 mL的50倍补充剂和0.05 mL氢化可的松储备液加入48.95 mL扩增基础培养基中，配制完全扩增培养基。4 °C保存，并在4周内使用。
    2. 将7.5 mg蛋白酶和5 mg脱氧核糖核酸酶I溶解于5 mL Ham's F-12培养基中，制备蛋白酶溶液。过滤除菌后，4 °C保存，并在4周内使用。
    3. 通过向5 mL完全扩增培养基、PBS和蛋白酶溶液中分别加入0.05 mL 100倍青霉素/链霉素和0.01 mL 500倍庆大霉素/两性霉素，配制抗生素溶液（终浓度为100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10 µg/mL庆大霉素和0.25 µg/mL两性霉素B）。4 °C保存，并在4周内使用。
    4. 对手术器械进行灭菌，并准备生物安全柜用于细胞分离。同时，确保标准细胞培养设备已准备就绪。
    5. 通过将鼠尾胶原（溶于0.02 N乙酸，浓度为100 µg/mL）加入100 mm培养皿和24 mm Transwell小室（0.05 mL/cm2），制备鼠尾胶原包被的培养皿。在紫外线下敞口过夜以灭菌。
  2. 原代小鼠气道上皮细胞的分离
    1. 使用C57BL/6小鼠（6–8周龄，雄性，SPF级饲养）进行气管上皮细胞分离。以1%戊巴比妥钠溶液过量注射（约200 mg/kg）实施安乐死。使用五只小鼠以获得足够的细胞产量。
    2. 将小鼠浸入75%乙醇溶液中进行表面消毒，但避免将鼻部和口部浸入酒精，以防酒精流入气管。
    3. 解剖小鼠。
      1. 使用手术刀和镊子，用一套器械从下颌至腹腔切开并分离小鼠表皮。
      2. 使用另一套手术器械分离两侧甲状腺，并去除气管与周围肌肉组织及食管之间的连接。
      3. 随后小心切开胸腔，用镊子深入胸腔，取出整个肺组织，并找到气管末端。
    4. 处理气管。
      1. 从甲状软骨至气管支气管分叉处切取气管，放入含四种抗生素的预冷扩增培养基中。
      2. 振荡离心管以尽可能冲洗掉气管表面的血液，保持在冰上，并开始下一只小鼠的手术操作。
    5. 将所有收集的气管转移至含四种抗生素的预冷PBS缓冲液中（200 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素、20 µg/mL庆大霉素和0.5 µg/mL两性霉素B），用于消化前的预处理。
    6. 使用一套手术器械去除气管表面的血凝块和其他组织，然后将其切成1 cm2大小的片段。
    7. 将气管组织在37 °C的蛋白酶溶液中孵育40分钟。
    8. 40分钟后，轻轻摇动离心管数次，用40 µm细胞筛去除残留组织。用5 mL扩增培养基冲洗筛网上的气管碎片，将细胞悬液在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    9. 将获得的细胞重悬于8 mL扩增培养基中。
    10. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对活细胞进行计数。
    11. 将P0代细胞悬液接种于预先包被鼠尾胶原的100 mm培养皿中（接种密度为1 × 104个活细胞/cm2），并在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。

2. 原代小鼠气道上皮细胞的扩增培养与传代

  1. 每3天更换一次P0代细胞培养液，直至细胞达到70%-80%融合度，通常在6天内完成。此时，小鼠气管上皮细胞可形成完整单层，呈现铺路石样外观（图1A-D）。
  2. 将足量的PBS、完全扩增培养基以及无动物组分（ACF）细胞解离试剂盒预热至37 °C。
  3. 用3 mL PBS轻柔冲洗细胞。
  4. 进行酶解解离。
    1. 向培养皿中加入3 mL ACF酶解解离液，37 °C孵育5分钟。吹打后轻柔使细胞脱落，并将细胞悬液转移至3 mL ACF酶抑制液中。
    2. 再次加入3 mL ACF酶解解离液，继续孵育5分钟，以确保细胞最大程度解离。
  5. 在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟收集细胞悬液，弃去上清液。
  6. 用1 mL扩增培养基重悬细胞。
  7. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对活细胞进行计数。
  8. 将P1代细胞悬液接种于多块预先包被大鼠尾胶原的100 mm培养皿中（接种密度为5 × 104 个活细胞/cm2），置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。

3. 小鼠原代气道上皮细胞在气液界面的分化及香烟烟雾提取物刺激

  1. 确认细胞类型。
    1. 使用针对细胞角蛋白的免疫荧光检测（IFA）验证分离细胞的上皮来源。将细胞接种于经大鼠尾胶原包被的玻片上，待细胞融合度达到80%后，使用多聚甲醛固定至少12小时。
    2. 用PBS溶液清洗玻片3次，每次5分钟，在室温（RT）下用含3% BSA和0.1% Triton X-100的PBS溶液封闭1小时。
    3. 在4 °C下用商品化的广谱抗细胞角蛋白抗体（1:500稀释）孵育玻片过夜。
    4. 次日，用PBS溶液清洗玻片3次，每次5分钟，然后在避光条件下，室温下用二抗缓冲液（1:1000稀释）孵育2小时。
    5. 孵育结束后，用PBS清洗玻片3次（每次5分钟），加入DAPI（1:1000稀释），室温孵育15分钟后，再用PBS清洗一次，持续5分钟。
    6. 在荧光显微镜下观察玻片，并将表达模式与阳性对照（A549细胞系）和阴性对照（Raw264.7细胞系）进行比较（图2）。
  2. 接种细胞以进行分化。
    1. 按照前述方法消化并离心P2代细胞，将细胞沉淀重悬于适量扩增培养基中，以便以1 × 104 个活细胞/cm2 的密度接种。
    2. 将1 mL细胞悬液加入Transwell聚碳酸酯膜插入式培养板的顶端室中，在基底室中加入1.5 mL增殖培养基。
  3. 将细胞在37 °C培养，每隔3天完全更换顶端室和基底室的培养基，使用扩增培养基，直至细胞达到融合状态，通常需要3–6天。
  4. 通过向44.15 mL ALI基础培养基中加入5 mL ALI 10x补充剂、500 µL ALI维持补充剂、100 µL肝素溶液和250 µL氢化可的松储备液，配制50 mL完全分化培养基。
  5. 制备香烟烟雾提取物（CSE）。
    1. 将一支香烟的烟雾通入12.5 mL分化培养基中，然后经0.22 µm孔径滤膜过滤，以制备CSE。为确保不同实验及不同批次CSE之间的标准化，使用分光光度计在320 nm处测定吸光度，并将光密度（OD）值定义为1时记为100%8。
  6. 使用含有适当浓度CSE的分化培养基刺激原代小鼠气道上皮细胞，以检测其对细胞分化的影响。
  7. 让细胞分化28天，在此期间定期更换基底室培养基，并每周两次清洗顶端面：移除顶端室培养基，并用含适当浓度CSE的分化培养基替换基底室培养基。
  8. 暴露后分析细胞。
    1. 在暴露于含CSE的分化培养基后，可在任意时间点（即0–28天）收集细胞及培养上清液，用于检测形态学变化（如免疫荧光检测（IFA）或苏木精-伊红染色（HE）），或进行生物信息学分析（如转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）。

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结果

分化
小鼠气道上皮细胞在气液界面培养条件下，使用分化培养基培养28天后成功实现分化。通过免疫荧光染色检测纤毛细胞标志物乙酰化α-微管蛋白（绿色；图3A）和杯状细胞标志物Mucin5AC（红色；图3B），证实了纤毛细胞和杯状细胞的存在。

确定用于细胞分化的CSE浓度
用不同浓度的CSE刺激分离的上皮细胞24小时。结果显示，当CSE浓度高于6%时，上皮细胞的活力下降（p <0.05，图4A）。为了在长期刺激下维持细胞活性，使用含2%、4%和6% CSE的培养基刺激上皮细胞分化28天。此外，结果表明，随着CSE浓度的增加，上皮细胞未出现显著的细胞死亡（图4B），但细胞间的跨膜电阻（TEER）（图4C）和脱...

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讨论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的慢性气道炎症性疾病。烟草烟雾暴露可导致慢性气道炎症、气道重塑以及肺组织结构破坏，这是多种结构细胞与免疫细胞相互作用的结果10。作为肺部固有免疫系统的第一道防线，气道上皮细胞在疾病发展过程中发挥着至关重要的作用11。从这一角度来看，阐明上皮细胞在有害物质刺激下如何发生改变并调控下游细胞，是当前亟待解决的科学问题。

近期，已有数种克服了部分局限性的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型被报道12。在这些模型中可观察到中等程度的中性粒细胞性气道炎症、Th1/Th17型炎症特征、显著的黏液过度分泌、气道重塑增加、肺功能下降以及肺泡腔扩大。尽管这些模型仅需1个月即可建立类似COPD的改变，但香烟烟雾暴露1个月内小鼠体内发生的变化仍不明确。采用长期CSE刺激的优势在于更易于校准，这意味着气道上皮细胞可在不致死的情况下暴露于尽可能严重的香烟刺激，类似于吸烟者气道上皮细胞所处的状态。因此，监测导致气道炎症及肺气肿形成的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82090013）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100倍青霉素/链霉素溶液Gibco15140122
24 mm Transwell，带0.4 µm 孔径聚酯膜插件，无菌BIOFILTCS016012
40 µm 细胞筛Falcon352340
500倍庆大霉素/两性霉素溶液GibcoR01510
乙酰化 α-微管蛋白CST#5335
乙酰-α-微管蛋白 (Lys40) (D20G3)XP 兔单克隆抗体 cellsignal#5335
无动物成分细胞解离试剂盒Stemcell05426
广谱细胞角蛋白抗体abcamab7753
香烟万宝路
Claudin3immunowayYT0949
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigma-AldrichDN25
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
肝素溶液 Stemcell07980
氢化可的松储备液Stemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
青霉素-链霉素溶液Gibco15140122
PneumaCult-ALI
基础培养基		Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10倍补充剂Stemcell05003 
PneumaCult-ALI 维持补充剂Stemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50倍补充剂Stemcell05042
PneumaCult-Ex Plus 基础培养基Stemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
大鼠尾胶原蛋白Corning354236
台盼蓝Stemcell07050 

参考文献

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