Summary

使用细胞增殖染色鉴定斑马鱼 T 细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞

Published: July 19, 2024
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Summary

我们使用细胞增殖染色来识别斑马鱼 T 急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞。染色保留在非分裂细胞中,并在细胞增殖过程中减少,从而能够选择休眠细胞进行进一步检测。该协议提供了一种功能工具,用于在细胞静止的背景下研究自我更新。

Abstract

细胞静止是在正常干细胞和癌症干细胞 (CSC) 中描述的一种生长停滞或增殖缓慢的状态。静止可以保护 CSCs 免受抗增殖化疗药物的影响。在 T 细胞急性淋巴细胞白血病 (T-ALL) 患者来源的异种移植物 (PDX) 小鼠模型中,静止细胞与治疗耐药性和干性相关。细胞增殖染料是追踪细胞分裂的常用工具。荧光染料共价锚定在细胞膜上的胺基和大分子中。这允许追踪标记细胞多达 10 次分裂,这可以通过流式细胞术解决。

最终,增殖率最高的细胞将具有较低的染料保留率,因为它会在每次细胞分裂时被稀释,而休眠、分裂较慢的细胞将具有最高的保留。使用细胞增殖染料分离休眠细胞已在 T-ALL 小鼠模型中得到优化和描述。作为现有小鼠模型的补充, rag2:Myc 衍生的斑马鱼 T-ALL 模型提供了一个极好的场所来询问 T-ALL 中的自我更新,因为白血病干细胞 (LSC) 的频率很高,并且斑马鱼便于进行大规模移植实验。

在这里,我们描述了用细胞增殖染料对斑马鱼 T-ALL 细胞进行染色的工作流程,优化斑马鱼细胞的染料浓度,在 体内成功染色的细胞,以及通过从移植动物中分选活细胞来收集具有不同染料保留水平的细胞。鉴于 T-ALL 中缺乏成熟的 LSC 细胞表面制造器,这种方法提供了一种在 体内询问静止细胞的功能性手段。为了获得代表性结果,我们描述了高和低染料保留细胞的植入效率和 LSC 频率。该方法可以帮助研究静止细胞的其他特性,包括药物反应、转录谱和形态。

Introduction

成体干细胞负责给定器官中分化细胞类型的再生,并且主要以休眠、非分裂状态存在 1,2。例如,维持血液的造血干细胞 (HSC) 在很大程度上保持静止状态,只有一小部分进入细胞周期进行自我更新或分化以产生成熟血液成分3。同样,在癌症中,一种称为癌症干细胞 (CSC) 的罕见细胞亚群具有自我更新能力,并负责恶性肿瘤的长期维持4。癌症干细胞在体内以静止或缓慢生长的状态存在,这可能使它们能够逃避抗增殖癌症治疗5,逃避免疫系统的清除6,减少氧化应激,并增强其 DNA 修复途径7。即使治疗后留下的少量 CSCs 也有可能使肿瘤重新繁殖,从而导致患者复发8。因此,了解细胞静止对于识别 CSCs 的潜在脆弱性和开发靶向它们的新方法具有很大的希望。

细胞增殖染料,如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 染料及其衍生物,通常用于跟踪细胞分裂的频率9。染料渗透到细胞膜上,一旦进入细胞,就会被细胞内酯酶激活成荧光产物。所得荧光化合物通过琥珀酰亚胺基团和细胞内蛋白的胺官能团之间形成的共价酰胺键保留在细胞内10。每次细胞分裂时,荧光化合物在两个产生的细胞之间平均分配,导致信号稀释两倍。该染料可通过流式细胞术分析检测多达 10 次细胞分裂11

这种方法以前已被用于通过识别染料保留率高的慢循环细胞群来丰富体外 CSC 细胞群11,12。在 T-ALL 中,CFSE 已用于跟踪小鼠患者来源的异种移植物体内肿瘤生长。在细胞标记和移植 3 周后,流式细胞术分析显示,罕见的细胞群仍保留 CFSE 荧光。该群体与干性、治疗耐药性以及与患者13 中导致复发的细胞的高度相似性相关。因此,该染料为研究 T-ALL 中的白血病干细胞 (LSC) 表型提供了有用的工具。

这项工作的目的是将细胞增殖染料的应用扩展到使用斑马鱼 T-ALL 模型研究 体内 静止。特别是, rag2:Myc 驱动的斑马鱼 T-ALL 模型14 为研究自我更新提供了极好的场所,因为与小鼠模型和人类疾病相比,LSC 的频率很高15。此外,斑马鱼的使用允许进行大规模的移植研究,与小鼠相比,这可以以低得多的护理和维护成本完成16。斑马鱼也非常适合实时成像应用,因为可以使用简单的荧光显微镜轻松观察荧光标记的肿瘤细胞,以估计肿瘤的发展速度16

在该方案中,我们描述了用细胞增殖染料对斑马鱼 T-ALL 细胞进行染色,然后在同基因 CG1 斑马鱼中对染色细胞进行体内 繁殖的工作流程。在白血病发展时,我们描述了保留染料的细胞的分选及其用于随后的有限稀释移植实验,以量化 LSC 自我更新的速率。该方案可以扩展到其他应用,包括靶向静态 LSC 的潜在化合物的 体内 药物筛选。此外,收集的细胞可用于不同的下游分析,例如转录组学分析、蛋白质组学和代谢组学,为 T-ALL 中静止 LSC 的行为提供独特的见解。

Protocol

在该方案中,我们使用 GFP 标记的斑马鱼 T-ALL 细胞,这些细胞先前在 CG1 菌株中产生,因此可以直接注射到受体同基因 CG1 斑马鱼15 中。简而言之,通过将 rag2:Myc 和 rag2:GFP 的 DNA 显微注射到单细胞 CG1 斑马鱼胚胎中产生白血病。使用荧光显微镜从注射后 3 周开始监测动物的白血病发展。分离 GFP 阳性白血病细胞 FACS 并连续移植到受体 CG1 斑…

Representative Results

我们按照上述方案对保留细胞增殖染料 CT-FR 的细胞进行分选,并将它们用于极限稀释测定 (LDA) 以估计 CT-FR High 和 CT-FR Low 群体中的 LSC 频率。为了设置流式细胞术实验的门控,除了单色对照外,我们还使用了无荧光团(无颜色)对照 (图 2A)。这些象限用于识别 FITC 和 PE 阳性和阴性群体,以设置排序门。在分选的同一天,通过对未?…

Discussion

已知 LSC 对常规的抗增殖化疗具有耐药性,寻找针对这些细胞的靶向疗法在减少复发发生和改善患者预后方面具有很大的前景20。以前的研究描述了使用 T-ALL PDX 模型中的荧光细胞增殖染色剂来识别与耐药性和干性相关的一小部分静止细胞群13。在这项工作中,我们描述了使用类似的细胞增殖染色来分辨 T-ALL 斑马鱼模型中的缓慢分裂或静…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究的资金由美国国家癌症研究所 (R37CA227656 JSB) 提供。这项研究也得到了肯塔基大学马基癌症中心 (P30CA177558) 的流式细胞术和免疫监测共享资源的支持。

Materials

26 G/2” micro-syringe Hamilton 87930 NA
35 µm filter cap FACS tubes Falcon 352235 NA
40 µm cell strainer CELLTREAT 229482 NA
96-well skirted PCR plate Thermo Fisher Scientific AB0800 NA
Cell sorter Sony Biotechnology SY3200 NA
CellTrace Far Red Thermo Fisher Scientific C34564 NA
Conical tubes VWR 10026-078 NA
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248 NA
DMSO Sigma-Aldrich D4818 NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) Caisson Labs 22110001 NA
Epifluorescence stereo microscope Nikon SMZ25 NA
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich 12306C NA
Fish system water N/A N/A 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific C2171 NA
MS-222 Pentaire TRS-1 tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes Corning 07-202-011 NA
Razor blades American Line 66-0089 NA
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific T10282 NA

References

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118 (2), 149-161 (2004).
  3. Li, L., Bhatia, R. Stem cell quiescence. Clin. Cancer Res. 17 (15), 4936-4941 (2011).
  4. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  5. Chen, W., Dong, J., Haiech, J., Kilhoffer, M. -. C., Zeniou, M. Cancer stem cell quiescence and plasticity as major challenges in cancer therapy. Stem Cells Int. 2016, 1740936 (2016).
  6. Kleffel, S., Schatton, T. Tumor dormancy and cancer stem cells: Two sides of the same coin. Adv Exp Med Biol. 734, 145-179 (2013).
  7. Tuy, K., Rickenbacker, L., Hjelmeland, A. B. Reactive oxygen species produced by altered tumor metabolism impacts cancer stem cell maintenance. Redox Biol. 44, 101953 (2021).
  8. Zhou, B. -. B. S., et al. Tumour-initiating cells: Challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 806-823 (2009).
  9. Lyons, A. B., Blake, S. J., Doherty, K. V. Flow cytometric analysis of cell division by dilution of cfse and related dyes. Curr Protoc Cytom. 64 (1), 11-12 (2013).
  10. Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of cfse dye dilution. J Immunol Methods. 243 (1-2), 147-154 (2000).
  11. Azari, H., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse) to identify quiescent glioblastoma stem-like cells. Methods Mol Biol. 1686, 59-67 (2018).
  12. Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse). J Vis Exp. (62), e3918 (2012).
  13. Ebinger, S., et al. Characterization of rare, dormant, and therapy-resistant cells in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 30 (6), 849-862 (2016).
  14. Langenau, D. M., et al. Myc-induced t cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  15. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation. Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).
  16. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
  17. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. (53), e2790 (2011).
  18. Borga, C., et al. Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).
  19. Hu, Y., Smyth, G. K. Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  20. Bhojwani, D., Pui, C. -. H. Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).
  21. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
  22. Al-Hamaly, M. A., et al. Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia. Biomed Pharmacother. 170, 116013 (2024).
  23. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).

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Al-Hamaly, M. A., Chernyavskaya, Y., Blackburn, J. S. Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining . J. Vis. Exp. (209), e67059, doi:10.3791/67059 (2024).

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