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方法文章

一种改良的中动脉闭塞再灌注模型制备方法

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DOI：

10.3791/67060

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2024年5月31日

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1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

本文内容

摘要

本方案描述了通过颈总动脉进行大脑中动脉闭塞再灌注的准备工作流程。

摘要

大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO/R）模型对于理解中风的病理机制及药物开发至关重要。然而，在常用的建模方法中，Koizumi 法因结扎颈总动脉（CCA）且难以实现充分的再灌注而常受质疑；同样，Longa 法也因切断并结扎颈外动脉（ECA）而受到批评。本研究旨在介绍一种改良的模型制备方法，该方法保留 ECA 的完整性，通过 CCA 插入单丝尼龙线栓，修复结扎后的 CCA 切口，并维持来自 CCA 的再灌注。通过激光散斑血流成像确认了血流再灌注。采用 Longa 评分、改良神经功能缺损评分（mNSS）、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色以及神经元免疫荧光标记等评估方法，证明该方法可诱导稳定的缺血性神经损伤。这种改良的 MCAO/R 模型方案操作简便且稳定可靠，为脑缺血领域研究人员提供了有价值的实践指导。

引言

根据世界卫生组织的数据，过去十年中，脑卒中一直是全球第二大死亡原因，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点1,2。随着全球人口老龄化，发展中国家脑卒中的发病率预计将进一步上升，可能成为成年人过早死亡和残疾的首要原因。此外，脑卒中发病年轻化的趋势也日益明显3。脑卒中后劳动力的丧失也给家庭和社会带来沉重负担4。因此，开发安全有效的治疗方法成为脑卒中研究领域面临的主要挑战。

动物模型是研究人类疾病预防与治疗的重要工具。脑卒中治疗策略的成功转化依赖于脑卒中动物模型的可重复性与可靠性5,6。大脑中动脉（MCA）是临床脑卒中常见的发病部位，因此MCAO模型是与人类缺血性脑卒中最为接近的模型。采用线栓法制作的MCAO模型因其无需开颅、缺血时间易于控制等优势，受到研究人员的广泛青睐，已应用于超过40%的神经保护实验中7。然而，尽管该模型具有诸多优势，其操作细节仍是许多研究人员争议的焦点。

对于线栓法诱导的中动脉闭塞（MCAO）模型，再灌注通过撤出线栓实现。目前，线栓插入主要有两种方法：Koizumi法8和Longa法9。在Koizumi法中，线栓主要经由颈总动脉（CCA）切口进入颈内动脉（ICA）；而在Longa法中，线栓则通过切断的颈外动脉（ECA）进入ICA。再灌注过程中，Koizumi法需要永久结扎CCA切口，并依赖Willis环实现再灌注10。然而，一些研究表明，在失去CCA供血后，仅靠Willis环的代偿供血难以实现有效的再灌注。此外，Willis环具有较高的解剖学变异率，尤其是在C57Bl/6小鼠中，这会增加梗死范围的变异性，降低实验数据的可靠性。因此，该方法正受到研究人员越来越多的质疑11。

Longa 法涉及将缝线插入切断的颈外动脉（ECA），然后在撤出缝线后永久结扎颈内动脉（ICA）。该方法可保持颈总动脉（CCA）通畅，使血流灌注达到基线值的 100%。然而，该方法需要分离颈外动脉及其细小动脉分支，并将其切断或电凝，使手术操作变得困难。此外，该方法破坏了脑部完整的血流结构，与临床患者的状态存在差异12。重要的是，研究表明，切断或结扎 ECA 可导致控制咀嚼和吞咽的肌肉发生缺血性病变，影响动物进食，引发术后动物死亡，并导致大鼠出现严重的感官和运动功能损伤13,14。

因此，迫切需要一种改进的模型制备方法来解决这些问题。本研究介绍了一种改良的MCAO建模方法，该方法修复了颈总动脉（CCA）插管切口并实现了有效的再灌注。该操作简便、实用且可行，可诱导显著的神经功能损伤和可重复的梗死病灶，为脑卒中研究者提供了有价值的指导。

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方案

实验方案严格遵循成都中医药大学实验动物使用与机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南（记录编号：2019-DL-002）。所有动物实验数据均按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行记录。本研究采用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重为250 g ± 20 g，年龄为6–8周。实验所用动物、试剂和设备的具体信息列于材料表中。

1. 动物准备

  1. 使用 Zoletil 50（50 mg/kg，肌内注射）和盐酸赛拉嗪（40 mg/kg，腹腔注射）诱导并维持大鼠深度麻醉。在整个手术过程中，使用连接加热垫的直肠探头将体温维持在 37 ± 0.5 °C。在大鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
  2. 剃除大鼠头部和颈部的毛发。使用脱毛膏去除头颈部的毛发，然后用生理盐水冲洗干净。使用无菌棉球，以乙醇和聚维酮碘对术区皮肤进行三次消毒。
  3. 使用手术刀沿矢状缝方向在大鼠头部中央做一条长约 2 cm 的切口，并小心剥离覆盖颅骨的肌肉组织。
  4. 使用颅骨钻对大鼠缺血侧颅骨进行磨薄处理。在研磨过程中使用生理盐水冷却并清除碎屑。使用激光散斑对比成像（LSCI）记录大鼠的基础血流值。
  5. 使用无菌棉球以乙醇和聚维酮碘对颈部皮肤进行三次消毒。使用手术刀沿颈部正中线做一条长约 2 cm 的切口。使用牵开器将皮肤和唾液腺向两侧牵拉，暴露胸锁乳突肌和颈肌。
  6. 分离胸锁乳突肌和颈肌以暴露颈动脉区域。辨认总颈动脉（CCA）、内颈动脉（ICA）和外颈动脉（ECA）的血管解剖结构。根据血管解剖结构，分离 CCA 以及由 CCA 分出的 ECA 和 ICA15。
    注意：大鼠的解剖结构显示，CCA 区域主要被胸锁乳突肌和颈肌覆盖，ICA 和 ECA 均由 CCA 分出。分离暴露 CCA 后，沿 CCA 可见 Y 形分叉，即为 ICA 和 ECA。操作时需注意避免损伤与 CCA 平行走行的迷走神经。

2. 大脑中动脉闭塞

  1. 使用3-0丝线在颈外动脉（ECA）和颈总动脉（CCA）上打一个易于解开的结，以暂时阻断血流。在距离第一个结约0.5 cm处的CCA上放置一个血管夹。
    1. 将5 mL注射器的针头染成黑色。用染黑的针头在CCA上刺一个小孔，并用黑色标记穿刺点。
  2. 通过黑色标记处将单丝尼龙缝线插入CCA。打开血管夹，将尼龙线沿颈内动脉（ICA）推进，直至遇到轻微阻力而停止。扎紧第二个结，确保尼龙缝线牢固固定在动脉内，防止其从阻塞位置移位。
  3. 记录此时缺血开始的时间，并使用LSCI测量缺血侧的血流值。向颈部伤口滴加布比卡因以缓解疼痛，随后缝合伤口。移除麻醉面罩，让大鼠恢复清醒。
    注意：若单丝尼龙缝线进入ICA时遇到困难，可稍作回撤，重新尝试插入。

3. MCAO 再灌注

  1. 缺血90分钟后，使用异氟烷重新麻醉大鼠。采用激光散斑血流成像技术（LSCI）测量缺血侧的脑血流量，并确认单丝尼龙缝线未发生移位。
  2. 解开外部颈动脉（ECA）上的结，以允许血液再灌注。松开颈总动脉（CCA）上的结，固定单丝缝线后将其撤出。在固定缝线前方放置血管夹，以防止出血。
  3. 将第一个CCA结替换为血管夹。使用镊子将血管切口向侧方旋转（图1）。用镊子夹住切口，并使用6-0缝线结扎以修复切口。移除血管夹，检查是否有渗漏，并确认完全再灌注（视频1）。
    注意：应通过结扎修复切口，避免过度夹闭血管，以防导致颈总动脉狭窄。
  4. 在切口结扎后，使用LSCI记录大脑皮层血流值，以确认再灌注成功。用缝线闭合颈部切口，并注射100,000单位青霉素和2 mL生理盐水，以预防感染和脱水。
  5. 维持动物体温直至大鼠恢复意识。术后提供软食，并监测动物的生命体征。

4. 神经功能及脑缺血损伤的评估

  1. 大鼠完全苏醒后，由不了解动物分组情况的研究人员对其神经功能进行评估。采用Longa评分标准（表1）以及改良的神经功能缺损评分（mNSS）量表（表 2) 以评估所有大鼠的神经功能。
  2. 术后24小时，在异氟烷诱导麻醉（4%异氟烷，4 L/min氧气）下处死大鼠 通过 颈椎脱位16 （遵循机构批准的方案）。用冰水冲洗脑组织以去除任何残留血液。
  3. 将脑组织分为5个切片，用TTC染色。使用Image J软件拍摄并测量脑组织切片两面的缺血区域，然后根据以下公式计算梗死率：
    体积公式方程：V=1/3 h(S₁+√(S₁×S₂+S₂))，用于几何计算。
    注意：S1 和 S2 分别代表脑切片近端前脑和近端脑干侧的梗死区域。每个脑切片的梗死面积均使用Swanson公式进行校正，其中h表示脑切片的厚度。该公式此前已在作者的先前研究中提出。17，可更准确地计算梗死病灶的大小。
  4. 使用统计与绘图软件分析数据，以评估模型的成功率与稳定性。
  5. 采用免疫荧光法标记大鼠皮层神经元，进一步验证该方法所致的神经元损伤。大鼠经历24小时缺血-再灌注后，经心脏灌注预冷的PBS以获取脑组织。
  6. 将脑组织包埋并冷冻切片。使用神经元抗体，例如未成熟神经元标志物Doublecortin（DCX）18，神经元核标记物神经元核（NeuN）18以及神经元树突标记物微管相关蛋白-2（MAP-2）19使用激光共聚焦显微镜观察缺血性神经元的表达。

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结果

激光散斑血流成像显示，在单丝尼龙缝线阻塞之前，大脑中动脉（MCA）区域存在丰富的血流，同时记录了大鼠的基线血流值。MCA阻塞后，脑缺血侧的血流值迅速下降。在撤出缝线前，重新检测缺血侧的血流值，以确认缝线是否成功阻塞MCA。结果显示血流仅有轻微变化。撤出缝线后，血流灌注迅速恢复（图2）。视频1还显示了颈总动脉强烈的充盈脉搏，表明该方法可在脑缺血后实现充分的血流灌注。

神经功能评分结果（图3）显示，与假手术组相比，模型组的Longa评分为1.80 ± 0.27（p < 0.05），mNSS评分为7.4 ± 0.89（p < 0.05）。这些评分表明，采用该方法制备的中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型导致了显著的神经功能损伤。视频2展示了模型组大鼠爬行时出现旋转行为的典型特征，这是脑卒中损伤的标志性表现，进一步验证了该方法的有效性。

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讨论

通过单丝尼龙线诱导的中动脉闭塞（MCAO）模型是制备MCAO模型最常用的方法。该方法因操作简便、无需开颅、手术创伤小以及能够实现再灌注等优点，已被广泛应用于临床前研究，并获得众多研究者的认可。

大脑中动脉栓塞（MCAO）的颅内缝线法有两种经典外科技术：小泉法8和Longa法9。这两种方法的主要区别在于阻塞大脑中动脉（MCA）时缝线的引入方式。在小泉法中，缝线通过颈总动脉（CCA）切口插入至颈内动脉（ICA），缝线前端涂有硅胶，用于阻塞MCA的起始部位。相反，在Longa法中，缝线通过切断的颈外动脉（ECA）插入至颈内动脉（ICA），缝线前端膨胀成球形，以阻塞MCA的起始部位（图5）。在再灌注过程中，缓慢撤出缝线以恢复血流。

Longa 法涉及通过切断的颈外动脉（ECA）将缝合线引入颈内动脉（ICA）。该过程需要分离并切断 ECA，同时分离并去除其细小分支，再使用电凝笔将其切...

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致谢

本工作得到国家自然科学基金（82173781 和 82373835）、博士后科研项目（BKS212055）、佛山市科技局科技创新项目（2320001007331）、广东省基础与应用基础研究基金（2019A1515010806）、广东省普通高校重点领域项目（智能制造）（2020ZDZX2057）以及广东省普通高校科学研究项目（特色创新）（2019KTSCX195）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物麻醉系统Rayward Life Technology Co., LtdR500IE
动物体温维持仪Rayward Life Technology Co., Ltd69020
Cy3 二抗武汉赛维尔生物科技有限公司GB21303
DAP1 抗体武汉赛维尔生物科技有限公司G1012
DCX 抗体武汉赛维尔生物科技有限公司GB13434
羊血清碧云天生物技术有限公司C0265
GraphPad PrismGraphPad SoftwareGraphPad Prism 8.0
ImageJ美国国立卫生研究院ImageJ 软件
异氟烷Rayward Life Technology Co., LtdR510-22
激光散斑血流成像系统Rayward Life Technology Co., LtdPeriCam PSI NR
MAP-2 抗体武汉赛维尔生物科技有限公司GB11128
微型手持式颅骨钻Rayward Life Technology Co., Ltd87001
单丝缝合线Rayward Life Technology Co., Ltd250-280g
NeuN 抗体武汉赛维尔生物科技有限公司GB11138
OCT 包埋剂BIOSHARPBL557A
青霉素钠成都科龙化工试剂有限公司17121709-2
冰冻切片快速抗原修复液碧云天生物技术有限公司P0090
SD 大鼠SPF(北京)生物技术有限公司250-280g
吐温 X-100碧云天生物技术有限公司ST795
TTC成都科龙化工试剂有限公司2019030101

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