通过电凝建立的阻塞性慢性胰腺炎模型

摘要

本协议描述了一种模拟慢性阻塞性胰腺炎的新方法，该方法涉及胰管的可视化和胰管的电凝以引起胰管阻塞。

摘要

慢性胰腺炎（CP）是一种严重的炎症性疾病，可破坏胰腺，导致糖尿病，增加胰腺癌风险，严重影响患者的生活质量。解决脑瘫是胃肠病学的一个关键研究重点。我们开发了一种新的动物模型来克服现有动物模型的局限性，使用 8 周大的 C57BL/6 雄性小鼠。

在麻醉小鼠通过腹部手术暴露胰腺后，我们夹住肝脏附近的胆总管，以防止亚甲蓝进入其中。将毛细血管插入胆管注入染料，然后对胰管进行染色。胰管可视化后，选择胆总管与胰十二指肠上动脉之间位置的中下2/3位置的胰腺进行电凝。当无法识别蓝色染色溶液时终止电凝。然后关闭腹部，小鼠正常饲养。术后7、14、21、28天，采用HE染色、Masson染色、免疫组化检查胰腺，分析血清生化参数。14 d后的病理与慢性胰腺炎的特征非常吻合，血清生化参数也与慢性胰腺炎的特征非常吻合。

引言

慢性胰腺炎（CP）是一种严重的进行性炎症性疾病，导致胰腺破坏，表现为腹痛和消化系统疾病。随着时间的推移，它会导致糖尿病并增加患胰腺癌的风险。因此，建立脑瘫动物模型并制定有效的治疗策略至关重要。

胰腺外分泌腺泡细胞产生和分泌大量的消化酶。当细胞器和蛋白质稳态调节被破坏时，会导致细胞内胰蛋白酶原激活不当，最终导致腺泡细胞损伤和胰腺炎的发展¹.

先前的研究表明，小鼠模型，尤其是那些由重复注射^{cerulein 2} 和胰管手术结扎 ^3,4 诱导的小鼠模型，有助于研究 CP。cerulein 可诱发急性胰腺炎，可能转变为慢性状态，但其缺乏特定的胰管阻塞限制了其在模拟阻塞性胰腺炎方面的临床意义。虽然手术结扎更好地模仿了人类脑瘫的阻塞性质，但它具有高度侵入性，难以执行，并且通常会导致严重的全身影响，阻碍了局部导管病变的研究。

为了解决这些局限性，提出了一种通过电凝进行的新的阻塞性 CP 模型。与胰管结扎的原理类似，它阻塞了胰管，但更容易执行，成功率更高。研究人员提出，在猪主胰管进行射频消融是诱导胰腺萎缩的安全有效的方法⁵，这也表明用高频电凝切断胰主管可能会产生类似的效果。该技术包括逆行胰管穿刺和亚甲蓝溶液注射进行导管染色，然后电凝以诱导局部导管阻塞 （图1）。这种方法会诱发炎症和纤维化，模拟人类阻塞性脑瘫，同时避免广泛的炎症反应和全身并发症。与传统模型相比，电凝模型具有多种优点：它专门针对胰管，减少变异性，并减轻全身并发症。它提供了一种更具疾病特异性、可重复性和通用的方法来了解 CP 中导管阻塞的机制及其在疾病进展中的作用。

方案

所描述的所有动物实验均已获得海军军医大学动物使用和护理委员会的批准。确保所有手术材料都是无菌的。

1. 剖腹手术

1. 通过腹腔注射给予氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物以进行麻醉诱导。通过评估脚反射和角膜反射的丧失来监测麻醉深度。根据需要提供额外剂量（初始剂量的 20%），以在手术过程中保持足够的麻醉。通过捏住脚趾来确认足够的麻醉深度。将动物放在加热垫上以保持体温。
2. 使用修剪器剃掉胸部和下腹部之间的毛发（~2 cm²）。用洗必泰/碘和酒精交替对手术区域进行 3 次消毒。
3. 使用手术胶带将小鼠固定到手术板上并贴上无菌手术单。
4. 用剪刀在中央腹部做一个2厘米长的切口，然后在上腹部和剑突之间做一个1厘米长的切口。

2. 定位并暴露胰腺

1. 在扩腹器的帮助下，找到将进行电凝的胰腺区域。
2. 在无菌棉签的帮助下，从左上腹部后部识别十二指肠，转动十二指肠以观察连接肝脏的透明胆管。

3. 追踪手术部位

1. 使用微血管夹暂时闭塞近端胆总管，防止逆行输液渗漏到肝脏中。
2. 将内径为0.25毫米、外径为0.35毫米的聚乙烯管连接到外径为0.25毫米的针头上。使用此装置将其插入壶瓯周围。瞄准十二指肠的头并将管子插入其中。将导管插入胆管一半并停止插入。
3. 启动输液泵，以50μL/10g的剂量微泵0.2%亚甲蓝溶液（在0.9%盐水中稀释）2分钟，速率为50μL/min。胰管会逐渐变成蓝色。
4. 在疗程结束时，拉出聚乙烯管并取下微血管夹。

4. 电凝程序的诱导

1. 在无菌棉签的帮助下，固定胰腺，将电凝刀对准蓝色部分进行电凝。电凝部位在胆总管与胰十二指肠上动脉之间的中下2/3处。
   1. 要进行这项研究，请使用以下电凝作参数：电压：220 V;电极材料：纯铜;治疗时间：在胰腺避开血管的位置治疗2-3秒，直至电凝后亚甲蓝标记位置的蓝色被黄色或棕色取代;手术区域大小：根据小鼠的不同，电凝区域位于胰腺后部。选择胆总管和胰十二指肠前上动脉之间的位置;温度：300°C。
2. 当看不到蓝色染色液时终止电凝。
3. 用 4-0 条可吸收缝合线封闭腹部，用 4-0 条非吸收性单丝聚丙烯缝合线封闭皮肤。剖腹手术和缝合之间的时间不要超过 20 分钟。
4. 以与实验小鼠相同的方式处理对照组，但确保输液成分仅由亚甲蓝组成。在对照组（假）中，给予亚甲蓝注射液，但不进行电凝手术。

5. 让动物活着

1. 腹部手术后小鼠的术后伤口护理，每天检查切口是否有出血或发红：如果出现出血，用无菌纱布轻轻按压止血后更换敷料，如果出现发红，每天涂抹一次红霉素软膏，同时也要采取措施防止小鼠啃咬伤口。关于镇痛，手术后立即通过腹腔注射给予卡洛芬（5mg / kg），然后每24小时一次，连续3天。

6. 分析方法

1. 在电凝第7、14、21、28天测量血清生化指标，观察胰腺组织的病理变化。
2. 通过腹腔注射用氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物麻醉动物，并通过眼眶丛收集约500μL血液。
3. 轻轻握住背部皮肤，以促进眼球轻微突出。
4. 将毛细血管末端放在眼角，以大约 30°-45° 的角度轻轻插入眼球下方。旋转毛细血管，直到血液开始流动。
5. 在收集结束时，用纱布轻轻按压，保持眼睑闭合。
6. 离心血清（1,200 × g，15 分钟）并除去上清液以测定淀粉酶、胆红素和透明质酸（步骤 6.10）。
7. 用氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉小鼠，确认它们处于深度麻醉状态（无脚部反射或角膜反射），然后进行宫颈脱位安乐死。
8. 将安乐死的小鼠置于4°C的手术台上，用剪刀和镊子在腹壁上做一个“V”形切口，露出腹腔。取出小鼠的胰腺，将器官分成三部分进行染色。
9. 通过将胰腺固定在 4% 的聚甲醛溶液中并将其包埋到石蜡中来处理胰腺。将胰腺的石蜡块切成0.5毫米厚的切片，并用苏木精和伊红（HE）以及马森染色剂进行染色，以便在光学显微镜下进行可视化。使用石蜡包埋的胰腺组织进行免疫组织化学分析。
10. 根据制造商的建议，使用市售试剂盒测量淀粉酶 （U/dL）、胆红素 （mmol/L） 和透明质酸 （μg/L）。

结果

将动物分为对照组（仅注射亚甲蓝电凝）和电凝组，每组共20只小鼠。对照组死亡率为0%，电凝组死亡率为15%;构建模型的成功率（活体模型小鼠数量）为71%。每组选择十几只动物进行病理评估。每组随机抽取3只小鼠于第7、14、21、28天进行HE、Masson和免疫组化染色。建模过程如图 1 所示。用亚甲蓝示踪后，电凝小鼠胰腺胆总管与胰十二指肠前上动脉之间的位置。如果电凝面积选择在体位中下部，面积小于三分之一，效果很可能达不到预期。然而，如果超过2/3，小鼠很可能在电凝后72小时内死亡，这很可能是由于胰管完全阻塞后发生的严重急性胰腺炎所致。

由此，我们得出结论，在电凝后第14天，可以在小鼠的胰腺中观察到慢性胰腺炎的组织学图像（如 图1所示），该图像不是完全阻塞，而是在胰管部分阻塞后形成的。第7天组织有轻微组织水肿，组织无慢性胰腺炎证据。第14天，胰腺组织HE染色显示胰腺腺泡细胞散在。第21天，胰腺组织腺泡细胞炎症程度逐渐恢复。第28天组织病理变化出现逆转的迹象 （图2）。这可能是由于电凝过程中胰管电凝不足，以及部分胰管梗阻后剩余胰管的代偿作用。

马森染色显示，手术组纤维化程度明显高于假手术组。col-1和（α-平滑肌肌动蛋白）SMA染色的免疫组织化学评分较高（图3）。第14天病理分析观察胰腺组织中是否存在慢性胰腺炎，此后仅在病理分析中通过HE染色比较前后变化。通过对血清生化指标的分析，发现电凝组的血清淀粉酶、胆红素和透明质酸浓度高于对照组，表明慢性胰腺炎的开始（图4）。

图1：通过小鼠电凝诱导的阻塞性慢性胰腺炎的示意图。 请点击此处查看此图的大图。

图2：随时间推移胰腺组织的苏木精-伊红染色。 请点击此处查看此图的大图。

图3：苏木精-伊红和马森染色以及胰腺的免疫组织化学。 缩写：Col-1 = α-1 1 型胶原蛋白;SMA = α-平滑肌肌动蛋白。 请点击此处查看此图的大图。

图4：不同时期小鼠血清生化指标的代表性结果。（A） 血清透明质酸浓度（μg/L）。（B）血清胆红素浓度（mmol/L）。（C）血清淀粉酶浓度（U/dL）。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

胰腺炎的风险和严重程度由遗传和环境因素决定⁶。彻底治愈临床胰腺炎是胃肠病学的一个目标，创建动物模型是第一步。存在多种方法来建立这些模型，每种方法都有其优点和缺点 7,8,9,10,11。

外科医生使用高频电凝在主胰管中进行腔内热消融（ETHA），以减少胰腺外分泌分泌，从而降低胰十二指肠切除术（PD）后术后胰瘘（POPF）的发生率¹²。这表明热消融引起胰腺萎缩的方法已经在临床实践中得到实施。我们通过使用亚甲蓝可视化胰管并精确电凝它，开发了一种新的阻塞性胰腺炎模型。

选择C57BL/6 8周龄雄性小鼠进行本实验。雌性小鼠有一个生殖周期，体内激素水平可能会对实验数据产生影响。8周龄时，小鼠处于壮年，身体器官成熟，生命健康指数良好，同龄雄性小鼠体型更强壮。术后1个月观察，于7、14、21、28天取样小鼠胰腺;14天获得的结果最符合胰腺炎的病理特征。

这种方法有几个注意事项。首先，胆总管应尽可能靠近肝门夹紧，以利于将染料注入胰管。其次，应注意亚甲蓝染料注射到胰管中的速度和时间。染料溶液太少看不到胰管，染料溶液过多会阻碍手术区域主胰管位置的识别。第三，当看不到蓝色染色液时终止电凝。在这些实验中，手术是在亚甲蓝染色所指示的区域进行的，因为小鼠胰腺电凝的区域会有所不同，这就是为什么使用亚甲蓝染色来跟踪胰管的原因。第四，手术过程中胰腺的任何出血都应立即停止。同时，应使用电凝刀切割胰腺。如果电凝刀因任何原因粘在胰腺上，应延长电凝时间。这是预防胰腺渗漏引起的严重术后并发症发生的最常见方法。

然而，这种方法也有缺点。作者的熟练程度直接影响实验结果，不同小鼠手术的一致性影响模型的成功率。该模型模拟胆结石或胰管阻塞的影响，导致急性胰腺炎反复发作，最终导致慢性胰腺炎。这可以解释胆红素水平升高的原因。因此，该模型也可以根据电凝程度开发为急性胰腺炎模型。电凝后3 d小鼠胰腺的早期实验显示出急性胰腺炎的特征，但术后并发症降低了模型对急性胰腺炎的成功率。但不能排除电灼在电凝过程中产生的热量可能已经扩散到主胆管。如何通过电凝稳定诱发急性胰腺炎的问题值得探讨。

与传统的天青素注射方法相比，需要在数周内重复注射，电凝方法节省时间且更方便。虽然天蓝素注射表现出优异的稳定性和易于作，但电凝需要~20分钟，并节省了后续的实验时间。

新模型的开发旨在研究疾病的自然史并开发靶向疗法。我们的新动物模型有助于模拟小鼠胰管阻塞引起的慢性胰腺炎，包括内窥镜逆行胰胆管造影后胰腺炎（ERCP）¹³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16毫米微血管夹	强者，中国宁波
可吸收缝线	扬州金环医疗器械厂	4-0	-
卡普罗芬	上海麦克林生化有限公司	C830557-5克	-
毛细管	美国泰贡	AAQ（AAD）04091	0.25 x 0.3毫米
电凝刀	顺业医疗设备有限公司，中国宁波	顺叶 BDD-YE-DF-1
眼剪刀
氯胺酮注射（Ketaset CIII）	Zoetis公司	S5564	-
亚甲蓝染色溶液	索拉比奥，上海，中国	G1303
非吸水性4-0单丝聚丙烯缝线	中国上海金环市
作显微镜	穆尔齐德，中国广东	MSD203
眼用镊子
圆头拭子	奥尔加·谢勒，华西医学，中国
注射器针头	中国浙江省米南克		0.25毫米
组织钳
组织剪刀	上海普信仪器科技公司
盐酸木醛注射	拜耳动物健康	XYL-50-20	-