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方法文章

用于生成iPSC来源的三维人肝类器官的整合性实验方案

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DOI：

10.3791/67070

⸱

2024年12月6日

 ,  ,  , 
1Section of Adult and Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Chicago

本文内容

摘要

由人诱导多能干细胞衍生的三维肝类器官是研究甲状腺激素对肝脏发育作用的潜在工具。

摘要

在体外培养中获得稳定的肝细胞对肝脏研究构成了重大挑战。鉴于此，本文介绍了一种优化的方法，利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成人肝类器官（HHOs）的三维培养体系。HHOs的应用为理解肝脏发育过程、揭示肝脏疾病机制、开展药物开发的高通量研究以及探索肝脏移植潜力提供了重要途径。在前期研究中，通过免疫荧光和定量RT-PCR技术对分化过程进行监测，识别出多种细胞群体的存在，包括肝母细胞以及由肝母细胞衍生的两种细胞类型：胆管样细胞和肝细胞样细胞，覆盖了不同发育阶段。本报告介绍了一种从hiPSC出发获得HHOs的简便三维培养方案，该方案模拟了人类胚胎发育的各个阶段。整个流程历时46至50天，包含多个步骤：（i）精细管理hiPSC培养以生成HHOs；（ii）在二维条件下启动细胞分化，随后 переход至三维培养；（iii）采用优化的解离策略将HHOs分解为单细胞，用于单细胞RNA测序。作为该方法广泛应用的一个示例，本方案此前已被用于揭示甲状腺激素信号在发育中肝细胞中的作用。

引言

肝脏执行多种代谢功能，例如调节葡萄糖和酮体等可直接利用的能量底物的可用性，以及对外源性化合物进行解毒。近年来，肝脏疾病的发病率显著上升，主要原因是非酒精性脂肪性肝炎（NASH），若不及时治疗，可能进展为肝硬化或肝癌1。因此，深入了解肝脏的代谢功能及其相关疾病，对于推动有效治疗方法的开发至关重要2,3。

三维（3D）培养技术的发展催生了类器官模型，这一突破性且创新的方法为研究器官发育的功能性和复杂性提供了全新途径4。类器官被定义为能够模拟相应器官功能和细胞结构的三维自组织分化细胞聚集体5。

在过去几十年中，多种人类肝类器官（HHO）培养方案引起了广泛关注，这些方案包括利用不同来源的人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞6，或仅使用类似肝细胞的细胞7，以及在单层7或三维8条件下引入多种复杂的生长因子、抑制剂微环境及分化中的前体细胞。这些方法适用于多种潜在研究目标，从高通量药物筛选9到深入探究肝脏疾病的发生机制10。

此处基于上述化学信号，提供HHO分化的逐步操作方案11 进行时采用经过方法学调整的变异方案。本方案从人诱导性多能干细胞（hiPSC）的适当操作与培养开始，详细描述了细胞外基质凝胶处理、细胞传代以及向HHO分化的方法。该过程首先诱导hiPSC向定型内胚层（DE）分化12 并随后模拟 体内 FGF和BMP促进后前肠（PFG）单层细胞发育的作用13第10天形成三维结构，此时PFG细胞分化为未成熟肝细胞阶段，即肝母细胞，后者为胆管细胞和肝细胞的胎儿前体细胞2最后，将3D结构解离为单细胞，用于RNA测序研究。作为该方案适用性的示例，本研究展示了该HHO模型如何适用于研究甲状腺激素作用及其2型脱碘酶（D2）在肝细胞和胆管细胞发育过程中的功能。14.

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方案

1. hiPSC 的培养管理

注意：hiPSCs（CS03iCTR-n3 细胞系）为商业购买。外基质凝胶包被和 hiPSC 培养基的适当处理对于 hiPSCs 在培养板上的贴附和培养至关重要。此处描述的是一个 6 孔板所需的体积。6 孔板中未分化为类器官的剩余 hiPSCs 可储存于液氮中以进行长期保存。

  1. 分配细胞外基质凝胶和 hiPSC 培养基
    1. 将细胞外基质凝胶的瓶子置于装有冰块的容器中，进行适当的解冻 ˚C 过夜。 
      注意：分装前，请查阅分析证书以确认稀释因子对应的体积。此数值代表细胞外基质凝胶的蛋白浓度，因此不同批次之间可能存在差异。
    2. 根据稀释倍数（4x、2x 和 1x），使用预冷并标记的离心管将细胞外基质凝胶分装至合适的等分试样中。 加入4倍稀释因子 细胞外基质凝胶加入至25 mL冷 用DMEM/F12包被四块6孔板。立即用实验室封口膜密封盖子，并于-80℃冻存 ˚C. 避免将分装样品长时间暴露于空气中，并防止产生气泡。
    3. 在 4 ℃ 下解冻 100 mL hiPSC 补充培养基 ˚C下过夜。将其加入400 mL hiPSC基础培养基中。使用50 mL血清移液管混匀后，分装hiPSC培养基至每管40 mL，于-20℃冷冻保存 ˚C，直至使用。
  2. hiPSC 培养的包被培养板
    1. 对6孔板进行编号并标记。将一份细胞外基质凝胶置于干冰中，就近保存。
    2. 为包被一个6孔板，将一份细胞外基质凝胶（1x）加入6.25 mL冷的DMEM/F12中稀释（2x时加入12.5 mL，4x时加入25 mL DMEM/F12）。
    3. 移液少量 DMEM/F12（约 500 µ将L）加入细胞外基质凝胶管中。上下轻轻混匀，用冷DMEM/F12解冻并均质化细胞外基质凝胶，避免产生气泡，然后使用移液管将其转移回含有其余冷DMEM/F12的管中，充分混匀。
    4. 将1 mL细胞外基质凝胶加入DMEM/F12中，铺于6孔板的一个孔内（整块板共需6 mL）以包被培养板。通过轻轻移动培养板使1 mL溶液均匀覆盖孔底表面，切勿振荡，直至表面完全覆盖。
    5. 室温（RT）静置1小时后使用。若未使用完整的6孔板，应用实验室封口膜密封后于4 ℃冰箱中保存。 ˚C.
      注意：包被好的培养板可在 4 ℃ 冰箱中保存 1 周。 ˚C.
  3. hiPSC的解冻与培养
    1. 提前计算所需 hiPSC 培养基的体积，并与6孔包被板一同在室温下预温1小时（每孔2 mL）。
      注意：若为冷藏或冷冻的分装样品，需将其浸入37 ˚使用前于CO₂培养箱或水浴中孵育15分钟。
    2. 将1 mL hiPSCs分装至液氮中2 从一个冻存管解冻后接种至6孔板中的3个孔（1:3比例）。若需接种整块6孔板，则使用2个冻存管。本方案描述的是从一个冻存管中复苏和培养hiPSCs的操作步骤。若使用2个冻存管，需重复此过程。
    3. 用一只手握住冻存管的管帽部分，将装有约1 mL冻存人诱导多能干细胞（hiPSCs）的冻存管缓缓插入37℃水浴中，使管底浸入水面以下，避免管口接触水面 ˚C直至解冻。
    4. 解冻后，用乙醇喷洒冻存管，用移液器吸取1 mL hiPSC悬液，缓慢加入一个空的15 mL锥形离心管中。边轻轻振荡试管，边逐滴加入5 mL预热的hiPSC培养基。
    5. 将试管在300 x g 室温下离心5分钟。用连接真空泵的玻璃移液管小心吸除上清液，避免扰动沉淀，保留少量残留培养基。将沉淀轻轻重悬于6 mL培养基中，然后每孔加入2 mL，分装至6孔板的3个孔中。
      注意：保留小的 hiPSC 聚集体以确保正常生长。
    6. 将6孔板翻转，吸取先前包被的孔板中的细胞外基质凝胶，注意吸头不要接触孔底。
    7. 每孔加入含hiPSCs的培养基2 mL。轻轻前后左右摇动培养板，使hiPSC细胞团在板内均匀分布。
    8. 将6孔板放入37℃培养箱中 ˚C，5% CO2，以及95%湿度。每天更换培养基（每孔2 mL），并观察其逐步生长情况。
    9. 当 hiPSCs 生长汇合度达到 80% 时进行传代（培养 4-5 天后；参见 图1A健康的和具有增殖能力的hiPSCs的特征包括细胞集落边缘清晰，中心区域细胞核大且排列紧密。
  4. hiPSC的传代
    1. 当 hiPSCs 达到 80% 汇合度时，表明其数量约为 1.2 x 106 每孔细胞数，传代至新的6孔板。按1:3的比例（从1孔传至3孔）进行传代，或根据需要调整比例（1:4； 1:6）根据需求的 实验
    2. 传代前，按照步骤1.2所述，为相应数量的6孔板准备好所需的细胞外基质凝胶包埋液。
    3. 吸弃每孔中的上清液，每孔加入 2 mL PBS。吸去 PBS，随后每孔加入 1 mL hiPSC 解离液，作用 1 分钟。然后移除 1 mL hiPSC 解离液。
    4. 将6孔板放入37 ℃培养箱中 ˚C 离心 7 分钟。每孔加入 1 mL hiPSC 培养基。用移液器将含细胞的 1 mL hiPSC 培养基吹打下来，并收集至 15 mL 离心管中。
    5. 将试管在300 x g 在室温下孵育5分钟。将细胞接种至6孔板时，重复步骤1.3.5–1.3.7。将6孔板置于37℃培养箱中 ˚C，5% CO2, 以及95%湿度。如需冷冻hiPSC，请进入步骤1.5。
  5. 冻存 hiPSC（可选）
    注意：用于诱导生成肝类器官的hiPSCs数量可能导致剩余孔板，可进行长期保存。若需扩大传代以用于冻存管储存，hiPSCs可维持较长时间培养。
    1. 将所需体积的冻存培养基（每孔细胞1 mL）在4℃冰上解冻 ˚C. 用传代次数、日期和细胞系标记冻存管。使用hiPSC解离试剂按照步骤1.4的方法在15 mL锥形管中解离细胞。
    2. 300 x g 离心 g 室温下静置5分钟。彻底吸除上清液，小心保留细胞沉淀不受扰动。将沉淀物谨慎地重悬于1 mL冷的冻存培养基中（每孔），保留hiPSC聚集体。
      注意：如果孔内细胞密度较低，即融合度低于50%，每2个孔可使用1 mL冻存液。
    3. 将含有hiPSCs的1 mL冻存液转移至冻存管中。轻轻振荡冻存管，使细胞悬液均匀混合。
      注意：如果准备更多用于冷冻保存的试管，请将已制备好的试管置于冰上。
    4. 将试管放入-80℃的程序降温冻存盒中 ˚C过夜。24小时后将试管转移至液氮罐中。

2. 从hiPSC逐步分化为肝类器官

注意：试剂的重悬操作均按照生产商提供的说明书进行。

  1. 从hiPSC向定型内胚层进行2D分化（第0天至第4天（D-0至D-4））； 图1B)
    1. 经过3次传代后，若细胞状态健康且生长良好、增殖迅速，即可进行hiPSC的分化。按照步骤1.2所述方法包被6孔板。为将hiPSC分化为定型内胚层（DE），使用DE试剂盒并遵循生产商提供的说明书操作。
    2. 在开始分化前，将hiPSCs以2:1的传代比例（从6个孔中获得3个孔用于启动分化）培养24小时，以达到内胚层诱导（DE）说明书所要求的每孔细胞浓度。
    3. 按照制造商提供的方案进行分化，并作如下修改。
      1. 将添加至hiPSC的Y-27632浓度从10提高 µM 至 50 µM（开始分化前一天） 
      2. 每增加1.5 mL 解离试剂孔以及 DMEM/F12 的体积保持相同量 以及解离试剂。 将1 mL DMEM/F12（共1.5 mL）加入每个孔中，并将额外的0.5 mL收集至15 mL或50 mL离心管中。
  2. DE细胞向PFG细胞的分化（D-4至D-10； 图1C)
    1. 准备PFG培养基（以Advanced DMEM/F12为基础培养基，添加1× Glutamax补充剂、1× B27补充剂、20 ng/mL BMP4、10 ng/mL FGF2），用于 definitive endoderm（DE）细胞向PFG分化前数天的培养，并将配制好的培养基于4℃保存 ˚C.
      注意：B27 的成分中包含 T3。在甲状腺激素（TH）研究中，此后应将 B27 替换为自制的 B2615 不含 TH
    2. 将 PFG 培养基（每孔 2 mL）和高级 DMEM/F12 预热至 37 ˚C孵育15分钟或室温孵育1小时。将培养板倾斜，使用连接真空泵的玻璃移液管（或P1000移液器手动）从孔中吸除DE培养基，注意勿刮伤细胞。
    3. 每孔加入 2 mL 预热的高级 DMEM/F12 培养基，随后吸除。在 6 孔板中每孔加入 2 mL 预热的 PFG 培养基。此后连续 6 天每天更换培养基。
  3. 从二维前肠前体细胞诱导至三维未成熟肝类器官（IHOs；第-10至第18天）
    注意：30 µ将L加入96孔超低吸附（ULA）板的每孔中。传代比例为2:1，即来自2个铺有分化后PFG细胞单层的6孔板孔；可铺满一整块96孔超低吸附（ULA）板。图1D).
    1. 在启动三维类器官培养或早期阶段之前，预先配制IHO培养基（以Advanced DMEM/F12为基础培养基，添加1x N2补充剂、1x B27、50 nM A83-01、30 µM 地塞米松，5 µM CHIR99021，500 nM 丙戊酸，50 ng/mL 人表皮生长因子（EGF），20 ng/mL 人肝细胞生长因子（HGF），40 ng/mL Jagged-1，300 ng/mL N-6,20-O-二丁酰腺苷-3',5'-单磷酸钠盐（dbCAMP），10 µM 烟酰胺）并在 4 ℃ 下保存 ˚C.
    2. 标记一个96孔超低吸附（ULA）培养板。按照制造商说明书，使用细胞解离酶来解离PFG细胞。
    3. 将消化酶、高级DMEM/F12培养基和PBS预热至37℃ ˚使用前将 PBS 置于 4 °C 预冷。吸出并弃去孔中的 PFG 培养基。每孔加入 2 mL PBS，随后吸出。
    4. 每孔加入 1.5 mL 细胞解离酶，置于 37 ˚C 下孵育 7 分钟以使细胞从孔中脱离。无需去除细胞解离酶，直接加入 1 mL 高级 DMEM。收集全部细胞并转移至 50 mL 离心管中。
    5. 使用细胞计数器或血细胞计数板对每毫升细胞数量进行计数。在150 x g条件下离心 g 8 分钟
    6. 向沉淀中加入适量体积的IHO培养基（96孔ULA板全板加3 mL）和1×细胞外基质凝胶，调整至所需最终细胞数量（30,000–35,000个细胞）。
    7. 将96孔板放入设置为37℃的培养箱中 ˚C，5% CO2, 和 95% 湿度。24 小时后（D-11），细胞将重新聚集成圆形；加入 50 µ每孔加入 L 的 IHO 培养基。
    8. 第二天（D-12），增加至100 µ每孔加入 L 的 IHO 培养基。在第14天，移除约100–120 µ从每个孔中用连接真空泵的玻璃移液管或普通移液管逐孔吸出液体，注意避免吸走类器官。加入100 μL µL of IHO 培养基于第14天和第16天。
      注意：在第16天后，由于未进行振荡培养，会出现过度生长现象，该现象在第18天后消失。
  4. 肝母细胞类器官（HBOs，第18天至第26天）
    注意：在此步骤中，将把来自96孔U型底超低吸附（ULA）培养板的IHOs转移至6孔U型底超低吸附（ULA）培养板中。对于前一阶段获得的96个IHOs，每孔放置10个类器官，共计 1 和 ½ 6孔超低吸附板以进行成熟阶段（图1E).
    1. 与之前的分化步骤相同，在前几日准备HBOs分化培养基。
      1. 用于诱导生成HBOs的试剂混合物在步骤2.3中描述。去除丙戊酸，并将以下生化物质加入该混合物中：BMP7、BMP4和FGF7。最终成分为以Advanced DMEM/F12作为基础培养基，1x N2补充剂，1x B27，50 nM A83-01，30 µM 地塞米松，5 µM CHIR99021，500 nM 丙戊酸，50 ng/mL 人表皮生长因子（EGF），20 ng/mL 人肝细胞生长因子（HGF），40 ng/mL Jagged-1，300 ng/mL N-6,20-O-二丁酰腺苷-3',5'-环磷酸钠盐（dbCAMP），10 µM 尼克酰胺, 25 ng/mL FGF7, 50 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7
    2. 将先前的 HBO 培养基（每孔 3 mL）和 Advanced DMEM/F12（每孔 3 mL）在 37 ℃ 预热 ˚C. 每孔加入3 mL温热的Advanced DMEM/F12培养基。
    3. 使用200 μL宽口吸头，将96孔板中的10个IHO类器官分配至每孔。通过倾斜培养板，并用连接真空泵的玻璃移液管（或使用P1000手动）吸除高级DMEM/F12培养基。
    4. 每孔加入 3 mL 温热的 HBO 培养基。开启并将在 37 ℃ 培养箱内以 65 rpm 转速运行的多平台摇床，放置 6 孔超低吸附板 ˚C，5% CO2, 以及95%湿度。在第-22天（4天后）和第-24天（6天后），更换HBO培养基（每孔3 mL）。
  5. 通过两个不同阶段（D-26至D-46）向肝类器官（HO）的成熟分化
    注意：这是由于培养基中成分和试剂类型的不同，分化过程分为两个阶段，此为最后的成熟步骤。
    1. 提前配制HO（HO1）培养基的第一部分，并于4℃保存 ˚C. 去除Jagged1，并降低CHIR99021的浓度（相较于HBO培养基）。最终成分为：以Advanced DMEM/F12为基本培养基，1x N2补充剂，1x B27，500 nM A83-01，30 µM 地塞米松，2 µM CHIR99021，50 ng/mL 人表皮生长因子（EGF），20 ng/mL 人肝细胞生长因子（HGF），300 ng/mL N-6,20-O-二丁酰腺苷-30,50-环磷酸钠盐（dbCAMP），10 µM 尼克酰胺, 25 ng/mL FGF7, 20 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7
    2. 将 Advanced DMEM/F12 和 HO1 培养基预热至 37 ˚使用前将培养基预冷至4°C。在同一块6孔超低吸附（ULA）培养板中，小心地将培养板倾斜，将连接真空泵的玻璃移液管尖端紧贴孔壁，吸除之前的HBO培养基（或使用P1000移液器手动吸取）。
    3. 每孔加入3 mL预热的Advanced DMEM/F12培养基，随后吸除。每孔加入3 mL预热的HO1培养基。每3天更换一次HO1培养基（第-29、-32、-35、-38天），并同时进行样品采集。
    4. 在第38天，通过去除CHIR99021、BMP4、dbcAMP和FGF7，并替换为FGF19和DAPT，调整肝类器官第二阶段（HO2）的试剂 cocktail。最终培养基组成为：以Advanced DMEM/F12为基本培养基，添加1x N2补充剂、1x B27、500 nM A83-01、30 µM 二甲双胍，50 ng/mL 人表皮生长因子（EGF），20 ng/mL 人肝细胞生长因子（HGF），10 µM 尼克酰胺, 20 ng/mL BMP7, 25 ng/mL FGF19, 5 µM DAPT
    5. 将 Advanced DMEM/F12 和 HO2 培养基预热至 37 ˚使用前将溶液置于冰上。继续使用同一块6孔超低吸附（ULA）板，小心吸除之前的HO1培养基。每孔加入3 mL Advanced DMEM/F12培养基，随后移除。
    6. 每孔加入 3 mL 温热的 HO2 培养基。每 4 天更换一次 HO2 培养基（D-42、D-46、D-50） …）并在换液的同一天取样。

3. 单细胞解离

注意：此步骤对于单细胞RNA测序技术至关重要。类器官的数量可能因大小而异，且解离时间越晚，类器官中的细胞数量越多。在早期阶段，解离的类器官数量增加，相同数量下的解离时间缩短。在第14天和第17天使用10个类器官进行解离，在第23天和第26天使用8个类器官，在第30天和第45天使用6个类器官。以下详细描述了一个类器官簇的操作流程（图1F）。

  1. 试剂的准备
    1. 将牛血清白蛋白第五组分（BSA）加入Advanced-DMEM中，使其终浓度为7.5%，混匀后过滤。
    2. 使用1 mL 0.5%胰蛋白酶-EDTA（10倍浓度）作为基础培养基，配制1 mL消化酶培养液，并加入50 µM Y-27632，40 U/µL RNase抑制剂，和1 U/µL DNase I
    3. 用 2 mL Advanced DMEM/F12 加 7.5% BSA 作为基础培养基配制胰蛋白酶失活液，50 µM Y-27632，40 U/µL RNase抑制剂，和1 U/µL DNase I
    4. 将培养基和 PBS 在 37 °C 预热 ˚开始前请冷却。
  2. HHO的解离
    1. 用RNase清除剂清洁工作场所和工具。根据分化天数，用宽口尖头的15 mL聚丙烯管收集相应数量的类器官。
    2. 用 PBS 洗涤 2 至 3 次。向含有收集的类器官的 15 mL 管中加入 1 mL 解离酶培养基，并置于 37 ˚在摇床中以 30 rpm 振荡 5 分钟。
      ​注意：请小心不要将试管从摇床中掉落。
    3. 5 分钟后，首先检查管盖上是否残留类器官，然后使用 P1000 移液器通过上下吹打对每个类器官进行机械性破碎，每个类器官吹打 10 次（共 60 次）。再使用 P200 移液器重复相同的破碎操作。检查管盖，防止类器官粘附在管盖上。
    4. 将15 mL离心管再次置于摇床上，放入培养箱中孵育5分钟。重复步骤4的操作，先用P200移液器上下吹打混匀，再使用连接P10吸头的1 mL血清移液器继续操作。
    5. 将15 mL离心管再次置于摇床上，放入培养箱中孵育最后5分钟。若未发生解离， 再静置5分钟，然后重复 手动破碎
    6. 加入1 mL胰蛋白酶抑制培养基并混匀。将新的15 mL聚丙烯管置于40 µm 细胞筛网上方。将 2 mL（含解离酶培养基和胰蛋白酶抑制剂培养基的细胞悬液）通过 40 µm 细胞滤网放入 15 mL 离心管中。
    7. 加入另1 mL胰蛋白酶抑制培养基，以回收40 μm滤膜上残留的细胞 µm细胞滤筛
    8. 取5 µ单细胞培养基混合5 L µL 染料溶液以计数解离后的细胞数量，并进行固定。离心后用固定试剂盒的第一种试剂重悬细胞，计数细胞，并使用 40 µm细胞滤筛

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结果

该hiPSC逐步分化为HHO的每个阶段均通过文献中已知的阶段特异性标志物的qPCR和免疫荧光定量测量加以界定（图2）。两种技术的逐步操作过程以及在正确分化为HOs方面所取得的结果如图所示。14在先前的研究中，hiPSCs 是通过 mRNA 水平来定义的 POU5F1 （也称为 OCT4）和 SOX2，两种著名的山中因子16，随着时间的推移而减少（图2A）。随后，检测DE的mRNA水平11 标记物的测量包括 OTX2, CER1，和 FOXA2，以及PFG11 标记物 HNF4A, CDX2，以及 TBX3，以及通过免疫荧光检测 OTX2、HNF4A 和 TBX3 的局灶性...

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讨论

本方案详细介绍了如何处理hiPSCs以及后续的3D类器官培养的各种方法学细节。其中包括两个关键步骤：（i）将2D培养物解离后，使其在10天内发育为3D肝类器官；（ii）将3D结构精细地解离为单个细胞。根据现有信息，这是首次报道利用3D HHO模型研究甲状腺激素作用，结果显示肝样细胞中DIO2的表达达到峰值14，该现象最初在P1期小鼠肝脏中被发现20。

与许多其他利用支架作用于细胞的技术类似，本实验使用细胞外基质凝胶来模拟细胞外基质21，从而促进类器官形成其特征性的三维结构。该试剂具有热敏感性，因此在操作过程中必须始终保持其冷冻状态，并在使用时置于冰上。因此，也可使用其他类型的细胞外基质凝胶22，但在本实验方案中，人诱导多能干细胞（hiPSCs）无法在无支架的培养板上贴壁和增殖，因此在实验初期对细胞外基质凝胶的正确处理与三维类器官的生成同样至关重要。

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披露

Antonio C. Bianco 是 Abbvie、Acella、Aligos、Synthonics 的顾问。其他作者无相关披露信息。

致谢

本工作由美国糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148；ACB）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 µL 通用带滤芯移液器吸头，低吸附，预灭菌VWR613-6462所有操作步骤
1000 µL 通用带滤芯移液器吸头，低吸附，预灭菌VWR613-6470所有操作步骤
15 mL 聚丙烯锥形管Falcon (Corning)352097肝类器官解离
200 µL 通用带滤芯移液器吸头，低吸附，预灭菌VWR613-6465所有操作步骤
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸SigmaT2877-100肝类器官分化
40 μm 细胞筛网 Corning431750肝类器官解离
50 mL 管 Falcon (Corning)352070所有操作步骤
6 孔 Nunc 细胞培养处理多孔板Thermo Fisher Scientific140675人诱导多能干细胞（hiPSC）维持
A83-01 R&D Systems2939/10肝类器官分化
高级 DMEM/F12 培养基Gibco12634010肝类器官分化
ART 宽口带滤芯移液器吸头ART2069GPK所有操作步骤
B27 添加剂 Gibco17504044肝类器官分化
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CF肝类器官分化
牛血清白蛋白 V 组分（7.5% 溶液） Gibco15260037肝类器官解离
BSA，V 组分，无脂肪酸组织培养级GoldBioA-421-100肝类器官解离
CHIR99021R&D Systems4423/10肝类器官分化
Corning 96 孔透明平底超低吸附培养板Corning3474肝类器官分化
Costar 6 孔透明平底超低吸附培养板 Corning3471肝类器官分化
CS03iCTR-n3 人诱导多能干细胞系Cedar-Sinai人诱导多能干细胞（hiPSC）维持
DAPTR&D Systems2634/10肝类器官分化
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MG肝类器官分化
地塞米松R&D Systems1126/100肝类器官分化
DMEM/F12 培养基Gibco11320033人诱导多能干细胞（hiPSC）维持
脱氧核糖核酸酶 I，无 RNase，高浓度Thermo Fisher ScientificEN0523肝类器官解离
Falcon 10 mL 血清移液管，聚苯乙烯材质，0.1 mL 刻度，独立包装，无菌Corning357551所有操作步骤
Falcon 5 mL 血清移液管，聚苯乙烯材质，0.1 mL 刻度，独立包装，无菌Corning357543所有操作步骤
Falcon 50 mL 血清移液管，聚苯乙烯材质，1.0 mL 刻度，独立包装，无菌Corning357550所有操作步骤
温和细胞解离试剂（GCDR）Stemcell Technologies100-0485肝类器官分化
GlutaMAX 添加剂Gibco35050061肝类器官分化
L-甲状腺素SigmaT1775-1G肝类器官分化
Matrigel hESC 认证基质，无 LDEV，5 mLCorning354277细胞外基质凝胶
mFreSRStemcell Technologies5855人诱导多能干细胞（hiPSC）冻存培养基
mTeSR 5x 添加剂 Stemcell Technologies100-0276人诱导多能干细胞（hiPSC）培养基
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276人诱导多能干细胞（hiPSC）培养基
多功能摇床 Fisherbrand (Thermo Fisher Technologies)88861021肝类器官分化
N2 添加剂 Gibco17502048肝类器官分化
烟酰胺 R&D Systems4106/50肝类器官分化
PBS，pH 7.4Gibco10010023人诱导多能干细胞（hiPSC）维持
重组人 BMP4  R&D Systems314-BP-010/CF肝类器官分化
重组人 EGFR&D Systems236-EG-200肝类器官分化
重组人碱性成纤维细胞生长因子/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CF肝类器官分化
重组人 FGF19R&D Systems959-FG-025/CF肝类器官分化
重组人 HGFR&D Systems294-HG-005/CF肝类器官分化
重组人 Jagged-1 Fc 融合蛋白 R&D Systems1277-JG-050肝类器官分化
重组人 KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CF肝类器官分化
ReLeSRStemcell Technologies100-0483人诱导多能干细胞（hiPSC）解离培养基
RNA酶抑制剂 Ambion，克隆型，40 U/μLInvitrogenAM2682肝类器官解离
RNase ZapInvitrogenAM9780肝类器官解离
Sorvall  Legend XT/XF 离心机系列Thermo Fisher Scientific75004539所有操作步骤
STEMdiff 定向内胚层试剂盒Stemcell Technologies5110肝类器官分化
台盼蓝溶液（0.4%） Gibco15250061染色溶液
TrypLE Express 酶Gibco12604013细胞解离酶
胰蛋白酶 0.5% - EDTA（10 倍浓缩液） Gibco15400054肝类器官解离
丙戊酸钠盐R&D Systems2815/100肝类器官分化
Vari-Mix 平台摇床 Thermo Fisher ScientificM79735Q肝类器官解离
Y-27632 二盐酸盐R&D Systems1254肝类器官分化

参考文献

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780(2023).
  15. B27 Supplement. , Hanna Lab Protocol – Weizmann Institute of Science. https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644(2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387(2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242(2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208(2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131(2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244(2022).

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