我们开发了一种简化且经济高效的电极制备方法，并在自由活动的小鼠中实现了多个脑区信号的记录。结合光遗传学、多脑区电生理记录和钙信号记录，揭示了癫痫点燃模型中跨脑区的神经元活动特征。
本文内容
摘要
摘要
癫痫是一种神经系统疾病，其特征是多个脑区参与的同步异常放电。局灶性病灶可通过相关神经环路促进癫痫信号的传播。因此，对关键脑区进行局部场电位（LFP）的在体记录对于解析癫痫发作传播所涉及的神经环路至关重要。然而，目前的电极制备与植入方法缺乏灵活性。本文介绍了一种适用于多个脑区电生理记录（LFP和脑电图[EEG]）的便捷装置。此外，我们将光遗传学操控与钙信号记录无缝整合到LFP记录中。在癫痫发作期间，多个独立脑区均观察到强烈的后放电现象，并伴随钙信号的增强。 本研究采用的方法为实现脑内不同区域的同步神经记录提供了一种简便且灵活的策略，有望通过揭示多种神经系统疾病中相关脑区的神经活动特征，推动该领域的研究进展。
引言
癫痫是一种常见的神经系统疾病，其特征是反复发作的癫痫发作，表现为抽搐、感觉障碍和意识丧失1。癫痫的病理生理机制十分复杂，涉及多个相互连接的脑区2,3。近年来，神经影像学的进展揭示了与癫痫相关的大尺度脑网络4,5。然而，对于癫痫发作产生与传播背后的复杂环路和网络机制的理解仍然有限，部分原因在于多脑区神经记录技术的应用尚不充分6。因此，开发一种灵活且集成的方法，能够同时监测不同脑区的神经活动，显得尤为迫切。
通过电生理记录来捕捉癫痫发作并确定癫痫的存在7。除了记录电生理活动外，目前在癫痫研究中越来越重视特定 神经元群体中钙活动的精确性8,9。随着钙指示剂合成技术的进步以及多种探针设计的发展，研究人员已开始采用光纤光度法来捕捉脑内神经元活动及神经物质的变化10,11。电生理记录与光纤光度法这两种独立的神经元活动检测方法相互补充，有助于更全面地理解动态的神经过程。
此外，同步记录和调控神经活动对于在神经网络和细胞水平上深入理解大脑功能至关重要。该方法使研究人员能够实时观察和操控大脑的复杂过程。由于光遗传学具有选择性刺激或抑制神经活动的独特能力，已成为研究神经信号传导不可或缺的工具。12尽管多部位电生理记录在神经科学中已得到广泛应用13，多脑区电生理记录与光纤光度法及光遗传学操控的结合仍较为有限。更重要的是，当前用于制备和植入多脑区电极的方法缺乏灵活性14这些局限性阻碍了我们解析特定神经环路功能及多个脑区之间相互作用的能力。本文介绍了一种经济高效且操作便捷的多脑区 体内 一种记录方法，可揭示点燃诱导性癫痫发作及其他神经精神疾病中跨脑区的神经元活动过程。
方案
本方案已获得复旦大学动物护理与使用委员会的批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》所制定的指南和规定进行。本研究已采取一切可能的措施以尽量减少所使用的动物数量。各步骤所需的操作时间已在相应步骤中注明。
1. 电极的制备（图1）
- 剪取适当长度的钨丝（约 20 mm），在一端烧去绝缘层以露出钨丝（1.6–2 mm）。将另一端弯成 "L" 形状（参见 图1A，约1分钟）
- 小心地放置 "L" 将钨丝的末端连接到光纤上（参见 图 1B，约1分钟）。
注意：钨丝应比光纤尖端长 0.2–0.4 mm。 - 将一滴粘合剂蘸取后涂抹于光纤与钨丝的连接界面（参见 图1C，约1分钟）。由于液体的表面张力，钨丝将附着在光纤上。
- 涂抹粘合剂一次，待其干燥后，再涂第二层。这将进一步增强钨丝与光纤之间的结合强度（参见 图1C，约1分钟。
注意：在操作过程中，应防止粘合剂流至光纤尖端，以免影响其透光率。 - 在角落处的 "L" 形状，使用粘合剂将光纤基部与钨丝紧密粘合在一起（约1分钟）。
注意：胶滴与光纤和钨丝之间接触面积的增加以及胶滴的球形凝固，可确保光纤与钨丝之间形成牢固的结合。 - 使用焊接将钨丝与母头连接器的引脚连接（参见 图1D，每个约3分钟
注意：由于钨丝对热不敏感，可通过切割插针槽位置制成金属套管，将两个部件物理连接，从而将焊接成功率提高至近100%。随后，焊料填充套管，确保插入的钨丝与插针之间形成稳定连接。 - 根据实验设计，焊接所需数量的光电子器件（参见 图1E，约10分钟）
注意：本研究中使用了三个光电子探针。 - 将漆包线剪至适当长度（约30 mm），并烧除两端的绝缘层。将漆包线一端缠绕在螺钉根部并焊牢。用烙铁将漆包线另一端连接至母头连接器的引脚，作为颅骨电极的脑电记录引线和接地连接（参见 图1F，约5分钟
注意：由于漆包线具有良好的柔韧性，便于连接颅骨和雌性连接器的引脚。将漆包线缠绕在螺丝上后再进行焊接，比表面贴装焊接更可靠。 - 将热熔胶涂抹在母连接器的针脚阵列上，以封装母连接器并确保焊点被完全包覆。在热熔胶固化过程中，使用塑料板对胶体进行塑形，以尽量减少植入时所占空间（参见 图1F，约3分钟
注意：由于使用热熔胶可能存在烫伤风险，AB胶被视为更安全的替代品。 - 接下来，使用光照强度计和数字万用表测量亮度和电导率。通过上述测试后，装置即可投入使用（参见 图1G，约2分钟
注意：使用激光时，务必佩戴适合该激光波长和功率的防护眼镜。需要高质量的光纤，以确保至少80%的光信号从光纤跳线末端传输至可植入光纤的尖端。此外，测量钨丝尖端至针座插槽之间的电阻，其可接受范围为1–5 Ω。 - 使用前，将制备好的电极浸入75%酒精中15分钟，然后转移至无菌生理盐水（约16分钟）。
注意：封装电极装置的总重量（0.6701 ± 0.01123 g，n = 4）不会影响小鼠的活动。电极预先采用等离子体灭菌法进行灭菌。
2. 电极植入方案（图2）
- 使用异氟烷（2%–4%）麻醉小鼠，并将其固定在立体定位仪中（见图2A，约2分钟）。在麻醉期间，为小鼠眼睛涂抹眼膏以防止角膜干燥。在颅骨切口周围皮肤局部注射利多卡因，并皮下注射卡洛芬，剂量为5 mg/kg。
注意：通过检测翻正反射消失以及脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。对于较长时间的手术操作，使用注射类 麻醉剂更为合适。 - 将动物固定于立体定位仪后，沿颅骨边缘修剪头皮，并用75%酒精擦拭颅骨表面，以暴露前囟（bregma）和后囟（lambda）的位置（见图2B，约3分钟）。
注意：术前准备包括剪毛、手术区域消毒、器械及手术工具的预灭菌处理。 - 调整脑部水平位置，使用微型钻头在目标区域（ROI）上方钻孔（直径约0.8 mm），并通过注射泵注入相应病毒（见图2C–F，约20分钟）。
注意：本研究中所用病毒及目标区域的详细信息见材料表和图3。 - 使用持针器夹持光探针（optrodes），将其尖端移至前囟点，并将此位置设为“零点”。以前囟点为参考坐标，将光探针移动至目标脑区（见图2G，约3分钟）。将光探针置于病毒注射位点上方0.3 mm处。
注意：在垂直植入策略中，两个电极之间的最小 距离约为2 mm，具体取决于光纤套管厚度和陶瓷插芯的外径。对于邻近脑区的同时记录，可采用斜向插入法。 - 将光纤插入相应脑区后，在其周围涂抹少量组织粘合剂，覆盖暴露的组织。随后依次添加更多粘合剂和少量牙科水泥。待牙科水泥固化后，小心移除持针器（见图2H，约5分钟）。
- 每次新的光探针植入前，需进行重新校准，即重复步骤2.4（见图2I）。
注意：每次植入时，均以前囟点作为“零点”定位光探针。 - 在所有光探针植入完成后，使用微型钻头在后囟点后方钻孔用于“接地”（Ground），并在新皮质上方钻孔用于“脑电图”（EEG）记录（约1分钟）。
注意：所钻孔的直径（约1.1 mm）需与螺钉直径相匹配。 - 将颅骨螺钉插入皮层上方及后囟点后方的钻孔中（见图2J，约5分钟）。
注意：颅骨螺钉分别用于脑电图记录和接地。 - 整理钨丝和漆包线，使其位于植入区域上方，且不暴露于颅骨外。使用固定器固定母连接器的位置（见图2K，约2分钟）。
- 用牙科水泥填充植入部位，确保电极装置与颅骨之间连接稳固。将内部导线封装，仅暴露母连接器的插入口，以便与头戴式放大器（headstage）连接（见图2L，约6分钟）。
- 待牙科水泥完全硬化后，用碘伏涂抹暴露头皮边缘的皮肤，然后将动物置于加热垫上（约1分钟）。
注意：必须确保动物在恢复足够意识、能够维持胸卧位之前不被单独留置。整个存活手术过程中应保持无菌条件。 - 给予抗生素和镇痛药以支持术后恢复。
注意：接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。动物术后每日腹腔注射头孢曲松钠（180 mg/kg）， 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）， 并在手术伤口处涂抹利多卡因凝胶，连续3天。动物需存活指定时间以完成行为学测试。随后使用4%–5%异氟烷实施安乐死，进行灌注及组织切片，以评估病毒感染情况和电极植入位点。
3. 记录方案 体内 脑
- 在进行信号记录和行为学测试（开放旷场实验）15之前，需确保小鼠经过为期3天的温和抓握适应，以使其熟悉实验环境。
注意：本研究中，将小鼠置于开放旷场（42 cm × 42 cm）中自由活动，以便观察其癫痫样行为。 - 使用异氟烷（2%–4%）麻醉小鼠后，按照记录位点的顺序依次连接光纤，然后插入头件。
- 设置635 nm光脉冲，占空比为10%，频率为20 Hz；在记录期间进行10 s（200次脉冲）的光刺激，光纤尖端的光强设定为3 mW。
- 使用光纤光度系统，通过470 nm LED通道以30 Hz的采样率记录Gcamp6m信号的行为学测试期信号。
- 在光遗传学刺激下，同步记录钙信号、局部场电位（LFPs）和脑电图（EEG），并同时采集相应的行为表现数据（见图3）。
- 采用晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号同步标记，以确保记录数据的时间一致性。
4. 数据处理
- 将光度测量数据载入 MATLAB 软件，然后使用自定义代码（补充文件 1）对钙信号进行去趋势处理。
- 使用公式（1）定义荧光强度的变化：
ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 （1）
其中 Ft 表示实时钙信号的荧光值，F0 表示事件发生前平均的基础荧光强度。 - 将采样率为 1000 Hz 的电生理数据导入 MATLAB（补充文件 2）。
- 根据同步标记，协调显示钙信号与电生理数据。
结果
我们结合光遗传学与多脑区电生理记录及钙成像技术，以观察光遗传性癫痫发作期间多个脑区的神经元活动。为此，将一种腺相关病毒（AAV）注射至啮齿类动物经典的致痫灶——梨状皮层（ROI 1）17，该病毒在CaMKIIα启动子控制下表达ChrimsonR（AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry）16。此外，将AAV-hsyn-Gcamp6m18注射至另外三个脑区（ROI 1–3，见图3A）。随后，在这些脑区植入自制的光探针，并在对侧颅骨植入脑电图（EEG）电极（图3B）。
4 周后，ChrimsonR 和 Gcamp6m 在目标脑区中高表达（图 3C）。在以 20 Hz 的频率进行短暂的 10 秒光刺激以激活 ChrimsonR 阳性神经元后，小鼠表现出全身性癫痫样行为。我们通过同步多光纤光度测定与电生理技术，采集了自由活动小鼠感兴趣区域（ROI）的钙活动和局部场电位（LFP）信号（图 3D）。短暂的光遗传学刺激在这些脑区诱发了显著的后放电现象，并伴随明显的 Ca2+ 活动增强（图 3E）。在光刺激区域观察到 30 Hz 的响应，该响应由蓝光 LED 在 30 Hz 采样频率下激活光遗传学蛋白所诱导。记录通道中未观察到 50 Hz 电源线干扰。这些结果表明，在光遗传学刺激下，多个脑区间的同步电生理活动与钙信号响应可被可靠记录。
图1：柔性光电极的结构示意图。（A）“L”形钨丝与光纤的制备。（B）将光纤与钨丝固定在胶带上。（C）使用胶水将光纤与钨丝粘合在一起。（D,E）将钨丝焊接至连接器。（F）将螺钉焊接至连接器，并用热熔胶对连接器进行封装。（G）对光电器件组装体进行质量检测。G代表接地电极的针孔；R代表参考电极的针孔。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：植入手术工作流程。（A）将小鼠固定在立体定位仪上。（B）去除头皮，充分暴露颅骨。（C）将注射用玻璃管连接至泵。（D）调整小鼠头部至水平位置。（E、F）钻孔并注射病毒。（G）用持针器夹持光探针。（H）将光探针植入相应脑区，并用牙科水泥固定。（I）每次植入前重新调整零位。（J）在光探针植入后植入脑电图电极。G/R：地电极与参考电极在插针位置短接。（K）有序排列导线，并固定连接器。（L）用电科水泥包裹并固定电极装置。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：体内同步电生理与钙信号记录。（A）病毒注射的实验设计。（B）光探针植入的实验方案。（C）共聚焦图像显示病毒在靶区域的表达。比例尺 = 200 µm。（D）在自由活动状态下进行光遗传学刺激、同步电生理记录和钙信号记录的示意图。（E）钙信号（上）、局部场电位（LFP，中）、脑电图（EEG，下）的代表性轨迹及其对应的功率谱图。红线：10 s 光刺激。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1：钙信号编码文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：LFP 信号的编码文件。 请点击此处下载该文件。
讨论
本研究采用自制的光遗传电极装置，实现了对多个脑区的在体神经信号记录。该系统同时进行光遗传学刺激、钙信号记录和电生理记录的可行性已得到验证。本文所述的电极制备方法高效且成本低廉。根据实验设计，我们能够记录来自相关脑区的信号。光遗传电极的策略性布局使得有望从全脑多个区域提取丰富的神经信息。多模态检测范式的整合为解析复杂的神经环路、阐明脑区之间的功能关系提供了有力手段。
在本研究的代表性数据中，同时记录了整个局部脑区广泛神经元的钙信号和电生理信号。随着转基因动物构建技术的进步19,20，将表达Gcamp病毒的Cre小鼠与FlpO小鼠相结合，可实现对特定神经元神经活动的记录。因此，通过这些整合方法，该技术使我们能够解码不同脑区中特定神经元的响应。此外，多种分析方法将有助于分析来自多个脑区的电生理信号和钙信号。例如，可采用相干性分析和格兰杰因果分析，以获得不同脑区之间新颖的理论通信特征21,22,23。此外，环路示踪技术的进步有助于揭示脑区之间的结构连接24。这些整合技术增强了对不同脑区间关联响应的理解，并革新了对神经环路和网络中连接与相互作用的认识。
在本研究中，我们采用了光遗传学点燃模型来模拟癫痫。与癫痫点燃模型中的电刺激相比，光遗传学不仅具有更高的时间分辨率，还具备更强的细胞特异性25,26。此外，它还能通过同一根光纤实现光传递和钙信号记录。多脑区活动检测与光遗传学调控相结合，将有助于闭环式癫痫干预方法的发展，通过抑制性调控实现对多个脑区的调节干预，从而增强抗癫痫效果27,28。将这些设备与其他现有的神经调控技术相结合，对于慢性疼痛的检测与闭环干预也具有重要意义29,30。此外，该方法还可拓展至其他神经系统疾病，如睡眠障碍31和阿尔茨海默病，其中40 Hz振荡及感觉输入后信息处理等现象需要借助多脑区in vivo记录加以阐明32。因此，熟练应用这一多维度方法将加深我们对多个脑区之间相互作用的理解，并为多种疾病的精准治疗提供宝贵见解。
该光遗传电极检测方法存在一定的局限性，有待在未来的研究中加以改进。尽管局部场电位（LFP）信号能够被顺利获取，但利用当前方法检测锋电位活动仍具有挑战性33。我们计划 用多通道柔性电极替代钨丝电极。此外，光纤的厚度以及胶粘剂的安全性也需仔细考量。
披露
作者声明无任何需披露的竞争性财务利益。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（31871085）、上海市自然科学基金（21ZR1407300）、上海市科技创新重大专项（2018SHZDZX01）、之江实验室以及上海脑科学与类脑研究中心的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8-32 适配器 | Plexon | 定制订购 | 连接母头连接器与前置放大器 |
| AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry | Taitool 生物科学 | S0371-9 | 4 × 1012 VG/mL |
| AAV-hsyn-Gcamp6m | Taitool 生物科学 | S0471-9 | 4 × 1012 VG/mL |
| DAPI | Sigma | 236276 | 稀释比例 1:500 |
| 牙科水泥 | New Century Dental | 430205 | |
| 电生理记录系统 | Plexon | Omniplex | |
| 漆包线 | N/A | 定制订购 | 直径 = 0.2 mm |
| 母头连接器 | N/A | 定制订购 | 1.25 mm 间距 |
| 胶水 | Loctite | 45282 | |
| 激光器 | 长春新产业 | BH81563 | 635 nm |
| MATLAB | MathWorks | R2021b | |
| 微型钻头 | RWD | 78001 | |
| 多通道光纤光度系统 | ThinkerTech | FPS-SS-MC-LED | |
| 光纤 | 西安博高 | L-200UM | 根据目标脑区的深度选择合适的光纤长度。 |
| 聚对二甲苯涂层钨丝 | A-M System | 795500 | 裸露部分 0.002"；涂层部分 0.0040" |
| 光功率计 | Thorlabs | PM100D | |
| 立体定位仪 | RWD | 68807 | |
| 组织粘合剂 | 3M | 1469SB |
参考文献
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