一种用于多区域体内记录的灵活方便的电生理光导的综合方法

摘要

我们开发了一种简化且经济高效的电极制造方法，并在自由移动的小鼠中跨多个区域进行信号记录。利用光遗传学，以及多区域电生理学和钙信号记录，能够在癫痫发作点燃模型中揭示跨区域的神经元活动。

摘要

癫痫是一种神经系统疾病，其特征是涉及多个大脑区域的同步异常放电。局灶性病变促进癫痫信号通过相关的神经回路传播。因此， 来自 关键大脑区域的局部场电位 （LFP） 的体内记录对于破译参与癫痫发作传播的电路至关重要。然而，目前的电极制造和植入方法缺乏灵活性。在这里，我们提出了一种方便的设备，专为跨多个区域的电生理记录（LFP 和脑电图 [EEG]）而设计。此外，我们将光遗传学操作和钙信号传导记录与 LFP 记录无缝集成。在癫痫发作期间，在几个单独的区域观察到强劲的出院后，并伴有钙信号的增加。本研究中使用的方法为大脑不同区域的同步神经记录提供了一种方便灵活的策略。它通过提供对涉及这些疾病的多个区域的神经特征的见解，具有推进神经系统疾病研究的潜力。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病，其特征是反复发作，表现为抽搐、感觉障碍和意识丧失¹。癫痫的病理生理机制很复杂，涉及多个相互关联的大脑区域 ^2,3。神经影像学的最新进展揭示了涉及癫痫的大规模网络 ^4,5。然而，对癫痫产生和传播的复杂电路和网络机制的理解仍然有限，部分原因是多区域神经记录技术的应用不足⁶。因此，开发一种灵活的集成方法，能够同时监测不同大脑区域的神经活动势在必行。

进行电生理记录以捕获癫痫发作并确定癫痫⁷ 的存在。除了记录电生理活动外，癫痫研究中越来越强调特定神经群的精确钙活性 ^8,9。钙指示剂合成和各种探针设计的进步促使研究人员采用纤维光度法来捕获大脑内神经元活动和神经物质的变化^10,11。检测神经元活动的两种独立方法，即电生理学和纤维光度法记录，相辅相成，有助于更全面地了解动态神经元过程。

此外，同步记录和调节神经活动对于深入了解网络和细胞水平的大脑功能至关重要。这种方法使研究人员能够实时观察和操纵大脑的复杂过程。光遗传学因其独特的选择性刺激或抑制能力而成为探测神经信号转导不可或缺的工具¹²。尽管多位点电生理记录在神经科学中得到了广泛的应用¹³，但多区域电生理记录与纤维光度测量和光遗传学操作的集成仍然有限。更重要的是，目前制造和植入多区域电极的方法缺乏灵活性¹⁴。这些限制阻碍了我们剖析跨多个区域的特定电路功能和相互作用的能力。在这里，我们提出了一种经济高效且方便的多区域 体内 记录方法，该方法阐明了点燃诱导的癫痫发作和其他神经精神疾病中跨区域的神经元过程。

方案

该方案获得了复旦大学动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》制定的指南和规定进行。采取了所有可能的措施来最大限度地减少本研究中使用的动物数量。执行每个步骤所需的时间包含在相应的步骤中。

1. 电极的制备（图 1）

1. 剪下适当长度的钨丝 （~20 mm） 并烧掉一端的绝缘层，露出钨丝 （1.6-2 mm）。将导线的另一端弯曲成"L"形（参见 图 1A，~1 分钟）
2. 小心地将钨丝的"L"端放在光纤上（参见 图 1B，~1 分钟）。
   注意: 钨丝应比光纤尖端长 0.2-0.4 毫米。
3. 蘸一滴粘合剂并将其涂抹在光纤和钨丝的界面上（参见 图 1C，~1 分钟）。由于液体的表面张力，钨丝会附着在光纤上。
4. 将胶粘剂涂抹一次，然后让其干燥。然后，涂上第二层。这将进一步收紧钨丝和光纤之间的粘合（参见 图 1C，~1 分钟）。
   注意:在应用过程中，应注意防止胶粘剂流到光纤尖端，因为这可能会影响其透射率。
5. 在"L"形的角落，使用粘合剂将光纤的底部和钨丝紧密粘合在一起（~1 分钟）。
   注意:增加的接触面积和胶滴的球形凝固确保了光纤和钨丝之间的牢固粘合。
6. 使用焊接在钨丝和母连接器的引脚之间建立连接（参见 图 1D，每个 ~3 分钟）
   注意:由于钨丝对热不敏感，因此通过切割引脚槽位置来形成金属套管，将两个组件物理地结合在一起，可以将焊接成功率提高到近 100%。随后，填充套管的焊料确保了插入的钨丝和引脚之间的稳定连接。
7. 根据实验设计，焊接所需数量的光电极（参见 图 1E，~10 分钟）
   注意:本研究中使用了三种 optrodes。
8. 将漆包线剪成合适的长度 （~30 mm） 并烧掉两端的绝缘层。将漆包线的一端缠绕在螺丝的底部并焊接。通过烙铁将漆包线的另一端连接到母连接器的引脚，用作颅骨电极的 EEG 记录和接地连接（参见 图 1F，~5 分钟）
   注意:由于漆包线的柔韧性，连接母头骨和母连接器的引脚很方便。将漆包线缠绕在螺钉上后进行焊接比表面贴装焊接更可靠。
9. 将热熔胶涂在母连接器的引脚阵列上，以封装母连接器并确保焊点完全包裹。在热熔胶凝固过程中，使用塑料板对胶粘剂进行塑形，以尽量减少植入过程中的空间占用（参见 图 1F，~3 分钟）
   注意:由于使用热熔胶存在潜在的燃烧风险，AB 胶粘剂被认为是一种更安全的替代品。
10. 接下来，使用光强度计和数字万用表测量光度和电导率。通过这些测试后，设置就可以使用了（参见 图 1G，~2 分钟）
    注意:使用激光时，请始终佩戴适合激光特定波长和功率的防护眼镜。需要高质量的光纤才能将至少 80% 的光从跳线末端传输到植入式光纤的尖端。此外，从钨丝尖端到排针槽的电阻是在 1-5 Ω的可接受范围内测量的。
11. 使用前，将制备好的电极浸入 75% 酒精中 15 分钟，然后将它们转移到无菌盐水中（~16 分钟）。
    注意:封装电极装置的总重量（0.6701 ± 0.01123 g，n = 4）不会影响小鼠的活动。使用等离子体灭菌预先对电极进行灭菌。

2. 电极植入方案（图 2）

1. 用异氟醚 （2%-4%） 麻醉小鼠并将它们固定在立体定位装置中（参见 图 2A，~2 分钟）。在小鼠眼睛上使用眼膏以防止麻醉时干燥。将利多卡因涂抹在颅口切口周边的皮肤上，并以 5 mg/kg 的剂量皮下注射卡洛芬。
   注意:通过没有扶正反射和对脚趾捏的反应丧失来确认适当的麻醉。对于长时间的外科手术，使用注射麻醉剂更合适。
2. 将动物固定在立体定位装置中后，沿颅骨边缘修剪头皮，并用 75% 酒精擦拭颅骨表面，以暴露前囟和 lambda 的位置（参见 图 2B，~3 分钟）。
   注意:术前程序包括剪头发、对手术部位进行消毒、对器械和手术工具进行预消毒。
3. 使用微钻调平大脑并在感兴趣区域 （ROI） 上方钻孔 （~0.8 mm）。用注射泵注射相关病毒（参见 图 2C - F，~20 分钟）。
   注意:有关本研究中病毒和 ROI 的详细信息显示在 材料表 和 图 3 中。
4. 用支架握住 optrodes，将它们的尖端移动到前囟点，将此位置设置为 "零"。使用前囟点作为参考坐标，将光线移动到目标区域（参见 图 2G，~3 分钟）。将 optrodes 放置在病毒注射部位上方 0.3 毫米处。
   注意:在垂直植入策略中，两个电极之间的最小距离约为 2 mm，具体取决于光纤套管的厚度和套圈的外径。倾斜插入方法可用于从位置较近的区域同时录制。
5. 将光纤插入相应的大脑区域后，在它们周围涂抹少量组织粘合剂以覆盖暴露的组织。然后，依次涂抹额外的粘合剂和少许牙科水泥。牙科粘结剂凝固后，小心地松开支架（参见 图 2H，~5 分钟）。
6. 在每次新的光子植入之前，进行重新校准，其中包括重复步骤 2.4（参见 图 2I）。
   注意:对于每次植入，将前囟处的对角定位为"零"点。
7. 植入所有视光后，使用微钻（~1 分钟）在 lambda 点后面钻"地"和新皮层上方的孔以"EEG"。
   注意:钻孔的尺寸 （~1.1 mm） 需要与螺钉的直径相匹配。
8. 将颅骨螺钉插入皮层上方和 lambda 点后面的孔中（参见 图 2J，~5 分钟）。
   注意: 颅骨螺钉分别用于 EEG 记录和接地。
9. 整理钨丝和漆包线，使它们位于植入区域上方，而不是暴露在颅骨外。使用支架固定母连接器的位置（参见 图 2K，~2 分钟）。
10. 用牙科粘固剂填充植入部位，以确保电极装置和颅骨之间的稳定连接。封装内部电线，让母连接器的插入孔暴露在外，以便连接到头部tage（参见 图 2L，~6 分钟）。
11. 牙科粘结剂硬化后，将碘涂抹在裸露头皮周边的皮肤上，然后将动物放在加热垫上（~1 分钟）。
    注意:确保动物在恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前不要无人看管。在整个存活手术过程中应保持无菌条件。
12. 使用抗生素和镇痛药以支持术后恢复。
    注意:接受手术的动物在完全康复之前不会再次与其他动物相伴。动物腹膜内注射头孢曲松钠 （180 mg/kg），皮下注射卡洛芬 （5 mg/kg），利多卡因凝胶每天涂抹于手术伤口，持续 3 天。动物需要存活指定的时间才能完成行为测试。随后，它们将使用 4%-5% 异氟醚被安乐死，然后进行灌注和组织切片，以评估病毒感染和电极植入部位。

3. 体内脑记录协议

1. 在进行信号记录和行为测试（旷场测试）¹⁵ 之前，确保对鼠标进行 3 天的温和处理，以使其适应环境。
   注意:在这项研究中，小鼠被放置在开阔的场地（42 厘米× 42 厘米）中自由移动，使我们能够观察它们的癫痫发作行为。
2. 用异氟醚 （2%-4%） 麻醉小鼠后，在插入头部之前，按照记录部位的顺序依次连接光纤。
3. 将 635 nm 光脉冲设置为 10% 占空比，频率为 20 Hz。在录制过程中将光刺激设置为 10 秒（200 个脉冲）。将光纤尖端的强度设置为 3 mW。
4. 使用光纤光度计系统通过 470 nm LED 通道以 30 Hz 的采样率记录 Gcamp6m 信号行为测试周期。
5. 在光遗传学刺激下同时记录钙信号、LFP 和 EEG，以及相应的行为表现（见 图 3）。
6. 采用晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 信号同步标记，以确保记录数据的时间一致性。

4. 数据处理

1. 将光度数据加载到 MATLAB 软件。然后，使用自定义编码（补充文件 1）对钙信号进行去趋势化。
2. 用公式 （1） 定义荧光强度的变化:
   ΔF/F = （F_t - F₀）/ F₀ （1）
   其中 F_t 表示实时钙信号荧光值，F₀ 表示事件发生前的平均基线荧光强度。
3. 将采样率为 1000 Hz 的电生理数据导入 MATLAB（补充文件 2）。
4. 协调钙信号转导和电生理数据的显示与同步标记物对齐。

结果

我们将光遗传学与多区域电生理记录和钙成像相结合，以观察光遗传学癫痫发作期间各个大脑区域的神经元活动。为此，将表达 ChrimsonR 的腺相关病毒 （AAV） 在 CaMKIIα 启动子 （AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry）¹⁶ 的控制下注射到啮齿动物的经典致癫痫部位梨状皮层 （ROI 1）¹⁷ 中。此外，AAV-hsyn-Gcamp6m¹⁸ 被注射到三个区域 （ROI 1-3，如图 3A 所示）。随后，在这些区域植入定制的 optrodes，并将 EEG 电极植入对侧颅骨（图 3B）。

4 周后，ChrimsonR 和 Gcamp6m 在目标脑区高度表达 （图 3C）。小鼠在 20 Hz 下短暂的 10 秒光刺激以激活 ChrimsonR 阳性神经元后表现出全身性癫痫发作行为。我们通过采用同步多纤维光度法和电生理学技术，从自由移动的小鼠的 ROI 中收集钙活性和 LFP 信号（图 3D）。通过短暂的光遗传学刺激，在这些区域引发了强劲的放电后，以及 Ca²⁺ 活性的显着增加（图 3E）。在光刺激区域观察到 30 Hz 响应，这是由光遗传学蛋白在 30 Hz 采样频率下通过蓝光 LED 激活诱导的。在记录通道中未观察到 50 Hz 电力线干扰。这些结果表明，在光遗传学刺激下，跨多个区域的同步电生理和钙信号反应的可靠记录。

图 1:柔性光环的示意图。 （A） "L"形钨丝和光纤的制备。（B） 将光纤和钨丝放置在胶带上。（C） 用胶水将光纤和钨丝粘在一起。（D，E）钨丝焊接到连接器上。（F） 将螺钉焊接到连接器上，并用热熔胶封装连接器。（G） 对 optrode 组件进行了质量检查。G 表示接地电极的针孔;R 表示参比电极的针孔。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:植入手术的工作流程。 （A） 将小鼠固定在立体定位装置上。（B） 头皮被切除，颅骨充分暴露。（C） 注射玻璃管连接到泵。（D） 将鼠标的头部调整到水平位置。（东、女）钻孔，并注射病毒。（G） 支架抓住了 optrode。（H） 将 optrode 植入相关区域并用牙科粘固剂固定。（I） 每次植入前重新调整零位。（J） 在 optrode 植入后植入 EEG 电极。G/R:接地极和参比电极在引脚位置短路。（K） 电线按顺序排列，连接器固定。（L） 电极装置用牙科粘固剂包裹固定。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3: 体内同步电 生理和钙记录。 （A） 病毒注射的实验设计。（B） optrode 植入的实验方案。（C） 共聚焦图像显示病毒在目标区域的表达。比例尺 = 200 μm。（D） 自由移动状态下的光遗传学刺激、同步电生理和钙记录示意图。（E） 钙信号（上）、LFP（中）信号、EEG（下）和相应的功率谱图的代表性轨迹。红线:10 秒灯。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1:钙信号的编码文件。请点击此处下载此文件。

补充文件 2:LFP 信号的编码文件。请点击此处下载此文件。

讨论

在这里，我们采用了一种自制的 optrode 装置来跨多个区域 进行体内 神经信号记录。该系统同时进行光遗传学刺激、钙信号记录和电生理记录的可行性已得到验证。本文描述的电极制备方法是高效且具有成本效益的。根据实验设计，我们可以记录来自相关大脑区域的信号。光的策略安排允许从大脑的多个区域提取丰富的信息。多模态检测范式的整合为剖析错综复杂的神经回路、阐明大脑区域之间的关系提供了机会。

在本研究的代表性数据中，同时记录了来自整个局部脑区广谱神经元的钙信号和电生理信号。随着转基因动物构建技术的进步 ^19,20，Cre 小鼠和 FlpO 小鼠与表达 Gcamp 病毒的结合允许记录来自特定神经元的神经活动。因此，这种方法使我们能够通过这些集成方法解码不同大脑区域的特定神经元的反应。此外，不同的分析方法将有助于分析从多个大脑区域收集的电生理和钙信号。例如，可以采用相干分析和格兰杰因果关系分析来获得不同大脑区域之间新颖的理论通信特征 21,22,23。此外，电路追踪技术的进步有助于解开大脑区域之间的结构联系²⁴。这些集成技术增强了对各个大脑区域相关反应的理解，并彻底改变了对电路和网络中连接和交互的理解。

在这项研究中，我们采用了癫痫的光遗传学 Kindling 模型。与癫痫点燃模型中的电刺激相比，光遗传学不仅提供了更高的时间分辨率，而且还增强了细胞特异性^25,26。此外，它还能够通过同一根光纤进行光传输和钙记录。多区域活动检测和光遗传学调节将补充闭环癫痫干预方法，允许通过抑制调节跨多个大脑区域进行调节干预，从而增强抗癫痫作用^27,28。将这些设备与其他现有的神经调控技术相结合，用于慢性疼痛的检测和闭环干预也很重要^29,30。此外，这种方法可能扩展到其他神经系统疾病，例如睡眠障碍³¹ 和阿尔茨海默病，其中 40 Hz 振荡和感觉输入后的信息处理等现象需要通过多区域体内记录³² 进行阐明。因此，熟练地应用这种多方面的方法将加深我们对多个地区之间相互作用的理解，并为各种疾病的精准治疗提供有价值的见解。

这种 optrode 检测方法存在局限性，可以在未来的研究中加以改进。虽然很容易获得 LFP 信号，但使用当前方法检测刺突活动仍然具有挑战性³³。我们的目标是用多通道柔性电极取代钨丝。应仔细考虑纤维的厚度和胶水胶粘剂的安全性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-32 适配器	Plexon	定制	连接母连接器和头部
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	滴度 1：500
牙科水泥	New Century 牙科	430205
电生理记录系统	Plexon	Omniplex
漆包线	N/A	定制订购	直径 = 0.2 毫米
母连接器	N/A	定制订购	1.25 mm 间距
胶	Loctite	45282
激光	长春新业	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
多通道光纤光度计	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
光纤	习安博高	L-200UM	目标脑区的深度选择合适的光纤长度。
PFA 涂层钨丝	A-M 系统	795500	裸露 0.002";涂层 0.0040 英寸
功率计	Thorlabs	PM100D
立体定位 Fxrame	RWD	68807
组织粘合剂	3M	1469SB