本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。
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本文内容
摘要
摘要
DNA损伤应答是一种遗传信息保护机制，可防止细胞持续传递受损的DNA。对参与该过程的蛋白质进行表征，有助于识别多种疾病（如癌症、衰老相关疾病和慢性炎症）治疗干预的潜在靶点。邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）作为一种研究工具，可用于评估蛋白质之间的相互作用以及细胞器或细胞结构之间的空间邻近性，并能够在例如应激条件下进行时间依赖性的定位和共定位分析。该方法操作简便，类似于传统的免疫荧光技术，可同时对细胞器、细胞结构或特定标记物（如线粒体、内质网、PML小体或DNA双链断裂标记物γH2AX）进行染色。组蛋白H2A变体H2AX在丝氨酸139位点（S139）发生磷酸化后被称为γH2AX，被广泛用作检测DNA双链断裂的高度敏感且特异的标志物。每个γH2AX染色焦点对应于DNA上一处断裂，通常在损伤发生数分钟后即可出现。分析γH2AX焦点的变化是研究目标蛋白是否参与DNA损伤应答（DDR）最常用的实验方法。当预期目标蛋白直接作用于DNA损伤位点时，可通过荧光显微镜检测其与γH2AX焦点的共定位情况。然而，除新型超分辨率荧光技术外，传统方法在判断与DNA损伤位点的局部相互作用时可能存在一定主观性。本文介绍一种利用γH2AX作为损伤位点标记物来评估蛋白在DDR通路中定位的实验方法。该方法可用于表征目标蛋白在不同DNA损伤刺激下的时间依赖性定位特征。
引言
细胞DNA损伤每天都会因自发的化学反应而发生，同时也会因外界因素（如遗传毒性试剂（辐射和依托泊苷等化学物质）和氧化应激）而加剧1,2,3。细胞拥有一套复杂的修复机制，能够纠正多种不同类型的DNA损伤，从碱基切除到复制叉的扭转或中断，直至最严重的损伤形式：DNA双链断裂4,5。
参与DNA损伤应答（DDR）的多种蛋白质已被鉴定，大量优秀的综述探讨了非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，这两种主要通路参与双链断裂（DSB）的修复5,6。组蛋白H2A变体H2AX在丝氨酸139位点的磷酸化（后文称为γ-H2AX）多年来被用作检测双链断裂的一种灵敏且可靠的标志物。H2AX的磷酸化在损伤发生后的数分钟内即可被检测到，并可持续数小时7。
使用免疫荧光法检测γ-H2AX焦点的优势在于能够表征焦点的时间和空间分布，并可与其他蛋白质进行共染色。此外，免疫荧光无需细胞....
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方案
1. 细胞铺板
注意：细胞可接种于显微荧光载玻片、培养腔或培养板中。建议使用小型盖玻片或96/384孔板以检测多种条件并节省试剂。对于容易脱落的细胞系（如HEK293细胞），建议使用盖玻片。可预先用多聚-L-赖氨酸溶液包被盖玻片以增强细胞贴附。
- 接种细胞时需考虑设置溶剂对照、技术对照和生物对照。每个条件使用两到三个孔作为技术重复。
注意：必须设置技术对照（包括仅二抗和仅一抗的对照）。如有可能，还应包含生物对照（例如，靶蛋白的过表达或敲低，或已知可改变相互作用的条件）。- 在添加了10%胎牛血清（FBS）、4.5 g/L葡萄糖和4 mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养U2OS细胞，使用组织培养处理过的培养板，在37 °C、5% CO2及含90%空气的湿润环境中进行培养。根据待测条件的数量以及是否使用384孔板或60 mm培养皿中的盖玻片，分别从60 mm或100 mm培养皿开始培养。
- 当细胞融合度达到60%–70%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代14。使用血球计数板或自动细胞计数器计数细胞14。将4 × 105个细胞接种至含有多个13 mm圆形盖玻片的60 mm培养皿中，或每孔接种4 × ....
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结果
在未进行依托泊苷处理的情况下，我们观察到了Nek4与Ku70之间的相互作用。然而，这种相互作用可能发生在细胞核外（图1A）。DNA损伤后，Nek4与Ku70的相互作用增强，并集中在细胞核内（图1A）。在本实验中，以文献结果18为依据，将Nek5与拓扑异构酶IIβ（TOPIIβ）的相互作用作为阳性对照，结果显示，依托泊苷处理显著增强了Nek5与TOPIIβ的相互作用（图1B）。
依托泊苷处理使焦点数量增加了近40%（对照组细胞中平均每个细胞核9个焦点，而依托泊苷处理组细胞中每个细胞核有12至14个焦点）。Nek4与Ku70的相互作用并非仅存在于DNA损伤条件下。事实上，Nguyen等12研究表明，这些蛋白在无细胞损伤的情况下也可发生相互作用，且该相互作用不依赖于DNA，意味着这种相互作用并非总是发生在DNA损伤位.......
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讨论
数据表明，在DNA损伤应答谱型分析中，同时使用PLA与DNA损伤标志物可提供最丰富的信息，揭示损伤后相互作用在时空上的动态行为。PLA是一种多功能方法，已被用于二聚体鉴定、细胞器接触确定、蛋白质-核酸相互作用以及主要是蛋白质-蛋白质相互作用的研究10,11,19,20。 实施PLA的关键步骤包括确定并验证一抗、细胞接种密度、洗涤条件以及孵育温度。我们认为，将该技术与传统的免疫荧光方法联合使用，有助于明确相互作用发生的区域、时间和分布特征。
必须使用适当的技术对照，并强烈建议使用生物学对照。此外，对所有条件采用相同参数进行分析，可实现样本间的比较。
尽管 PLA 是一种简单的检测方法，无需特殊设备，但其商用试剂仍然略显昂贵，因此该技术适用于确证性实验，或在文献中已发.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢圣保罗州研究支持基金会（FAPESP，通过项目号2022/15126-9对JK的专题资助以及对LARM的奖学金资助21/09439-1）和国家科学技术发展委员会（CNPq）对本研究的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黑色384孔板 | Perkin Elmer Cell Carrier 板 | ||
| 驴 抗兔 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:300 |
| Duo link 驴抗小鼠 Minus | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink 抗体稀释液 | Sigma | DUO82008 | |
| Duolink 封闭液 1X | Sigma | DUO82007 | |
| Duolink 远红检测试剂 | Sigma | DUO92013 | |
| Duolink 驴抗山羊 Plus | Sigma | DUO92003 | |
| Duolink 驴抗兔 plus | Sigma | DUO92002 | |
| 依托泊苷 | Sigma | E1383 | |
| 山羊抗 Nek4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5517 | 山羊抗Nek4以1:50稀释比例使用 |
| Hoechst 33342 | 赛默飞世尔科技 | H1399 | 0.6 µg/mL |
| Leica DMI 显微镜 | Leica | ||
| 小鼠抗 Ku70 | 赛默飞世尔科技 | MA5-13110 | 小鼠抗 Ku70 抗体以 1:100 稀释比例使用 |
| 小鼠抗 TOPII 抗体β | Santa Cruz Biotechnology | SC-365071 | 1:25 |
| 兔抗 Nek5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-84527 | 1:25 |
| 兔抗 Y H2AX | 细胞信号传导 | 9718S | 1:100 稀释 |
| U2OS细胞系 | ATCC | HTB-96 |
参考文献
- Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
- Lindahl, T., Barnes, D. E. Repair of endogenous DNA damage.....
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