本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。
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摘要
摘要
DNA损伤应答是一种遗传信息保护机制，可防止细胞持续传递受损的DNA。对参与该过程的蛋白质进行表征，有助于识别多种疾病（如癌症、衰老相关疾病和慢性炎症）治疗干预的潜在靶点。邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）作为一种研究工具，可用于评估蛋白质之间的相互作用以及细胞器或细胞结构之间的空间邻近性，并能够在例如应激条件下进行时间依赖性的定位和共定位分析。该方法操作简便，类似于传统的免疫荧光技术，可同时对细胞器、细胞结构或特定标记物（如线粒体、内质网、PML小体或DNA双链断裂标记物γH2AX）进行染色。组蛋白H2A变体H2AX在丝氨酸139位点（S139）发生磷酸化后被称为γH2AX，被广泛用作检测DNA双链断裂的高度敏感且特异的标志物。每个γH2AX染色焦点对应于DNA上一处断裂，通常在损伤发生数分钟后即可出现。分析γH2AX焦点的变化是研究目标蛋白是否参与DNA损伤应答（DDR）最常用的实验方法。当预期目标蛋白直接作用于DNA损伤位点时，可通过荧光显微镜检测其与γH2AX焦点的共定位情况。然而，除新型超分辨率荧光技术外，传统方法在判断与DNA损伤位点的局部相互作用时可能存在一定主观性。本文介绍一种利用γH2AX作为损伤位点标记物来评估蛋白在DDR通路中定位的实验方法。该方法可用于表征目标蛋白在不同DNA损伤刺激下的时间依赖性定位特征。
引言
细胞DNA损伤每天都会因自发的化学反应而发生，同时也会因外界因素（如遗传毒性试剂（辐射和依托泊苷等化学物质）和氧化应激）而加剧1,2,3。细胞拥有一套复杂的修复机制，能够纠正多种不同类型的DNA损伤，从碱基切除到复制叉的扭转或中断，直至最严重的损伤形式：DNA双链断裂4,5。
参与DNA损伤应答（DDR）的多种蛋白质已被鉴定，大量优秀的综述探讨了非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，这两种主要通路参与双链断裂（DSB）的修复5,6。组蛋白H2A变体H2AX在丝氨酸139位点的磷酸化（后文称为γ-H2AX）多年来被用作检测双链断裂的一种灵敏且可靠的标志物。H2AX的磷酸化在损伤发生后的数分钟内即可被检测到，并可持续数小时7。
使用免疫荧光法检测γ-H2AX焦点的优势在于能够表征焦点的时间和空间分布，并可与其他蛋白质进行共染色。此外，免疫荧光无需细胞裂解，从而保留了细胞的结构背景信息，使其更具信息量。另外，由于γ-H2AX是从头合成的，在无DNA损伤的情况下其表达水平很低，因此可作为特异性标志物7。
H2AX 主要由 DNA 双链断裂（DSB）的感应蛋白激酶——共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和 DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-PK）——进行磷酸化。Ku70/80（XRCC6 X射线修复交叉互补蛋白6 / XRCC5 X射线修复交叉互补蛋白5）和 DNA-蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）负责识别 DSB 并保护 DNA 末端，而 Artemis 蛋白则进行末端加工，以促进 XRCC4-连接酶 IV 复合物介导的连接反应。H2AX 在 DSB 侧翼位点的磷酸化可作为信号，招募多种修复蛋白，并传递细胞周期阻滞、死亡或存活的信号8。
分析γ-H2AX焦点的变化是研究目的蛋白是否参与DNA损伤应答的最常用检测方法。若预期目的蛋白在DNA损伤位点发挥直接作用，可采用荧光显微镜检测其与γ-H2AX焦点的共定位。然而，除新型超分辨率荧光技术外，确定与DNA损伤位点的局部相互作用仍具有挑战性。此外，免疫荧光检测通常依赖于DNA损伤位点处大量蛋白分子的存在，因此难以检测丰度较低的蛋白质9。
在此，我们展示了一种利用γ-H2AX作为损伤位点标记物来评估DNA损伤应答（DDR）通路中蛋白质定位的实验方法。该方法可用于表征在不同导致DNA损伤的刺激条件下，蛋白质的时间依赖性定位特征。
邻近连接实验（Proximity Ligand Assay, PLA）作为一种用于评估蛋白质之间相互作用以及细胞器或细胞结构之间空间邻近性的工具，近年来得到广泛应用10,11，例如可用于在应激条件下进行时间分辨的定位和共定位分析。该方法操作简便，类似于传统的免疫荧光技术，可同时对细胞器或细胞结构特异性标志物进行染色，如线粒体、内质网、PML 小体或 DNA 双链断裂标志物 γH2AX。PLA 的应用能够在 DNA 损伤过程中以高灵敏度、高特异性和高可靠性的方式识别蛋白质相互作用，可用于监测细胞周期不同阶段、不同刺激条件下以及基因毒性应激后不同时间点的相互作用动态变化。
本文展示了在依托泊苷诱导DNA损伤后，将PLA与传统的γ-H2AX免疫荧光技术联合使用，以定位Nek4与Ku70之间的相互作用。Nek4属于Nek（NIMA相关激酶）家族成员，其在DNA损伤应答中的作用尚不明确。2012年，Nguyen及其同事发现Nek4可与Ku70/Ku80蛋白相互作用；在缺失Nek4的情况下，这些蛋白无法被招募至DNA损伤位点，且H2AX的磷酸化受到抑制12。然而，该相互作用的细胞内定位至今仍不清楚。我们观察到，在表达Nek4激酶失活突变体的细胞中，Ku70的磷酸化水平降低13，但Nek4是否直接磷酸化Ku70仍有待阐明。鉴于免疫共沉淀研究显示，经依托泊苷处理后Nek4与Ku70的相互作用增强12，我们尝试利用PLA技术结合γ-H2AX标记物来定位这一相互作用。
通常，相互作用研究基于免疫沉淀实验，但这些方法存在 体外 且无法提供相互作用位置的信息。在条件允许时，可对细胞组分（细胞核、线粒体、细胞膜或胞质溶胶）进行免疫沉淀实验，但对相互作用进行时间进程分析则成本较高且操作繁琐。免疫荧光技术可提供蛋白质在细胞内的定位信息，但验证其相互作用较为困难，且依赖于显微镜的分辨率。本文展示了在DNA损伤背景下，利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay）监测两种蛋白质相互作用的优势。
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方案
1. 细胞铺板
注意：细胞可接种于显微荧光载玻片、培养腔或培养板中。建议使用小型盖玻片或96/384孔板以检测多种条件并节省试剂。对于容易脱落的细胞系（如HEK293细胞），建议使用盖玻片。可预先用多聚-L-赖氨酸溶液包被盖玻片以增强细胞贴附。
- 接种细胞时需考虑设置溶剂对照、技术对照和生物对照。每个条件使用两到三个孔作为技术重复。
注意：必须设置技术对照（包括仅二抗和仅一抗的对照）。如有可能，还应包含生物对照（例如，靶蛋白的过表达或敲低，或已知可改变相互作用的条件）。- 在添加了10%胎牛血清（FBS）、4.5 g/L葡萄糖和4 mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养U2OS细胞，使用组织培养处理过的培养板，在37 °C、5% CO2及含90%空气的湿润环境中进行培养。根据待测条件的数量以及是否使用384孔板或60 mm培养皿中的盖玻片，分别从60 mm或100 mm培养皿开始培养。
- 当细胞融合度达到60%–70%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代14。使用血球计数板或自动细胞计数器计数细胞14。将4 × 105个细胞接种至含有多个13 mm圆形盖玻片的60 mm培养皿中，或每孔接种4 × 105个细胞至384孔板中，随后在37 °C、湿润、5% CO2的培养箱中孵育12–24小时。
2. 溶液的配制
注意：处理的浓度和时间是根据文献结果选择的，这些结果表明可激活DNA损伤修复通路15,16。
- 用DMSO配制浓度为50 mM的依托泊苷储备液。储备液可在-20 °C保存数月。将依托泊苷溶液用完全培养基稀释至终浓度为25 µM用于实验。以含0.05% DMSO的完全培养基作为溶剂对照。
- 配制20倍浓度的柠檬酸钠盐水（SSC；3.0 M NaCl，0.30 M 柠檬酸三钠，pH 7.0）。该溶液可在4 °C保存数月。
3. 细胞处理与固定
注意：切勿让细胞在任何时刻干燥；应尽量吸尽前一步的溶液。合适的细胞固定方法（冰冻甲醇或4%多聚甲醛（PFA））以及抗体稀释比例，必须通过常规免疫荧光实验预先确定。
警告：甲醇必须妥善处理。
- 从孔中移除培养基，并分别加入含有 25 µM 依托泊苷或 0.05% DMSO 的培养基。将细胞在 37 °C、5% CO2 及含 90% 空气的湿润环境中孵育，分别处理 3 个不同的时间点：20 分钟、1 小时和 3 小时。若使用 384 孔板，所有处理条件必须同时进行固定。
- 为此，首先从处理时间最长的条件开始，例如 3 小时。在 3 小时处理开始后 2 小时，开始处理 1 小时的条件；当距离固定时间还剩 20 分钟时，开始处理 20 分钟的条件。此后，所有条件可同时进行固定。
- 从孔中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。
- 加入预冷的甲醇，用量需足以覆盖孔底表面，以固定细胞。在 -20 °C 下孵育 10 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。
注意：此时可暂停实验流程。板子可在 4 °C 下保存 1 周。
4. 透化与封闭
注意：如果使用PFA固定方法，在透化之前必须进行甘氨酸封闭步骤。可通过在培养箱内放置一个水盘来制备湿盒，使湿度达到约95%。384孔板或载玻片可置于封闭的塑料容器内，放在滤纸或湿润的海绵及透明薄膜上进行孵育。
- 轻拍样品以去除 PBS。
- 加入 30–40 µL 通透化缓冲液（含 0.2% Triton X-100 的 PBS），室温孵育 20 分钟。用 PBS 洗涤 3 次。
- 轻拍样品以去除 PBS，每孔或每张盖玻片中加入 30–40 µL PLA 试剂盒提供的 1× 封闭液（也可选用含 3% 牛血清白蛋白和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液）。
- 将板置于预热的湿盒中，37 °C 孵育 1 小时。
5. 一抗孵育（PLA）
注意：如果使用盖玻片，必须确保抗体溶液覆盖所有盖玻片表面。需特别注意抗体的选择。所用抗体必须来自不同动物物种，且用于γ-H2AX的二抗不得针对PLA探针制备所用的宿主物种。例如，PLA实验中使用的初级抗体分别由小鼠和山羊产生，而PLA探针（抗小鼠和抗山羊）由驴产生；针对γ-H2AX的抗体由兔产生，所用二抗为驴源抗兔抗体。通过这种方式，二抗不会识别PLA探针。
- 将一抗（小鼠抗Ku70 1:100、山羊抗Nek4 1:50；兔抗Nek5 1:25 和小鼠抗TOPIIβ 1:25）用试剂盒提供的抗体稀释液稀释（也可使用含3%牛血清白蛋白和0.1% Triton X-100的PBS溶液）。若使用盖玻片，每种条件准备30 µL抗体溶液；若使用384孔板，则每孔准备20 µL。
- 轻拍去除封闭液，向各孔中加入一抗溶液。在湿盒中4 °C条件下孵育过夜。
6. PLA 探针孵育
注意：选择探针时，不仅要考虑一抗，还需考虑计划用于免疫荧光步骤的其他抗体。当使用384孔板进行长时间37 °C孵育时，可采用缓慢旋转以改善抗体溶液的分布。
- 将阴性探针和阳性探针用抗体稀释液按1:5比例稀释。若使用384孔板，则每孔准备10 µL；若使用盖玻片，则每个样本准备20 µL。使用以下组合：驴抗小鼠阴性探针与驴抗山羊阳性探针；驴抗小鼠阴性探针与驴抗兔阳性探针。
- 轻拍去除一抗溶液。用TBS-T（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween-20）洗涤1次。在室温下用TBS-T每次5分钟，共洗涤3次。再额外进行一次 用TBS-T的洗涤。
- 轻拍去除液体，加入PLA探针溶液，孔板每孔10 µL，盖玻片每个20 µL。在预热的湿盒中37 °C孵育1小时。
7. 连接
注意：请在即将向样品中添加前再加入连接酶。连接酶必须保存在冷冻冰块中（-20 °C）。在添加连接酶溶液前，务必彻底去除所有洗涤液。避免细胞长时间处于无溶液状态。当使用384孔板进行37 °C孵育时，可采用缓慢旋转以改善抗体溶液的分布。
- 将5倍浓度连接缓冲液用高纯度水稀释。若使用384孔板，每孔准备10 µL；若使用盖玻片，则每孔准备20 µL。
- 吸去PLA探针溶液。用TBS-T洗涤1次，随后再用TBS-T进行3次额外洗涤，每次持续5分钟。在进行下一步操作前，再进行一次最终洗涤，并吸去TBS-T液体。
- 在使用前立即向1倍浓度连接反应液中按1:40比例加入连接酶。置于预热的湿盒中，37 °C孵育 30分钟至1小时。
8. 扩增与洗涤
注意：请在即将加入样本前再添加聚合酶。扩增缓冲液对光敏感；所有含该缓冲液的溶液均需避光保存。聚合酶必须保存在冷冻块中（-20 °C）。避免细胞长时间处于无溶液状态。当使用384孔板在37 °C孵育时，缓慢旋转可改善抗体溶液的分布。
- 加入聚合酶溶液前，务必彻底去除所有洗涤液。避免细胞长时间处于无溶液状态。用高纯度水稀释5倍扩增缓冲液。若使用384孔板，每孔准备10 µL；若使用盖玻片，每孔准备20 µL。
- 轻拍去除连接反应液。用TBS-T缓冲液洗涤1次。随后用TBS-T缓冲液再进行三次洗涤，每次5分钟。下一步操作前，进行最后一次洗涤并轻拍去除TBS-T缓冲液。
- 在即将加入样品前，将聚合酶按1:80比例加入1倍扩增溶液中。置于预热的湿盒中，37 °C孵育100分钟。
注意：从本步骤开始，避免直接暴露于光照下 - 轻拍去除扩增缓冲液。用1x SSC缓冲液洗涤2次，每次10分钟。再用0.01x SSC缓冲液洗涤2次，每次2分钟。
9. γ-H2AX 染色（免疫荧光 - IF）
注意：γ-H2AX 的标记在 PLA 完成后进行。
- 一抗孵育（免疫荧光）
- 将一抗（Rabbit anti yH2AX，1:100 稀释）加入封闭液中（也可使用含 3% 牛血清白蛋白和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液）。若使用盖玻片，每孔加入 30 µL 抗体溶液；若使用 384 孔板，每孔加入 20 µL。
- 吸去 0.01x SSC 溶液，用 PBS 洗涤 2 次。
- 向每孔加入一抗溶液，室温孵育 1 小时。
- 二抗孵育（免疫荧光）
注意：所选二抗不得与 PLA 抗体或探针发生交叉识别。此外，二抗的激发波长必须与 PLA 检测试剂的波长不同。例如：我们的 PLA 检测试剂含有荧光染料 647，而用于 γ-H2AX 检测的二抗为 488。- 将二抗（Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488）以 1:300 稀释比例加入封闭液中（也可使用含 3% 牛血清白蛋白和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液）。若使用盖玻片，每种条件准备 30 µL 抗体溶液；若使用 384 孔板，每孔加入 20 µL。同时加入 Hoechst 33342 染料，使其终浓度为 0.6 µg/mL。
- 吸去一抗溶液，用 TBS-T 洗涤 3 次。
- 向每孔加入二抗溶液，室温孵育 20 分钟。
- 用 TBS-T 洗涤 5 次，再用 1x SSC 缓冲液洗涤 2 次，最后用 0.01x SSC 缓冲液洗涤 2 次。
注意：此时，板可在 4 °C 避光保存数周（置于 0.01x SSC 中）。若使用盖玻片，可将样品封片，一天后转移至 -20 °C 保存。
10. 图像采集
- 使用常规荧光显微镜和63倍物镜。通过比较阴性对照和阳性对照来确定曝光时间，以避免信号饱和和PLA信号点重叠。
注意：使用共聚焦显微镜可增强PLA信号点的检测效果。也可使用20倍物镜以增加检测到的细胞核数量。 - 在确定曝光时间后，所有PLA信号点的图像采集均应使用相同的参数。尽量从不同孔或盖玻片区域采集图像，以避免因孵育不均匀而产生的假象。
- 所有通道的图像应采用相同的命名方式保存。若显微镜对各通道分别拍照，则对应图像应使用相同文件名，仅在文件名开头添加“PLA”或“Nucleus”以区分通道。
11. 图像分析
注意：A 为在 Image J/FIJI 中分析每个细胞核的点数而创建了宏17 并用于需手动添加比例尺信息的显微镜图像。必须已知所用物镜的像素大小。将各通道的图像分别放置在不同的文件夹中（补充代码文件 1，补充图 1).
注意：该宏程序考虑的是分别获取的荧光通道。在此情况下，务必确保所有图像均以相同的名称保存。
- 该宏允许在视野中选择特定区域。使用该选项 选择一个感兴趣区域 当图像中的某个区域出现可能对分析产生不利影响的伪影时，应在分析开始时选择感兴趣区域（ROI），并将其用于所有图像。
注意：此为可选功能。若未选择，分析将包含整个图像补充图2). - ROI 文件应在使用宏之前创建，具体方法如下所述。进行 ROI 选择时，使用矩形工具选中待分析区域，然后点击将其添加到 ROI 管理器中 编辑 > 选择> 添加到管理器. 单击以保存感兴趣区域 更多> 保存.
- 在 ImageJ 中 17，打开不同条件下的图像以调整分析参数。这些参数必须由用户确定，并连同数据一并指定在宏程序中。补充编码文件 1)
- 背景校正：为去除背景，请单击 过程> 减去背景. 使用预览功能测试不同的滚动球半径。我们对 PLA 点使用了半径为 10 的滚动球，对细胞核使用了半径为 100 的滚动球。
- 通过点击去除噪声 过程 > 噪声 > 去斑对于细胞核，点击“smooth”功能以改善细胞核的填充效果 过程>平滑.
- 调整阈值：转换为8位图像并调整阈值 通过点击 图像 > 类型 > 8 位与图像 > 调节 >阈值根据图像中所有细胞核或点状结构的显示情况相应调整阈值，避免过度饱和及结构重叠。记录所用阈值参数，并在不同图像中进行测试，以确认该阈值适用于多幅图像。
- 转换为蒙版 通过点击 过程 > 二元的 > 转换为蒙版. 在细胞核的情况下, 点击 过程 > 二元的 > 填补孔洞 随后 过程 > 二元的 > 流域对于PLA点，请单击 过程 > 二元的 > 分水岭.
- 为计数细胞核，需测量不同细胞核的面积或长度，以估算其平均大小。使用近似值分析颗粒。点击 分析 > 分析颗粒, 然后选择 设置大小：15-无穷大 （这些数值取决于细胞核的大小）。勾选以下选项：显示：掩膜；显示结果；清除结果；汇总；添加到管理器；排除边缘。
- 为计数PLA信号点，需测量点状信号的面积或半径，以估算其平均大小。 选择 应用细胞核掩膜 （应用掩膜是 GDSC 插件中的一个功能，请检查该插件是否已安装）随后 分析 > 分析颗粒 并设置 0.02-3（这些数值取决于细胞核的大小）。勾选以下选项：显示：掩膜；显示结果；清除结果；汇总；添加至管理器；排除边缘。
- 结果显示图像中每个细胞核的核内斑点数量。请保存此数据。
12. 观察融合图像
- 打开与PLA、细胞核和γ-H2AX对应的通道。对所有图像按照步骤11.4.1和11.4.2所述进行背景扣除和去噪处理。
- 使用同一通道中所有条件下相同数值，自动或手动调整亮度和对比度。 选择 图像 > 调节 > 明场/对比度.
- 合并图像（融合）通过选择 图像 > 颜色 > 合并通道. 通过选择添加比例尺 分析 > 工具 > 比例尺保存为.TIFF 文件。
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结果
在未进行依托泊苷处理的情况下，我们观察到了Nek4与Ku70之间的相互作用。然而，这种相互作用可能发生在细胞核外（图1A）。DNA损伤后，Nek4与Ku70的相互作用增强，并集中在细胞核内（图1A）。在本实验中，以文献结果18为依据，将Nek5与拓扑异构酶IIβ（TOPIIβ）的相互作用作为阳性对照，结果显示，依托泊苷处理显著增强了Nek5与TOPIIβ的相互作用（图1B）。
依托泊苷处理使焦点数量增加了近40%（对照组细胞中平均每个细胞核9个焦点，而依托泊苷处理组细胞中每个细胞核有12至14个焦点）。Nek4与Ku70的相互作用并非仅存在于DNA损伤条件下。事实上，Nguyen等12研究表明，这些蛋白在无细胞损伤的情况下也可发生相互作用，且该相互作用不依赖于DNA，意味着这种相互作用并非总是发生在DNA损伤位...
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讨论
数据表明，在DNA损伤应答谱型分析中，同时使用PLA与DNA损伤标志物可提供最丰富的信息，揭示损伤后相互作用在时空上的动态行为。PLA是一种多功能方法，已被用于二聚体鉴定、细胞器接触确定、蛋白质-核酸相互作用以及主要是蛋白质-蛋白质相互作用的研究10,11,19,20。 实施PLA的关键步骤包括确定并验证一抗、细胞接种密度、洗涤条件以及孵育温度。我们认为，将该技术与传统的免疫荧光方法联合使用，有助于明确相互作用发生的区域、时间和分布特征。
必须使用适当的技术对照，并强烈建议使用生物学对照。此外，对所有条件采用相同参数进行分析，可实现样本间的比较。
尽管 PLA 是一种简单的检测方法，无需特殊设备，但其商用试剂仍然略显昂贵，因此该技术适用于确证性实验，或在文献中已发...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢圣保罗州研究支持基金会（FAPESP，通过项目号2022/15126-9对JK的专题资助以及对LARM的奖学金资助21/09439-1）和国家科学技术发展委员会（CNPq）对本研究的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黑色384孔板 | Perkin Elmer Cell Carrier 板 | ||
| 驴 抗兔 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:300 |
| Duo link 驴抗小鼠 Minus | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink 抗体稀释液 | Sigma | DUO82008 | |
| Duolink 封闭液 1X | Sigma | DUO82007 | |
| Duolink 远红检测试剂 | Sigma | DUO92013 | |
| Duolink 驴抗山羊 Plus | Sigma | DUO92003 | |
| Duolink 驴抗兔 plus | Sigma | DUO92002 | |
| 依托泊苷 | Sigma | E1383 | |
| 山羊抗 Nek4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5517 | 山羊抗Nek4以1:50稀释比例使用 |
| Hoechst 33342 | 赛默飞世尔科技 | H1399 | 0.6 µg/mL |
| Leica DMI 显微镜 | Leica | ||
| 小鼠抗 Ku70 | 赛默飞世尔科技 | MA5-13110 | 小鼠抗 Ku70 抗体以 1:100 稀释比例使用 |
| 小鼠抗 TOPII 抗体β | Santa Cruz Biotechnology | SC-365071 | 1:25 |
| 兔抗 Nek5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-84527 | 1:25 |
| 兔抗 Y H2AX | 细胞信号传导 | 9718S | 1:100 稀释 |
| U2OS细胞系 | ATCC | HTB-96 |
参考文献
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