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方法文章

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

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DOI：

10.3791/67079

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2024年11月22日

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。

摘要

一种通过颠覆药物作用效果的机制 疟原虫通过重编程其转录组实现这一效应。对于属于多基因家族的靶基因，该效应更为显著。 恶性疟原虫 属于CDPK家族的蛋白激酶对疟原虫血液阶段的发育至关重要，因此CDPK被认为是开发抗疟化合物的理想靶点。化学遗传学方法在历史上已被用于阐明高等真核生物中蛋白激酶的功能。该方法需要通过遗传操作将“看门人”残基替换为具有不同侧链的另一种氨基酸。看门人位点的氨基酸替换可调节蛋白激酶的活性，并改变其对一类称为“碰撞激酶抑制剂”（bumped kinase inhibitors, BKIs）的化合物的敏感性，从而有助于目标基因的功能鉴定。在此，我们利用化学遗传学方法研究了携带CDPK基因功能低下等位基因的突变寄生虫所演化出的补偿机制。 cdpk1总体而言，我们的方法有助于识别可能被同时靶向的代偿通路，以防止针对单个激酶的药物耐药性产生。

引言

疟疾是最主要的传染病之一，每年导致数百万人死亡，尤其在5岁以下儿童中尤为严重1。目前尚无临床可用的疟疾疫苗。此外，最致命的人类疟原虫——恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）已对一线药物青蒿素产生耐药性2,3,4,5。迫切需要鉴定新的药物靶点和可快速部署的新型策略，以防止青蒿素耐药性在全球范围内传播。深入了解药物作用机制及补偿通路的分子基础，有助于制定更有效的策略，防止耐药性的产生。

属于钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）家族的蛋白激酶在疟原虫的红细胞内期、有性期和红细胞前期发育的多个阶段均发挥关键作用6。在P. falciparum无性复制过程中，CDPK5在裂殖体成熟后裂殖子释放过程中起着至关重要的作用7。条件性敲除CDPK5会导致裂殖体无法将裂殖子释放入血液，从而导致寄生虫死亡。CDPK5介导的寄生虫逸出分子机制尚未完全阐明，目前认为可能涉及蛋白激酶G（PKG）作为其上游调控因子7,8。CDPK7对环状体阶段寄生虫向滋养体阶段的成熟至关重要9。CDPK4是CDPK家族中另一成员，对疟原虫在蚊体内的有性阶段发育至关重要，参与配子形成过程中的多个步骤，因此对游离、可动的雄性配子的形成具有关键作用10,11,12,13。CDPK1可磷酸化内膜复合物和棒状体的组分14,15。此外，条件性敲除CDPK1会导致参与红细胞侵入的蛋白发生低磷酸化16。研究表明CDPK1可调控侵入过程中顶质体细胞器的释放17。CDPK1还通过磷酸化SERA5蛋白酶协助裂殖子从感染的红细胞中逸出18。磷酸化的CDPK1优先定位于裂殖子的顶端，在此可能与侵入过程所需的其他寄生虫蛋白相互作用19,20。CDPK1还参与雄性和雌性配子的形成，这是疟疾传播及疟原虫在蚊体内进行有性发育的关键步骤21。

化学遗传学方法历史上已被用于鉴定哺乳动物激酶的功能作用22,23。该方法利用在“守门残基”（gatekeeper position）位点用具有不同侧链的氨基酸取代原有残基。守门残基的改变会调节相邻ATP结合口袋的大小，从而改变一类称为“空间位阻激酶抑制剂”（bumped kinase inhibitors, BKIs）的化合物对突变酶的可及性，相较于野生型酶有所不同。将守门位点的大体积残基替换为较小的残基可使BKIs得以进入并结合，而反向替换则使激酶对BKIs产生抗性。在某些情况下，守门残基的替换会导致目标激酶活性下降，从而使该修饰不适用于功能研究24,25。这种守门残基替换对酶活性的负面影响可通过在不耐受的激酶中引入第二位点的抑制性突变来逆转25。化学遗传学方法已被应用于研究顶复门原虫蛋白激酶的功能。含有较小守门残基的野生型CDPK4可被空间位阻激酶抑制剂BKI-1和1294选择性抑制，从而阻断雄性配子形成和卵囊发育11,12。将CDPK4中较小的守门残基替换为体积较大的甲硫氨酸残基后，在鞭毛体出芽（exflagellation）过程中BKIs介导的抑制作用显著降低11。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的CDPK1是一种与疟原虫亲缘关系密切的顶复门寄生虫蛋白激酶，已被证明参与速殖子对宿主细胞的运动和侵袭过程26,27。研究人员利用野生型TgCDPK1较小的守门口袋结构设计出特异性抑制剂，可在动物模型中减轻疾病致病性28,29。通过使用特异性药理学抑制剂抑制恶性疟原虫（P. falciparum）蛋白激酶G（PKG）的活性，已证实其参与裂殖体晚期发育及配子形成过程30,31。将守门位点的苏氨酸替换为谷氨酰胺（T618Q）后，突变酶对抑制剂的敏感性显著降低，导致配子发生和裂殖子向环状体转化过程恢复正常30,31。

以往大多数研究均采用化学遗传学方法对靶标激酶进行功能表征11,12,22,23,26,30,31，然而，我们采用该方法旨在理解携带蛋白激酶功能低下等位基因的寄生虫中补偿机制的形成过程。我们先前的研究表明，将CDPK1中的野生型“守门残基”替换为甲硫氨酸（T145M）会导致该突变酶的转磷酸化能力下降约47%32。携带cdpk1功能低下等位基因（cdpk1t145m）的突变寄生虫通过其他CDPK家族成员的转录重编程，已预先适应CDPK1活性的降低。我们认为，该策略可普遍用于阐明携带必需蛋白激酶功能低下等位基因的突变寄生虫中的补偿机制。在抑制靶标激酶的同时，可联合抑制其他部分补偿靶标激酶功能的激酶，以防止针对单个激酶的药物耐药性产生。这可能为疟疾防控提供更有效的策略。

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方案

恶性疟原虫（P. falciparum）NF54 菌株由 Alvaro Molina Cruz 提供21,32,33。用于寄生虫培养的 O+ 型人红细胞来自印度新德里的旋转血液中心（Rotary Blood Centre）。质粒 pL6eGFP 和 pUF1 由 Jose-Juan Lopez-Rubio 提供。DSM267 由 Margaret A. Phillips 和 Pradipsinh K. Rathod 提供。WR99210 由 Jacobus 制药公司（Jacobus Pharmaceutical Company）提供。

1. 重组CDPK1表达质粒的构建 大肠杆菌

  1. 使用引物分析软件设计寡核苷酸引物对，以扩增cdpk1基因的完整编码序列（CDS）（PlasmoDB编号：PF3D7_0217500）。
    1. 使用DNA聚合酶及特异性寡核苷酸引物对Pk1fpgex和Pk1rpgex（见表1），以恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）cDNA为模板，在20 µL反应体系中扩增完整CDS。PCR扩增条件设置如下：98 °C预变性2 min，然后进行36个循环（98 °C变性30 s，52 °C退火20 s，62 °C延伸20 s），最后62 °C延伸10 min。PCR产物于4 °C保存备用。
  2. 在30 µL总反应体系中，用BamHI（20,000 U/mL）和NotI（20,000 U/mL）限制性内切酶在37 °C下对1 µg扩增的PCR产物和1 µg pGEX4T1表达质粒进行双酶切，反应时间3–4小时。
  3. 使用基于柱的PCR产物纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化双酶切后的PCR产物和质粒。
  4. 将100 ng双酶切并纯化的pGEX4T1质粒与插入片段按1:5的载体与插入片段摩尔比混合，加入1 µL T4 DNA连接酶，总体积为10 µL，进行连接反应。于16 °C过夜孵育。
  5. 按照制造商说明书，将连接产物转化至大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞，并涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上。
  6. 从转化获得的菌落中筛选四个克隆，使用小型质粒提取试剂盒按照说明书提取质粒DNA，检测重组质粒的存在。通过BamHI和NotI双酶切验证重组质粒，方法同步骤1.3所述。
  7. 对酶切鉴定为阳性的克隆进一步进行Sanger测序，确认序列正确。将测序验证正确的CDPK1质粒构建体转化至E. coli BLR(DE3) pLysS感受态细胞，用于CDPK1蛋白的表达。

2. 重组CDPK1蛋白的表达与纯化 E. coli

  1. 重组CDPK1的表达
    1. 接种单个克隆 E. coli 将含有经序列验证的质粒构建体的BLR(DE3) pLysS菌株接种于10 mL含有氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB培养基中。在37 °C、200-250 rpm振荡条件下培养过夜。
    2. 将初级培养物按1%的接种量接种至二级培养物中，在37 °C条件下培养细菌细胞至对数生长中期。当二级培养物在600 nm处的光密度（OD）达到0.7–0.9时， 诱导全长重组蛋白的表达 CDPK1 通过加入1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，在24 °C下孵育10–12小时。
    3. 孵育结束后，收集 E. coli 5,000 × g 离心 10 分钟收集细胞。倾去上清液，保留细胞沉淀。
    4. 配制裂解缓冲液，其成分为：1 mM 二硫苏糖醇（DTT）、0.1 mg/mL 溶菌酶、1 mM EDTA、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）以及 1x 蛋白酶抑制剂混合物，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    5. 将细胞沉淀重悬于体积为沉淀重量10倍的裂解缓冲液中。将细胞悬液进行超声处理，总时长15分钟，超声程序设置为工作9秒、间歇15秒，以防止局部过热导致蛋白质变性。
    6. 将裂解液在17,000 x g条件下离心 g 孵育1小时，将澄清上清液与谷胱甘肽珠在4 °C下过夜孵育。按照下述方案获得纯化的重组CDPK1蛋白。
  2. 使用谷胱甘肽珠进行亲和层析纯化GST标签CDPK1
    1. 取500 µL充分重悬的谷胱甘肽琼脂糖珠用于250 mL细菌培养物，于500 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。小心弃去上清液。
    2. 用 5 mL 结合缓冲液（140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.3）并颠倒混匀。
    3. 以 500 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。重复洗涤和离心3至4次。
    4. 将珠子加入细菌细胞裂解液中，4 °C 条件下轻微振荡（20-30 rpm）孵育 12 小时。
    5. 以 500 x g 离心 g 4 °C 下离心 5 分钟，弃去上清液。可保留上清液用于估算未结合的重组 CDPK1 含量。
    6. 用含1 mM DTT的PBS缓冲液至少洗涤CDPK1结合的珠子5-6次，随后用50 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM DTT、pH 7.5的缓冲液洗涤一次。
    7. 用洗脱缓冲液1（EB1）洗脱结合的蛋白2次，每次250 µL，随后用洗脱缓冲液2（EB2）再洗脱2次，每次250 µL。EB1和EB2的组成为：50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.5，含10 mM还原型谷胱甘肽 50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.5 缓冲液中分别含有 20 mM 还原型谷胱甘肽。
    8. 将结合CDPK1的磁珠在洗脱缓冲液1和2中于室温（RT）孵育5-10分钟，期间轻柔振荡或翻转混匀。
    9. 以 500 x g 离心 g 在4 °C下离心5分钟，小心地将含有洗脱的CDPK1重组蛋白的上清液转移至另一离心管中。
    10. 重复步骤 2.2.8 和 2.2.9，分别用 EB1 和 EB2 各获得 2 份洗脱液。

3. 位点定向诱变法生成重组CDPK1看门人突变蛋白

  1. 使用含有序列已验证的 cdpk1 基因的 pGEX4T1 质粒。我们建议使用与转化 E. coli BLR(DE3) pLysS 菌株时相同的质粒。
  2. 设计引物以在野生型 cdpk1 基因序列中引入看门人突变。野生型看门人残基（T145）在 cdpk1 基因中由 ACC 密码子编码。将苏氨酸看门人残基替换为较小的（丝氨酸，T145S）和较大的（甲硫氨酸，T145M）看门人残基，分别由 AGC 和 ATG 密码子编码。
  3. 按照以下指南设计用于定点突变的正向和反向引物。
    1. 确保两条引物彼此互补。在突变位点两侧各保留 15–20 个核苷酸的未修饰序列。确保除突变位点外，引物序列的 Tm 值在 50 °C 至 55 °C 之间。
  4. 使用定点突变试剂盒生成 cdpk1 的看门人突变体构建体。按照制造商说明引入目标突变。用于定点突变的引物列于 表 1 中。
  5. 在反应体系中加入 0.5 µL DpnI（20,000 U/mL）酶，以消化亲本的甲基化质粒。将反应体系在 37 °C 下孵育 3 小时。用经 DpnI 处理的反应产物转化 E. coli DH5α 感受态细胞。
  6. 分别筛选 T145M 和 T145S 质粒构建体的四个克隆，通过 DNA 测序验证 cdpk1 基因序列中是否成功引入目标突变。
  7. 将序列已验证的质粒转化至 E. coli BLR(DE3) pLysS 菌株中，用于表达重组 CDPK1 T145M/S 蛋白，操作步骤如步骤 1.5 所述。
  8. 按照第 2 节中所述野生型 CDPK1 蛋白的表达与纯化步骤，对 CDPK1 看门人突变体蛋白进行表达与纯化。

4. 体外 CDPK1 激酶活性检测

注意：重组型野生型 CDPK1 及看门人突变体蛋白的激酶活性通过半合成表位标记方法进行评估，该方法由 Allen 等人所述34。

  1. 在总体积为 50 µL 的反应体系中，将 50 ng 重组蛋白与含有 50 mM Tris、50 mM MgCl2 和 1× 磷酸酶抑制剂混合液的缓冲液混合，并加入 2 µg 髓鞘碱性蛋白（MBP）作为 CDPK1 的外源性底物，进行孵育。
  2. 根据实验条件需要，分别添加 CaCl2 或 EGTA，使激酶反应缓冲液中终浓度均为 2.5 mM。向缓冲液中加入 ATPγS，使其终浓度为 100 µM，作为可转移的末端磷酸基团的供体。
  3. 将反应体系在 30 °C 水浴中孵育 1 小时，随后加入 5 mM EGTA 终止反应。向反应混合物中加入 5 µL 50 mM 对硝基苄基磺酸酯（PNBM），并在 20 °C 水浴中继续孵育 2 小时，以实现 MBP 的转磷酸化位点及 CDPK1 自身磷酸化位点上的丝氨酸和苏氨酸残基的烷基化。
  4. 向总体积为 55 µL 的反应混合物中加入 19 µL 4× SDS 上样缓冲液，在 95 °C 加热 5 分钟。

5. 蛋白质印迹分析检测 体外激酶反应中的硫代磷酸化产物

  1. 制备12% SDS-PAGE凝胶，每份样品上样15 µL。通过电泳分离反应混合物，以观察自磷酸化的CDPK1和转磷酸化的MBP。
  2. 采用湿转法将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF膜上32。
  3. 用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl）配制5%脱脂牛奶溶液，将PVDF膜在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。
  4. 将PVDF膜在封闭缓冲液中与兔源抗烷基化硫代磷酸化加合物的一抗按1:2,500稀释比例在4 °C孵育过夜。
  5. 过夜孵育后，用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水洗涤印迹膜3次，每次10分钟。
  6. 将印迹膜在封闭缓冲液中与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗按1:5,000稀释比例在室温孵育1小时，随后用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水进行洗涤。
  7. 根据生产商说明书，将等体积的溶液A与溶液B混合后覆盖印迹膜，置于暗室中曝光X射线胶片，以获得CDPK1自磷酸化和MBP转磷酸化的信号。

6. 针对引入看门人取代的  cdpk1 位点的引导序列克隆

注意：通过以下步骤，在 BtgZI 位点将经人工筛选的 20 个核苷酸长的引导序列克隆至 pL6eGFP 质粒中。

  1. 使用 BtgZI 酶消化 pL6eGFP
    1. 在 20 µL 反应体系中，按照酶生产商提供的反应条件，加入 1 µg pL6eGFP 质粒35 和 1 µL BtgZI 酶（5,000 单位/mL），于 60 °C 孵育 4 小时进行消化。
    2. 4 小时孵育结束后，将消化后的质粒在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，切下含有消化后质粒的凝胶条带（约 9.8 kb）。使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒，按照生产商说明书纯化消化后的质粒。
  2. 寡核苷酸退火
    1. 用无 DNase/RNase 的水溶解寡核苷酸（Ck1GUIDEFWD 和 Ck1GUIDEREV），配制 100 µM 的储存液。
    2. 将每种寡核苷酸各取 20 µM，加入含 10 mM Tris（pH 8.0）、50 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的溶液中。将混合物置于干浴仪中 95 °C 孵育 5 分钟，随后自然冷却至室温。反应混合物通常需要 1 小时达到室温。
    3. 用 Tris（pH 8.0）将退火后的寡核苷酸稀释至 0.5 µM，最终反应体系体积为 100 µL。
  3. In-Fusion 反应
    1. 在总体积为 10 µL 的反应体系中，将 1.5 µL 稀释后的寡核苷酸与 100 ng 经 BtgZI 消化线性化的质粒加入 5× In-Fusion 酶预混液中，构建含有 CDPK1 向导序列的 pL6CK1G 质粒。
    2. 于 50 °C 孵育反应 15 分钟。随后将反应体系置于 4 °C 保存，待进行 E. coli 转化。
      注意：如需长期保存，可将反应混合物置于 -20 °C 保存。
  4. 转化 E. coli Stellar 感受态细胞
    1. 取 2.5 µL 反应混合物加入 E. coli Stellar 感受态细胞中，按照生产商说明书进行转化操作。
    2. 将转化后的感受态细胞涂布于 LB 氨苄青霉素（100 µg/mL）平板，于 37 °C 过夜培养，使转化后的细菌生长。
    3. 挑取转化后的单菌落，使用 commercially available 质粒小提试剂盒提取质粒，按照生产商说明书进行质粒纯化。通过 Sanger DNA 测序验证向导序列是否正确插入质粒中。

7. 克隆同源臂以修复Cas9核酸酶限制的 cdpk1 位点

注意：包含拟引入目标位点的单核苷酸多态性（SNP）的同源臂可由商业途径合成。我们通常采用长度为 400–1000 bp 的同源臂。该同源臂在向导 RNA 区域及 PAM 序列中包含同义突变，以防止在引入目标 SNP 后基因组位点被再次切割。该同源臂（对应于 CDPK1 的第 133 至 553 位核苷酸）引入了甲硫氨酸（Met）或丝氨酸（Ser）看门残基突变以及同义突变，并在其两侧设置 AflII 和 SpeI 限制性酶切位点。

  1. 在20 µL反应体系中，使用AflII（20,000 U/ml）和SpeI（20,000 U/ml）限制性内切酶各0.5 µL，于37 °C条件下对1 µg pL6CK1G质粒和含有同源臂的质粒进行双酶切消化，反应时间为4小时。
  2. 将双酶切完成的质粒反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，使用胶回收试剂盒按照制造商说明书回收对应于同源臂和pL6CK1质粒骨架的条带。
  3. 将酶切后的同源臂与100 ng pL6CK1质粒进行连接，插入片段与载体的比例为1:5，总反应体积为10 µL，使用T4 DNA连接酶进行连接反应，并在16 °C下过夜孵育。按照制造商说明书，将完整的连接反应混合物转化至大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞中。
  4. 将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上，以筛选阳性转化子。从LB氨苄青霉素平板上挑取单克隆菌落，并使用质粒提取试剂盒纯化质粒。
  5. 通过AflII和SpeI酶切（酶切条件同步骤7.3所述）对纯化的质粒进行鉴定，确认克隆中含有同源臂。进一步通过Sanger DNA测序验证双酶切阳性克隆，以确认同源臂的完整序列。

8. 疟原虫转染用 pL6CK1Met、pL6CK1Ser 和 pUF1 质粒的纯化

  1. 取5 mL含有氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB培养基中的序列验证克隆pL6CK1Met、pL6CK1Ser和pUF1的初级培养物，培养10小时。按1:1000的比例将初级培养物转接至次级培养，继续培养12小时。
  2. 将细菌培养物在离心瓶中以5000 × g 离心10分钟，收集菌体沉淀。
  3. 根据试剂盒生产商的说明书，使用质粒提取试剂盒分离质粒。将质粒DNA溶解于无DNase/RNase的水中，用于寄生虫的直接转染。

9. 体外培养Plasmodium falciparum及用于转染的山梨醇同步化

注意： P. 恶性疟原虫体外培养 在人红细胞（RBCs）中的培养按照Trager和Jensen所述方法进行36.

  1. 传代NF54株 P. falciparum 通过在O中培养+ 在含有RPMI 1640的完全RPMI（cRPMI）培养基中，将人红细胞调整至2% hematocrit，该培养基添加有L-谷氨酰胺、25 mM HEPES、25 mM 碳酸氢钠和50 µg/mL 次黄嘌呤。培养基中另补充0.5% AlbuMAX II和10 µg/mL 庆大霉素，并在37 °C、5% O₂2，5% CO2，以及90% N2.
  2. 为了通过山梨醇同步法获得环状体阶段的疟原虫，将不同步的疟原虫在50 mL锥形管中以2,300 x g离心收集沉淀。 g 室温下离心3分钟。弃去上清液。
  3. 将感染的红细胞与9倍体积的5%山梨醇在37 °C孵育10分钟。孵育结束后，以2,300 x g离心收集红细胞沉淀。 g 3 分钟后弃去山梨醇。
  4. 用不含血清的RPMI培养基洗涤经山梨醇处理的寄生虫， iRPMI（不含白蛋白和碳酸氢钠的RPMI培养基）中重悬，随后在cRPMI中孵育。在下一个周期中使用环状阶段的寄生虫进行质粒转染。

10. 使用 pL6CK1Met、pL6CK1Ser 和 pUF1 质粒转染环状期寄生虫

注意：以下步骤用于环状体阶段寄生虫的质粒DNA直接转染。

  1. 通过将以下成分溶解于30 mL水中来配制2x细胞电穿孔缓冲液37：240 mM KCl、0.3 mM CaCl2、4 mM EGTA、10 mM MgCl2、20 mM K2HPO4/KH2PO4和50 mM HEPES。调节pH至7.6。加水定容至50 mL。使用0.22 µm注射器滤器过滤除菌。然后用无菌水将2x细胞电穿孔缓冲液稀释，得到1x细胞电穿孔缓冲液。
  2. 在无菌的15 mL圆锥形离心管中，加入100 µL压积的环状体阶段感染红细胞，并用5 mL 1x细胞电穿孔缓冲液洗涤2次。在室温下以994 × g离心3分钟完成洗涤。
  3. 洗涤后，弃去上清液，向压积的感染红细胞中加入每种质粒各50 µg（构建T145M突变使用pL6CK1Met/pUF1，构建T145S突变使用pL6CK1Ser/pUF1）。然后根据质粒体积加入相应量的2x缓冲液，并用1x缓冲液补足总体积至400 µL。
  4. 将上述溶液400 µL转移至0.2 cm比色杯中进行每次转染。电穿孔条件如下：0.31 kV、950 µF，电阻设为无限大。
  5. 电穿孔后，将转染的寄生虫从比色杯中取出，混入cRPMI培养基，转移至T25培养瓶中，总体积为15 mL。在步骤9.1所述条件下孵育寄生虫2小时。
  6. 孵育后，将转染的寄生虫转移至50 mL圆锥形离心管中，在994 × g离心3分钟。弃去上清液，用10 mL不完全RPMI洗涤寄生虫。在新鲜cRPMI中培养2天，并在24小时后更换培养基。
  7. 48小时后，从每个培养瓶中移除cRPMI，将培养物重悬于含有2 nM WR99210和150 nM DSM26738的cRPMI中。然后通过加入400 µL新鲜红细胞将培养物转移至T75培养瓶中。连续7天每天补充含WR99210和DSM267的cRPMI培养基。此后每隔一天添加含两种药物的cRPMI，直至转染后第14天。
  8. 第14天，取200 µL转染培养物分装至1.5 mL微量离心管（MCT）中用于制片。在室温下以500 × g离心5分钟沉淀细胞。吸除上清液，将细胞转移至载玻片上。用另一张载玻片以45°角推片制备血涂片。
  9. 用甲醇固定载玻片，并用超纯水按1:10比例稀释吉姆萨染液。将载玻片完全浸入吉姆萨染液中染色20分钟。在流动水下冲洗载玻片并彻底干燥。然后滴加镜油，在光学显微镜下以100倍物镜观察。
  10. 一旦观察到寄生虫，开始每日更换培养基，使其继续生长2–3天。随后收集寄生虫，以验证目标基因序列在靶位点的预期修饰。
    注意：若第14天未观察到寄生虫，则每4天补充一次含两种药物的培养基。每隔7天将寄生虫稀释30%，并添加新鲜血液以维持2%的血细胞比容，直至寄生虫重新出现。

11. 利用PCR验证具有cdpk1 位点预期修饰的转基因寄生虫

  1. 在寄生虫培养 2-3 天后，取出 500 µL 培养物，转移至 1.5 mL 微量离心管（MCT）中。
  2. 以 2,400 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。随后通过皂苷处理裂解红细胞。
    1. 进行皂苷处理时，向 1 mL 重悬的寄生虫沉淀中加入 10 µL 10% 皂苷溶液，4 °C 孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 2,400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤，直至红色完全消失，获得黑色的寄生虫沉淀。
  3. 用 1 mL 1× PBS 洗涤寄生虫沉淀，以 2,400 × g 离心 5 分钟。随后将沉淀重悬于 50 µL 无 DNase/RNase 的水中。将重悬的寄生虫沉淀在 95 °C 加热 5 分钟，然后在 4 °C 下以 16,200 × g 离心 10 分钟。将含有寄生虫 DNA 的上清液转移至新的离心管中。
  4. 利用上述提取的遗传物质，使用引物对 ck1f1 和 ck1r3wt（见表 1）通过 PCR 扩增全长基因，特异性扩增步骤 1.2 中所述同源臂外侧的区域。使用 ck1f1 引物对包含 T145M 突变的同源区域进行测序。

12. 获得克隆转基因寄生虫的有限稀释法

  1. 序列验证后，将转染的寄生虫培养物稀释至最终浓度为每 200 µL 含 1 个寄生虫。然后，向 96 孔组织培养板的各孔中加入 100 µL 稀释后的培养物。执行以下步骤（12.2–12.4）以达到每 200 µL 含 1 个寄生虫。
  2. 准备 10 mL 感染红细胞（RBC），红细胞压积为 2%。使用上述吉姆萨染色法估算培养物的寄生率。然后，使用血细胞计数板对 1:100 稀释的培养物进行总红细胞数计数。
    每毫升红细胞总数 = 平均计数红细胞数 × 稀释倍数 × 104
    每毫升感染红细胞数 = （寄生率 × 每毫升红细胞总数）/100
  3. 通过将初始培养物连续两次稀释（每次 1:100），制备感染红细胞的 1:10,000 稀释液。
  4. 从稀释后的培养物中取适当体积（以微升计），使 10 mL 培养基中含有总计 50 个寄生虫，并确保红细胞压积为 2%。然后，将含 50 个寄生虫的培养基 100 µL 加入 96 孔板的每一孔中。将培养板置于密闭干燥器中，通入混合气体（气体组成同第 9.1 步所述），并在 37 °C 下孵育。每隔 2 天更换一次培养基。
  5. 每隔 7天用含 2% 红细胞压积的 cRPMI 培养基更换一次，直至观察到寄生虫出现。
    1. 将 96 孔板倾斜至 45° 角，使红细胞沉降。使用移液管小心吸出各孔中的培养基，并观察含寄生虫孔中培养基颜色由粉红色变为黄色的现象，该颜色变化源于寄生虫对培养基的酸化作用。
  6. 观察到颜色变化后，从变色孔中取出少量培养物，在载玻片上制备涂片，并标记与孔位相对应的编号。按上述方法用吉姆萨染液染色，并在显微镜下观察。
  7. 将显微镜下确认含有寄生虫的孔内培养物转移至 T25 培养瓶中。让寄生虫在 T25 培养瓶中生长 4–5 天，并每隔一天补充新鲜培养基。
  8. 当寄生率达到 2–3% 时，提取 500 µL 寄生虫培养物。随后用皂苷裂解红细胞，并按照第 11 节所述方法提取寄生虫遗传物质。
  9. 为确认已获得克隆型转基因寄生虫，按步骤 1.1.1 所述设置 PCR 反应，并将 PCR 产物送交 DNA 测序，以确认目标位点已成功引入预期的单核苷酸多态性（SNP）。

13. 使用实时 PCR 进行转录本分析

  1. 裂殖体阶段寄生虫的Percoll/甘露醇纯化与同步化
    1. 制备Percoll/甘露醇梯度39,40：在15 mL锥形管中依次加入3 mL 70%和3 mL 40%的Percoll/甘露醇溶液。
    2. 将含有主要处于裂殖体阶段的野生型（WT）和CDPK1 T145M突变型寄生虫的1–2 mL培养物，轻柔地铺加在梯度上层。
    3. 使用水平转子离心机，在室温下以2,300 × g离心15分钟，离心机减速设置为4。
    4. 从梯度界面处收集含有滋养体和裂殖体阶段寄生虫的中间环层，并转移至新的50 mL锥形管中。
    5. 加入等体积的9:1（cRPMI:10×PBS）溶液洗涤寄生虫，然后在994 × g下离心3分钟以沉淀寄生虫。
    6. 再次用19:1（cRPMI:10×PBS）溶液洗涤沉淀，随后在994 × g下离心3分钟。
    7. 将每份寄生虫沉淀分别加入含有2%红细胞压积的cRPMI培养基的培养瓶中（预热至37 °C）。将培养瓶在上述第9.1步所述条件下孵育4小时，以允许富集的裂殖体释放裂殖子并侵入新鲜红细胞。
    8. 孵育4小时后，按照前述第9.2–9.4步的方法用甘露醇处理寄生虫，以获得高度同步化的0–4小时环状体阶段寄生虫。
    9. 甘露醇处理后继续孵育同步化寄生虫44小时，以获得44–48小时的裂殖体阶段寄生虫。
  2. 从野生型（WT）和CDPK1 T145M寄生虫的裂殖体中提取RNA
    1. 在侵入后44–48小时收集野生型和CDPK1 T145M寄生虫。在4 °C下以994 × g用1×PBS洗涤寄生虫沉淀5分钟。
    2. 将寄生虫沉淀重悬于1 mL 1×PBS中，并按照第11.2.1步所述方法使用皂苷裂解周围的红细胞。
    3. 将寄生虫沉淀重悬于1 mL RNA提取试剂中，保存于-80 °C，待后续处理。
    4. 在15–30 °C下解冻冷冻样品，以充分解离核蛋白复合物。
    5. 每毫升RNA提取试剂中加入200 µL氯仿，手动剧烈振荡试管15秒。室温孵育2–3分钟。
    6. 在4 °C下以16,200 × g离心15分钟。RNA将完全保留在无色的上层水相中。使用试剂盒按照制造商说明书提取RNA。
  3. 由野生型（WT）和CDPK1 T145M寄生虫的RNA合成cDNA
    1. 使用DNA去除试剂盒处理含RNA的样品，按照制造商说明书去除污染性DNA。
    2. 使用cDNA合成试剂盒，根据制造商方案从分离的RNA样品中合成cDNA。我们在逆转录过程中使用随机六聚体引物，而非寡聚dT引物。
    3. 为每份用于cDNA合成的RNA样品设置无逆转录酶（NO-RT）对照反应，以排除cDNA合成过程中纯化RNA中残留的基因组DNA污染。
    4. 通过扩增包含内含子序列的任意基因片段（如全长cdpk1基因）来检测cDNA，以排除基因组DNA污染。PCR条件参照第1.1.1步所述。
  4. 野生型（WT）和CDPK1 T145M寄生虫的转录表达分析
    1. 使用从野生型和CDPK1 T145M寄生虫制备的cDNA，通过实时PCR分析11个不同基因的转录表达水平。这11个目标基因包括7个钙依赖蛋白激酶（CDPK）家族成员和4个参与红细胞侵入的激酶（见表2中用于实时PCR的基因及其对应引物）。
    2. 使用引物设计软件设计引物。使用特异性引物扩增每个目标基因约120 bp的片段，引物的熔解温度应相近。
    3. 使用预混液在实时PCR系统上进行扩增，循环参数如下：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环（95 °C变性10秒，52 °C退火20秒，62 °C延伸30秒）。
    4. 使用两个看家基因——甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和苏氨酰tRNA连接酶（ThrRS）32对每个基因的表达水平进行归一化处理。计算CDPK1 T145M寄生虫中各目标激酶相对于野生型对照的相对表达量。
    5. 使用R统计分析软件包进行统计分析。也可选用其他分析软件。
      注意：与野生型相比，全局转录组学方法（如RNA-Seq或微阵列）是研究突变寄生虫转录组重编程更为优越的技术手段。

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结果

重组野生型CDPK1以N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签融合蛋白的形式表达，并通过GST亲和层析纯化。纯化的CDPK1蛋白通过抗CDPK1抗体和抗GST抗体在Western blot中检测到图1）。利用定点突变技术，将野生型CDPK1中的苏氨酸“门控”残基（T145）分别替换为甲硫氨酸和丝氨酸，从而获得CDPK1T145M和CDPK1T145S突变型重组蛋白（图2). 体外 激酶活性检测用于评估所有重组CDPK1蛋白的激酶活性。采用半合成表位标记方法检测激酶活性。34 通过使用特异性抗体在蛋白质印迹（Western blot）中检测硫代磷酸酯基团（图3). 通过定量分析各自的自磷酸化和转磷酸化条带强度，评估了看门人残基替换对CDPK1自磷酸化活性以及对作为CDPK1外源底物的MBP进行转磷酸化的影响。具有甲硫氨酸看门人残基的CDPK1突变体保留了约53%的转磷酸化活性，而在看门人位置引入丝氨酸...

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讨论

一种含有功能低下等位基因的突变转基因寄生虫的构建 cdpk1 基于 体外 使用重组酶进行激酶活性数据分析。最好尽可能构建多种具有不同看门人残基的突变型重组蛋白。由于 恶性疟原虫 基因组富含AT，因此在其中表达重组蛋白时 E. coli 可能需要进行密码子优化。这将有助于全面评估看门人残基替换对突变激酶活性的影响。选择导致转磷酸化潜能降低的看门人残基替换，用于构建等位基因置换转基因寄生虫。同时，应将完全消除激酶转磷酸化活性的看门人残基替换作为阴性对照。在构建等位基因置换寄生虫时，另一个重要考虑因素是：在引入测试突变和阴性对照突变的同时，还需引入一个同义突变。构建包含同义突变的寄生虫 cdpk1 位点可作为重要的内参对照，以排除引入测试突变时可能产生的技术误差。此外，携带同义突变的转基因寄生虫可作为所有比较研究的对照，替代野生型（WT）寄生虫。

我们已采用双质粒系统来生成看门人突变寄生虫32,

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致谢

我们感谢贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学生命科学学院中央仪器设施提供的支持和设备。同时衷心感谢生物技术部门（BT/PR28256/MED/29/1313/2018）向AB提供的经费支持。我们感谢Jose-Juan Lopez-Rubio提供pL6eGFP和pUF1质粒。资助机构在本研究的准备及发表决策过程中未发挥任何作用。MS是科学与工业研究理事会JRF-SRF奖学金的获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× 磷酸酶抑制剂混合液Sigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
抗-GST 抗体ThermoFisher ScientificG7781
抗小鼠 HRP 抗体Sigma-AldrichA4416
抗兔 HRP 抗体Sigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
离心机ThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
离心机（用于细菌细胞沉淀）ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
离心机（用于寄生虫沉淀/处理）ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 转子)
DpnINEBRO1765
D-山梨醇 Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS 感受态细胞Sigma-Aldrich69956
E. coli DH5α 感受态细胞Takara Bio9057
电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙BioRad1652086
电穿孔仪BioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP 化学发光试剂G-Bioscience7860-003
庆大霉素ThermoFisher Scientific15750078
吉姆萨染液HimediaS011-100ML
谷胱甘肽 Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES，游离酸Merck391338
次黄嘌呤Merck4010CBC
In-fusion HD 克隆试剂盒Takara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP，去磷酸化 Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化小量试剂盒Takara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
对硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）AbcamAb138910
Primestar Max DNA 聚合酶Takara BioR045A
蛋白酶抑制剂混合液Roche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep 试剂盒 Qiagen27106
QuikChange II XL 定点突变试剂盒Agilent200521
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
皂苷Sigma-Aldrich47036
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III 第一链合成试剂盒ThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA 连接酶ThermoFisher Scientific15224017
硫代磷酸酯抗体AbcamAb92570

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