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方法文章

使用旋转纹身机对Xenopus laevis进行纹身标记的方法

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DOI：

10.3791/67086

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2024年6月28日

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine, Dartmouth College

本文内容

摘要

本文介绍了使用旋转式纹身机对成年Xenopus laevis（非洲爪蟾）进行纹身的方法。规范的纹身操作可产生深色、清晰易辨的数字标记，持续数月，便于在科研和记录管理中区分个体动物。

摘要

动物模型拓展了生物医学研究的范围，加深了我们对发育生物学、分子生物学和细胞生物学的理解，并使研究人员能够模拟人类疾病。记录和追踪个体动物有助于减少研究所需的动物数量，并优化实验操作以改善动物福利。目前已有多种记录完善的方法用于标记和追踪哺乳动物，包括耳孔标记和耳标。然而，针对水生两栖动物物种的标记方法却十分有限，现有资源往往过时、效果不佳或成本过高。本文中，我们详细阐述了使用旋转式纹身机对Xenopus laevis进行标记的方法和最佳实践。规范的纹身操作可产生高质量的标记，使个体易于识别，同时对动物健康造成的风险极小。我们还指出了导致低质量纹身的原因，这些情况可能导致标记迅速褪色并对动物造成不必要的伤害。该方法使研究人员和兽医能够对两栖动物进行标记，从而实现对生物学重复样本和转基因品系的追踪，并准确记录动物健康状况。

引言

动物模型是研究人类健康相关问题的有用工具。在实践中，利用动物模型开展生物医学研究需要对健康动物群体进行精心的组织和维护。遵循伦理的动物操作与饲养最佳实践旨在减少实验所需的动物数量，并优化操作流程以确保动物福利。1爪蟾属，包括 非洲爪蟾 (X. laevis；非洲爪蟾）和 Xenopus tropicalis (X. tropicalis；非洲爪蟾）自20世纪30年代以来已被用于生物医学研究，当时 X. laevis 被南非医生用于开展首次妊娠检测2尽管现代妊娠检测已不再需要青蛙，但青蛙在其中的作用 非洲爪蟾 研究仍在持续。使用的优势包括 非洲爪蟾 用于生物医学研究的优势包括其基因组注释完善3全年可诱导排卵，产生大量卵团4，以及适合进行体外处理的卵 体外 受精。这些特性使它们成为脊椎动物胚胎学与发育研究中的有用资源5,6,7基础分子与细胞生物学7,8,9,10以及用于模拟人类疾病7,11,12,13.

可靠的个体Xenopus动物追踪方法对于记录生物学重复样本、提升科研的严谨性和可重复性至关重要。由于Xenopus通常以群体方式饲养，对动物进行标记可使研究人员轻松追踪各个个体4。准确记录动物信息有助于节省时间和资源，并提高对动物健康状况的监测能力。例如，在建立转基因Xenopus品系的过程中，个体识别能够优化实验流程，因为该过程需要通过测序验证具有特定基因型的多代青蛙14，这依赖于良好的组织管理和个体识别。当这些突变缺乏明显成体表型时，这一点尤为重要。同样，在利用Xenopus卵母细胞和胚胎研究基础细胞与发育生物学时，追踪个体动物也具有重要意义。在诱导排卵后，动物需要至少休养3个月，以防止出现如过度排卵综合征等健康问题15。个体识别方法可确保动物不会被过于频繁地诱导排卵。

标记和追踪动物还能帮助实验室人员监测动物的健康状况。相同基因型的动物出现疾病可能提示近亲繁殖过度或转基因相关的意外健康问题。同样，动物在最近排卵后发病可能提示试剂、材料或操作技术存在问题。追踪动物及其健康状况，可使实验室人员和兽医在问题再次出现时及时跟进，并采取预防措施以避免未来发生疾病。在哺乳动物中，存在多种识别方法。小鼠的永久性标记方法包括耳缘打孔、耳标、纹身和皮下微芯片16。这些方法能够清晰、可靠地区分同一群体或笼内动物，且易于由实验室人员操作。例如耳缘打孔法创伤极小，仅需一种专用设备，适用于大多数年龄段的动物。尽管这些方法在小鼠中简单有效，但在蛙类中应用时面临一系列独特挑战。蛙类及其他两栖动物缺乏耳廓（外耳结构）。一些研究人员曾尝试将标签附着于动物的下颌、脚趾或后肢17,18，但该方法引发多种问题：下颌标签会引起刺激，躁动的蛙会试图用前肢将其扯下17；脚趾标签会刺穿脚趾间的蹼，影响运动并存在脱落风险。因此，两栖动物需要专门的个体识别方法。历史上，脚趾截除也曾用于标记两栖动物17,19。该方法使用锋利的剪刀剪除部分脚趾，通过前肢和后肢脚趾的长度或脚趾再生后的角度（在蝾螈中）来识别个体。然而，该方法存在伦理问题，即脚趾截除可能影响动物的运动能力17，同时可能导致出血并增加感染风险。另一种已建立的标记系统是皮肤自体移植，即从蛙体的一个部位取下皮肤，外科移植到另一部位。例如，已有方法描述使用胸部的浅色皮肤移植物标记蛙的背部或肩部20。皮肤移植同样存在局限性和风险：该操作具有侵入性，可能引发嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染，即“红腿病”，这是一种潜在致命的疾病；自体移植完全愈合需要长达6周时间；且根据已有方法，由于可用于移植的部位有限，最多只能将6只蛙共同饲养20。

侵入性较小的标记方法包括玻璃珠和微型芯片应答器17,19。在玻璃珠标记法中，将玻璃珠穿在细缝合线上，并缝入青蛙的皮肤内。该方法比皮肤自体移植具有更高的可变性，至少可提供60种不同的颜色组合。然而，该方法存在缝线脱落导致玻璃珠丢失的风险。另一种方法是将微型芯片应答器植入青蛙背部淋巴囊的皮下。这种方法被认为是最持久的标记方式，能够对数量几乎无限的个体动物进行唯一识别和编目。但这也是成本最高的方法，因为单个微型芯片价格昂贵，对大规模种群进行标记将带来较高的费用。此外，微型芯片需要专用扫描仪才能读取19。一种常见的Xenopus个体识别方法是依据动物自身的天然体色和斑纹特征。这种方法特别适用于X. laevis等具有明显且终身保持不变斑纹的青蛙。然而，这些斑纹可能因应激而随时间发生变化，且当青蛙在透明与着色容器之间转移时，体色外观也可能出现差异15。此外，该识别方法在X. tropicalis上应用效果较差，因其斑纹特征不如X. laevis明显，对于白化个体则完全无法使用，因其缺乏色素标记21。即使对于具有明显斑纹的物种，实验室人员也可能对斑纹的位置和大小做出不同判断，从而导致识别错误。因此，结合其他识别方法，对动物进行拍照记录是最可靠的手段。基于上述原因，我们致力于采用一种清晰易辨、持久稳定且侵入性最小的技术对Xenopus动物进行标记与识别。

目前公开发表的关于两栖动物纹身标记方法的资源十分有限。已有文献将纹身法与其他烙印技术一并描述，包括热烙法、硝酸银烙印法和冷冻烙印法17。在同一文献中，纹身操作使用27G皮下注射针头绘制数字完成，该过程未见引起感染，而其他烙印技术则使用金属丝弯成数字或其他标记进行操作。在另一项研究中，研究人员使用电动纹身机（描述为振动针）对青蛙进行标记，但该技术的细节描述较少17,19。作者警告称，该操作会破坏青蛙的保护性黏液层，从而增加患红腿病的风险。目前尚无任何一种标记或识别方法能够同时满足完全无创（如拍照）和永久性（如微芯片）的要求，而纹身法提供了一种有效的折中方案。与其他技术（如皮肤自体移植）相比，纹身法相对简单直接。其额外优势还包括学习曲线较短以及设备成本相对低廉。对水生两栖动物进行纹身标记存在某些特定挑战，可能使研究人员望而却步，并影响动物标记的成功率。本文旨在为研究人员提供使用旋转式纹身机对成年Xenopus进行纹身标记的详细记录方法。

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方案

所有所述动物实验程序均经达特茅斯学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 仪器设备设置

注意：流程图及实验台设置示例见（图1）。

  1. 将纹身枪和脚踏板连接到电源上。将脚踏板放置在工作台面下方。
  2. 组装纹身枪
    1. 使用内六角扳手或六角螺丝刀，松开握柄上的螺丝（图2A，红色圆圈标示处）。
    2. 将塑料尖端完全插入握柄中，拧紧螺丝以固定其位置。
    3. 将金属管插入握柄后部（图2A）。由于需要进行调节，请先插入约一半长度，然后拧紧螺丝以固定。
    4. 将纹身针从握柄后部穿入，使其前端稳妥地位于握柄前端的塑料尖端内（图2B）。
    5. 将针的后部和金属管一起穿入管夹中。调节金属管，使针头在塑料尖端中位置合适（图2B）。用手拧紧管夹，直至管子无法移动（图2C）。
    6. 取下黑色O型圈，将针钩在转子臂上，然后重新装上O型圈以固定针头位置（图2C）。
  3. 调节电源电压，使其具备足够穿透皮肤的功率，但又不至于过强而难以控制。电源接通并连接后，踩下脚踏板以确认设备正常工作。注意切勿将针头对准自己或其他人员。
    注：本实验方案中使用的纹身机在6.0至9.0 V之间工作效果最佳，但不同纹身机和电源之间的最佳电压可能存在差异，需通过实验确定。
  4. 取一个1.5 mL微量离心管的管盖或提供的塑料墨杯，加入黑色纹身墨水至约四分之三满。

2. 麻醉

  1. 准备一个足够大的麻醉容器，能够完全浸没一只成年雌性 X. laevis 青蛙。
    1. 使用对青蛙安全的（无氯）水，加入三卡因（tricaine），使其终浓度为 1.5 g/L，再加入碳酸氢钠，使其终浓度为 3.5 g/L。搅拌至完全溶解。该溶液的 pH 值为 7.15。
      警告：三卡因具有刺激性。
  2. 将一只青蛙完全浸入麻醉容器中。确保青蛙持续浸没在三卡因溶液中，直至其完全麻醉（7–8 分钟）。
    1. 检查青蛙是否完全麻醉的方法：将其取出，倒置握住，并用力挤压其中一只脚。若青蛙无任何退缩或反应，则可进行纹身标记。
    2. 若青蛙每次麻醉所需时间均超过 10 分钟，应重新配制新鲜的三卡因溶液，并用碳酸氢钠缓冲。
      注意：青蛙在三卡因溶液中停留时间不应超过 30 分钟15。

3. 纹身

注意：在对活体动物进行纹身标记之前，可先在果皮较硬的水果（如柠檬或香蕉）上进行练习。

  1. 在纹身前为青蛙准备一个恢复箱。在箱中加入10–15 L新鲜的对青蛙安全的水，并放置一块聚苯乙烯泡沫塑料作为浮岛。这将为青蛙苏醒时提供一个可攀附的表面，防止溺水。
    注意：可将聚苯乙烯泡沫冷藏运输箱的盖子放入自封袋中，制成泡沫塑料浮岛。
  2. 将麻醉后的青蛙仰卧放置在干燥的纸巾或实验台纸巾上（图3A）。在所有涉及青蛙的操作中，使用未漂白（棕色）的纸巾。
  3. 使用干燥的无绒布擦拭青蛙胸部的水分和黏液。
  4. 用手指找到青蛙胸部中央的胸骨，用非惯用手将皮肤绷紧。
  5. 标记青蛙
    1. 将组装好的纹身枪垂直于工作表面持握，并将针头浸入墨水中图3B).
    2. 保持组装好的纹身枪垂直，将针尖按压在青蛙皮肤上，然后踩下脚踏板。在均匀施压的同时，于青蛙皮肤上绘制线条。
      注意：少量出血或发红属于正常现象，轻微脱皮亦属正常。
    3. 如果针头被青蛙的皮肤卡住，可用擦拭纸清除针头上的多余墨水或皮肤组织。纹身过程中出现少量多余墨水属于正常现象。
    4. 如果青蛙胸部的墨水过多，导致无法清晰看到标记区域（图3C），用对青蛙安全的水和擦拭纸清除多余的墨水（图3C'）。然后用干燥的擦拭纸吸去水分，继续印染。
      注意：可在纹身前准备好一瓶对青蛙安全的水。
    5. 继续在同一区域盖印，直至擦去多余油墨后仍留下深色、清晰可辨的数字图3D）。对于曲线部分，应反复绘制较短的笔画，而不是一笔画出整个标记或数字。

4. 恢复

  1. 用适合蛙类的水浸湿一张纸巾，将其平铺在泡沫塑料小岛上（图4A）。
  2. 将蛙放回站立式水箱
    1. 将蛙腹部朝下放置在纸巾上，使其头部朝向水面（图4B）。将纸巾的前半部分折过来覆盖蛙的后半身，用手掌轻轻舀水湿润蛙的背部。蛙在麻醉苏醒后（纹身约1小时后），会自行进入水中并正常游泳。
    2. 待纹身完全愈合后（24小时后），将蛙移回长期饲养环境。

5. 清洁与设备维护

注意：尽管同一实验过程中针头可重复用于多只蛙，但最佳操作规范是在对不同蛙进行纹身时更换或对针头进行灭菌处理。

  1. 重复使用和高压灭菌纹身针
    1. 用100%异丙醇和去离子水冲洗针头，以松动墨水，并擦去未溶解的残留墨水。
    2. 刷洗后，将针头放入金属高压灭菌盒中，或用铝箔包裹，于干燥循环条件下高压灭菌30分钟。
  2. 若纹身机或其他设备部件上有墨水残留，请使用100%乙醇和纸巾擦拭干净。
  3. 麻醉溶液的终浓度三卡因约为0.5%。请根据机构的危险废物管理指南进行处理。
  4. 设备储存与维护
    1. 如有可能，将纹身机存放在干燥的环境中。过多的湿气会损坏电子元件，并缩短设备使用寿命。
    2. 为保持纹身机的良好工作状态，应检查转子上的轴承（图2C），确保其未因振动而松动22。可用内六角扳手或六角螺丝刀将其拧紧。
    3. 大约每月一次，使用高黏度润滑脂对转子臂上的轴承进行润滑22。
    4. 某些纹身机的转子臂可能会卡住而无法振动。此时可扭转转子臂或压缩弹簧，使针头处于下降位置（图2C）。

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结果

高质量的纹身应在青蛙胸部呈现深色、清晰可辨的线条，从几英尺外也能清楚区分（图5A）。通常情况下，较大的数字和标记更易于辨识，但较长的名称或数字可适当缩小，以舒适地容纳于青蛙胸部。纹身的持久性较难评估，但高质量的青蛙纹身应至少在3至6个月内保持深色且清晰可读（图5D-D'）。一旦纹身褪色，可使用相同技术进行补色。

操作技术不佳不会对动物造成伤害，但可能导致纹身迅速褪色（图5B），从而需要更频繁地进行补纹。过度用力的纹身操作可能引起出血和红肿，而将青蛙置于不正确的恢复体位则可能导致意外溺水。

纹身的质量及技术的有效性可在纹身后的数月内进行评估（图5E）。只要在恢复期后青蛙体表仍有墨水残留，即视为纹身成功。

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讨论

纹身人类是一种可追溯到数千年前的艺术形式，而人类在为自己纹身的同时，也长期对动物进行纹身或烙印标记23。用于标记动物（尤其是哺乳动物）的设备和技术已经非常成熟、记录完善且广泛可得。尽管动物标记最初用于区分家畜和防止盗窃23，但其在生物医学研究中的作用也变得同样重要。

对两栖动物进行纹身标记的优点在于，纹身部位在24小时内即可愈合，且良好的纹身标记可持续数月（图5D'）。纹身技术为两栖动物的饲养与管理提供了多种优势。通过清晰易读的数字编号，研究人员和兽医人员能够轻松区分个体动物，即使在颜色较深的饲养箱中也能清晰辨识19。与皮肤自体移植相比，该方法适用于所有成年蛙类，而皮肤自体移植则不建议用于两岁以上的蛙15。最重要的是，纹身标记可实现对大量动物的个体识别，在X. laevis的胸部可轻...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢达特茅斯学院比较医学与研究中心为本方案所用动物提供的日常饲养管理。我们还要感谢Leah Jacob和Adwaita Bose在测试实验方案及拍摄动物照片过程中提供的帮助。最后，感谢Ann Miller实验室在纹身技术实践方面的培训。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R00 GM147826基金资助，项目负责人：J.L.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 针圆形排针Worldwide Tattoo Supply1203RLB无菌包装
5 针圆形一次性 ULTRAWorldwide Tattoo SupplyHTIPRS5-U无菌包装
5 针圆形排针Worldwide Tattoo Supply1205RLB无菌包装
7 针圆形排针Worldwide Tattoo Supply1207RLB无菌包装
夹线电缆Worldwide Tattoo SupplyN/A
脚踏开关Worldwide Tattoo SupplyN/A
墨杯Worldwide Tattoo SupplyN/A
Kimwipes 柔性擦拭纸Fisher Scientific06-666A
RCA 连接线Worldwide Tattoo SupplyN/A
Scream Ink Pitch Black，1 盎司Worldwide Tattoo SupplySI101
碳酸氢钠 (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
不锈钢手柄Worldwide Tattoo SupplyN/A
Stealth 2.0 旋转式纹身机Worldwide Tattoo SupplyN/A
Stealth 2.0 旋转式纹身机套装Worldwide Tattoo SupplySTEALTH2-SET
聚苯乙烯泡沫岛N/AN/A此为聚苯乙烯泡沫冷藏运输箱的盖子
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Tricaine）Sigma-AldrichE10521警告：刺激性物质
未漂白纸巾Grainger2U229纸巾必须未漂白，漂白剂对两栖动物有毒
电源供应器Worldwide Tattoo SupplyN/A
冲洗瓶（含对蛙类安全的水）Fisher ScientificFB0340923T对蛙类安全的水为去氯水，pH 值 7.0–8.5，电导率 1200–1800 µS
X. laevis 成年雌性Xenopus1N/A
带拉链的塑料袋N/AN/A该袋子应足够大以容纳聚苯乙烯泡沫岛

参考文献

  1. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
  2. Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
  3. Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
  4. Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
  5. Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
  6. Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
  7. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
  8. Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
  9. Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
  10. Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
  11. Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
  12. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
  13. Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
  14. Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
  15. Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
  16. Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
  17. Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
  18. Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
  19. Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
  20. Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
  21. Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
  22. Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
  23. Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
  24. Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).

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