核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2 弛豫以及{1H}-15N异核Overhauser效应（hetNOE）实验数据。
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本文内容
摘要
摘要
核磁共振（NMR）波谱技术可用于在生理温度下研究溶液中的蛋白质。通常，蛋白质主链的酰胺基团或侧链中的甲基基团被用作报告蛋白质结构动力学的探针。对于经15N标记且完全质子化的球状蛋白质样品，其主链结构动力学研究通常适用于分子量不超过50 kDa的蛋白质。当结合侧链氘代与横向弛豫优化波谱（TROSY）技术时，该上限可扩展至球状蛋白质200 kDa，若研究重点为侧链，则可进一步扩展至1 MDa。当研究对象为内在无序蛋白质（IDPs）或含有内在无序区域（IDRs）的蛋白质时，这些分子量限制不再适用，研究范围可远超上述数值。其原因是IDPs或IDRs具有高度的内部灵活性，通常在动力学上相互解耦。多种NMR方法可在从皮秒到小时的广泛时间尺度上，提供原子分辨率的蛋白质结构动力学信息。标准的15N弛豫测量可概述蛋白质的内部灵活性，并表征蛋白质主链在快速的皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文提供了一套实用的操作指南，用于设置和记录NMR的15N R1、R2以及异核Overhauser效应（hetNOE）实验。我们展示了典型数据，并解释了如何在进行更复杂分析之前对其进行简单的定性解读。
引言
蛋白质的功能不仅由其三维结构决定，还取决于其结构动力学，包括蛋白质内部的柔韧性以及在不同构象之间发生的结构转变。核磁共振（NMR）波谱技术可用于研究溶液中蛋白质的结构动力学1,2,3。近年来质子检测的固态NMR技术的发展，也使得在溶解度较低的状态下（例如脂双层膜）对蛋白质动力学进行表征成为可能4,5,6。在溶液NMR中，可以研究蛋白质主链和侧链的结构动力学。对于球状蛋白质，只要蛋白质经过15N同位素标记，便可对其主链结构动力学进行研究，分子量上限可达50 kDa。若结合侧链氘代和横向弛豫优化谱（TROSY）技术，该上限可扩展至200 kDa7,8。当研究重点为侧链动力学时，可研究的蛋白质及复合物的分子量范围可进一步扩展至1 MDa2,9。
所述的分子量限....
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方案
1. 核磁共振样品制备
注意：对蛋白质进行同位素标记是为了进行高维核磁共振（NMR）和高级NMR实验。当在富含培养基（例如Luria-Bertani [LB] 或 2x酵母提取物胰蛋白胨培养基 [2YT]）中实现大肠杆菌（E. coli）表达并完成蛋白质纯化，且每升培养液获得数毫克蛋白质后，制备同位素标记的NMR样品通常相对简单。
- 进行同位素标记时，使用M9最小培养基进行基因表达，其中15N标记的氯化铵为唯一氮源，13C富集的葡萄糖为唯一碳源。
- 蛋白质纯化请遵循实验室针对相应蛋白质建立的标准操作流程。
注意：结果部分展示了固有无序蛋白（IDP）——单体SNARE蛋白突触小泡相关蛋白2（Synaptobrevin-2，1-96）的代表性结果。Synaptobrevin-2的NMR同位素标记实验已如文献70所述进行。对于极高精度的测量，建议使用低浓度D2O（低于5%），这是因为氘同位素效应在Hahn-Echo 15N T2以及低频15N CPMG弛豫弥散实验中（本文未讨论）较为明显，但在15N R1ρ实验中影响极小（该效应在此类实验中主要....
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结果
以下展示的是在囊泡SNARE蛋白突触小泡相关膜蛋白2（Synaptobrevin-2，1-96位氨基酸，常称为VAMP2，即囊泡相关蛋白2）上记录的一些典型的核磁共振（NMR）弛豫数据。NMR数据采集所用样品为171 µM的15N标记Synaptobrevin-2（1-96）（下文简称为Syb-2），溶于含150 mM NaCl、0.1 mM TCEP和1 mM EDTA的50 mM MES缓冲液（pH 6.0）中。所有实验数据均在278.15 K条件下采集，样品体积为250 µL，装入3 mm NMR样品管。实验在配备Bruker 5 mm QCI 1H、15N、13C、31P四共振低温探头的Bruker 600 MHz AVANCE III HD波谱仪上进行。
图3 展示了根据核磁共振（NMR）弛豫实验获得的NMR弛豫曲线拟合得到的残基特异性15N R1和R.......
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讨论
本方案描述了Lakomek等人69和Stief等人70建立的NMR 15N弛豫实验方法。我们重点采用了基于灵敏度增强型HSQC检测方案的NMR脉冲序列。15N R1和R1ρ实验的实施方法详见Stief等人70的描述，而异核NOE（hetNOE）实验则由Lakomek等人69进行了详细说明。
在设置核磁共振弛豫实验时，15N R1ρ 实验最为关键，因为选择过长的最大弛豫时间或过高的自旋锁定射频幅度可能会损坏探头。对于弛豫时间，理想情况是从100%强度到25%强度（相对于参考实验）均匀采样完整的衰减曲线。对于弛豫较慢的蛋白质（如内在无序蛋白IDP），由于其具有较长的15N T2时间，通常难以对衰减曲线进行全程采样，因为需要限.......
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能被认为会影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
感谢Melinda Jaspert和Kevin Bochinsky提供的有益讨论。N.L.感谢德国科学基金会通过海森堡计划（DFG资助编号433700474）提供的经费支持。本工作还得到了亥姆霍兹协会倡议与网络基金资助项目"新冠病毒致病机制的病毒学与免疫学决定因素——为未来大流行病做好准备的经验教训（KA1-Co-02 "COVIPA"）的支持。我们感谢获得由于利希研究中心和杜塞尔多夫海因里希·海涅大学（HHU）共同运营的于利希-杜塞尔多夫生物分子核磁共振中心的大力支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 布鲁克 600 MHz AVANCE III HD 波谱仪 | Bruker | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html | 进行的核磁共振实验 |
参考文献
- Sekhar, A., Kay, L. E. An NMR view of protein dynamics in health and disease. Annu Rev Biophys. 48, 297-319 (2019).
- Rosenzweig, R., Kay, L. E. Bringing dynamic molecular machines into focus by methyl-TROSY NMR. Annu Rev Biochem. 83, 291-315 (2014).
- Pa....
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重印与许可
