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自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控与光纤光度记录

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DOI：

10.3791/67090

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2024年9月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology, 2School of Microelectronics, Xidian University, 3Department of Biomedical Engineering, The Hong Kong Polytechnic University, 4Centre for Cognitive and Brain Sciences and Ministry of Education Frontiers Science Center for Precision Oncology, University of Macau, 5Deep Brain Technology Co., Ltd

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案包括换能器制造、参数报告、手术操作以及信号记录，涵盖了在自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控和光纤光度记录的整个操作流程。

摘要

聚焦超声神经调控（FUN）是一种有前景的非侵入性技术，可用于干预深部脑区的神经环路。该技术可与大多数现有的脑功能监测方法兼容。 体内将FUN与脑功能记录技术相结合，不仅能够通过闭环反馈机制研究特定脑功能的正常活动与功能障碍，还能为理解FUN本身的作用机制提供深入见解。本文提供了一种经过改进的、简便、可靠且稳健的实验方案，用于在自由活动的小鼠中同步实施聚焦超声神经调控（FUN）与光纤光度法GCaMP6s荧光信号记录。该方案包括制备尺寸适宜的单一换能器，并将其临时放置于小鼠体表，同时牢固固定光纤植入物，以确保换能器能够顺利定位。FUN与光纤光度法的结合，实现了在自由活动状态下对深部脑区神经环路在FUN刺激过程中实时光学记录其响应。为验证本方案的有效性，以Thy1-GCaMP6s转基因小鼠为例，在小鼠自由活动时记录其丘脑前核在FUN作用下的神经活动。我们认为，该方案有望推动FUN技术在神经科学领域及生物医学超声领域的广泛应用。 关键词：聚焦超声神经调控，光纤光度法，GCaMP6s，自由活动小鼠，神经环路，深部脑区，闭环反馈，丘脑前核

引言

聚焦超声神经调控（FUN）作为一种前景广阔且用途多样的神经调控工具，为探索大脑功能与组织结构提供了巨大潜力1。FUN 能够以极高的精确度无创地将声能传递至脑组织内的任意目标位置2。其能够在安全、无创的前提下，对深部脑区的神经活动实现短暂且可逆的调控，并具有高度的空间和时间特异性，这一特性使其成为现有临床神经调控技术的有力补充3。有效的 FUN 已在人体受试者4,5,6以及多种动物模型中得到验证，涵盖小型7,8,9,10和大型物种11,12,13,14,15,16,17。

通过在FUN期间监测神经活动，观察FUN对特定神经类型的影响，我们可以深入探究这一过程背后的机制。18,19基于基因编码钙离子指示剂（GECIs）的光纤光度法在过去十年中被广泛应用于追踪特定细胞类型群体活动，已成为一种多功能的研究手段。 体内20,21,22,23,24因此，同时应用功能性超声成像（FUN）和光纤光度法可显著加深我们对FUN的全面理解。然而，由于体积较大的单一传感器需要固定在支架上，实验动物必须接受麻醉并被固定在立体定位仪中。7,19,25,26该方法可能不适用于与感知、认知及行为评估相关的某些类型实验。建立一种能够促进FUN与光纤光度法结合，同时不妨碍小鼠活动能力的实验方案至关重要。7.

本研究中，我们介绍了一种在先前研究中使用的优化方案，用于无缝且有效地完善单个换能器的制备方法及其在小鼠身上的临时固定，同时确保光纤植入物的稳固固定，以促进换能器信号的顺利传递7,19,26。该方案使研究人员能够在无束缚的小鼠中记录受超声调控的神经活动。为降低听觉干扰，我们选择了更平滑的包络形式，例如正弦包络27。通过在自由活动小鼠接受聚焦超声神经调控（FUN）期间同步记录其丘脑前核的神经活动，验证了本方案的可行性。结果表明，换能器的能量足以实现神经调控，且光纤植入物与换能器的固定方法可确保其稳定性。

方案

所有实验操作和动物处理均符合国家自然科学基金委员会（NSFC）伦理指南以及广东智能科学与技术研究院机构动物护理和使用委员会批准的方案要求。

1. 换能器准备

  1. 准备一个压电陶瓷片，其内径为 3 mm，外径为 7 mm，中心频率为 500 kHz。
    注意：外径可根据目标脑区的具体位置进行调整，在保证刺激精度且不超出小鼠颅骨边界的条件下应尽可能增大。
  2. 使用环氧导电银胶将导线连接至压电陶瓷片的两侧（图 1）。待环氧导电银胶固化后，使用万用表测量导线两端的电阻，确保其阻值约为 0。
  3. 在洁净的玻璃片表面贴上一层双面胶。将高度为 8 mm、外径为 8 mm、内径为 7.6 mm 的压电陶瓷片和铜环紧密粘附于玻璃片上。
    注意：铜环的内径由压电陶瓷片的尺寸决定，以确保铜环能够完全覆盖压电陶瓷片。
  4. 将外径为 3 mm 的聚丙烯管牢固地插入压电陶瓷片中心，并将其牢固粘附于玻璃片上（图 1）。
  5. 配制适量环氧树脂胶并进行抽真空处理。使用一次性注射器吸取环氧树脂，缓慢注入铜环内。静置约 10 小时，直至环氧树脂完全固化（图 1）。
  6. 使用电烙铁将两根导线的自由端焊接到卡口式螺母连接器上。取下玻璃片，并用酒精清洁换能器表面（图 1）。

2. FUN 的报告参数

  1. 将水听器和换能器置于装有去离子水的水箱中（图2A）。确保定位系统的中心光束（Z轴）与换能器轴对齐。该对齐可通过以下步骤实现：首先，通过二维扫描在焦平面上找到一个场强最大值；其次，在另一个具有明显最大值的平面上识别出场强最大值；然后，比较这两个最大值的X和Y坐标，并在必要时迭代调整换能器的位置和/或方向28。
  2. 调节水听器尖端，使其与换能器表面保持1 mm的距离，并在将水听器定位至换能器右侧边缘中点时保持此距离恒定。启动扫描程序，以采集XZ平面内的自由声场（图2B）。
    注：水听器的构建方法详见 https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control。
  3. 沿Z轴移动水听器，以确定与空间峰值压力对应的位置深度。在本实验中，空间峰值压力出现在距离换能器表面3.4 mm处；在将水听器移至XY平面中换能器右下角时，保持此距离不变。通电并启动扫描程序，以采集XY平面内的自由声场（图2B）。
  4. 将换能器放置在按步骤4所述接受过手术的小鼠颅骨上。通过如2.1–2.3节所述的水听器扫描，获取XZ平面和XY平面的经颅声场（图2D）。
  5. 读取焦点处的压力幅值，该位置即为自由声场和经颅声场中的空间峰值区域。自由声场中焦点处的压力幅值为730 kPa，经颅声场中为580 kPa。读取-3 dB处的焦区尺寸（图2C、E），以及经颅声场中XY和XZ平面上的位置，以评估该换能器的声场是否能够覆盖目标脑区。
  6. 计算机械指数（MI），根据FDA指导文件，为减少空化效应，MI应低于1.9。MI的计算公式如下：
    数学公式，MI=pr,3/√f0，用于统计计算的方程。     (1)
    其中pr,.3表示经0.3 dB cm-1 MHz-1衰减系数校正后的峰值负压（单位：MPa），f0为工作频率（单位：MHz）。测得经颅声场的峰值负压为580 kPa，距离换能器3.4 mm，f0为500 kHz，因此校正后的pr,.3为576.6 kPa。MI为0.82。
  7. 计算空间峰值脉冲平均强度（Isppa），根据FDA指导文件，该值在平面方向上应低于190 W/cm2。强度的计算公式如下：
    超声强度方程，Isppa，表示为公式，与功率和压力积分相关。     (2)
    其中psp(t)为空间峰值位置处随时间变化的声压，Z为介质的特征声阻抗（软组织约为1.5 × 106 Rayls），PD为脉冲持续时间。对于方波包络，该式简化为：
    声学强度方程 \(I_{\text{sppa}} = \frac{A^2}{2Z}\)，公式。     (3)
    其中A为空间峰值压力幅值。在超声聚焦位置测得的A为580 kPa，脑组织的Z约为1.58 × 106 Rayls，因此方波包络的Isppa为10.65 W/cm2，正弦包络的Isppa也为10.65 W/cm2。
  8. 计算空间峰值时间平均强度（Ispta），根据FDA指导文件，该值在平面方向上应低于430 mW/cm2。强度的计算公式如下：
    超声强度方程 \(I_{\text{spta}} = \frac{1}{T \ast Z} \int_0^T p_{\text{sp}}(t)^2 dt\)，公式     (4)
    其中T为计算平均值的时间周期。对于方波包络，该式简化为：
    方程显示 I<sub>spta</sub> 为 DC<sub>pulse train</sub> I<sub>sppa</sub>，与脉冲序列相关的公式。     (5)
    其中DCpulse train为脉冲序列的占空比。此处，由于使用了连续波，DC脉冲序列为1%，因此Ispta等于空间峰值脉冲平均强度，对于方波包络为106.5 mW/cm2。MI、Isppa和Ispta可通过软件计算得出（图3A）。基于MATLAB的便捷代码可从 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 获取。
  9. 报告脉冲时序参数，包括Amax、脉冲持续时间、脉冲重复间隔、脉冲序列持续时间和包络（图3B）。

3. 手术前动物准备

  1. 称取约8周龄的雄性GCaMP6s转基因小鼠，其体重约为20 g。配制含有10 mg/mL氯胺酮和2 mg/mL赛拉嗪的无菌生理盐水溶液。使用26G针头和1 mL一次性注射器，按100 mg/kg氯胺酮和20 mg/kg赛拉嗪的剂量，通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合溶液。当动物对疼痛刺激（如脚趾夹捏）无反应时，开始手术准备。
  2. 使用电推剪修剪动物头部的毛发，并在手术前用70%乙醇和聚维酮碘对局部区域进行消毒。
  3. 将小鼠俯卧位固定于立体定位仪上，并确保颅骨处于水平位置。在动物眼睛上涂抹保护性眼膏以保持湿润。

4. 手术步骤

  1. 沿矢状缝从枕骨开始至鼻骨前端做一切口。使用手术剪剪除覆盖两侧半球的皮肤。
  2. 使用无菌生理盐水清洗颅骨，去除残留的骨膜。
  3. 使用棉签将3%过氧化氢涂抹于暴露的颅骨表面，持续约2 s-3 s，以形成微孔。用无菌生理盐水彻底冲洗，并确保该区域完全干燥。
  4. 使用无菌高压灭菌的钻头，在根据立体定位图谱以bregma和lambda为参照确定的大脑区域上方，制作一个直径为0.6 mm的环钻颅骨开孔。用无菌生理盐水冲洗去除碎屑，并确保充分干燥。操作时注意避免损伤任何组织。
  5. 将光纤插芯（植入物）插入探针 holder 并连接至立体定位仪臂。
  6. 使用立体定位臂将植入物对准目标区域正上方。插入光纤进入脑组织时，以约 2 mm/min 的速度缓慢推进。
  7. 将牙科水泥调至适当黏稠度，以便于在颅骨表面均匀涂抹。使用无菌牙签将一层薄薄的牙科水泥涂布于颅骨表面及植入物的下部，待其完全干燥。
  8. 小心取下探针架。准备一根高度为3 mm、外径为3 mm、内径为2.6 mm的聚丙烯管，然后沿其全长切开。
  9. 使用镊子将管道连接到植入物底部。将牙科水泥粉末倒入管道中，确保管道在植入物上方留有足够长度，以用于记录光纤信号。加入所需的液体，并静置数分钟，使牙科水泥固化。
  10. 找到管道的开口，小心地用镊子夹住并取下管道。制备牙科水泥混合物以供使用，确保在颅骨上均匀涂抹一层薄薄的水泥。尽可能覆盖颅骨的大部分表面区域。等待数分钟，使牙科水泥固化。
    注意：切勿让牙科水泥接触小鼠的皮肤。
  11. 在3D打印的环上钻三个孔（直径1 mm），沿水平方向均匀分布，环的高度为7 mm，外径为10 mm，内径为8.4 mm。将螺丝（长1 mm）固定至相应孔中。
  12. 将植入物的顶端插入预制换能器的孔中。确保3D打印环的内壁光滑，然后将其放置在位于小鼠颅骨上的换能器周围。确保换能器位于环的中心位置。
  13. 将牙科水泥涂抹于环状物与颅骨的连接处，静置数分钟使牙科水泥固化。注意避免将牙科水泥涂在换能器与颅骨的连接部位。
  14. 小心取下换能器并牢固拧紧螺丝。将小鼠转移至保温笼中，并确保在其完全恢复意识前持续监测，之后再放回原笼。
  15. 术后，皮下注射卡洛芬（Carprofen，2 mg/kg）以镇痛，每24小时一次，持续3天，以控制炎症和疼痛。每日监测动物是否有痛苦、异常体重减轻、疼痛或感染等迹象。通常情况下，到第3天rd 术后第3天，所有小鼠均应表现出正常行为。若观察到任何小鼠出现痛苦或疾病迹象，则rd 当天，依照机构的安乐死指南进行操作。
    注意：根据特定的机构指南和批准，可考虑使用其他镇痛方案，例如在操作前给予镇痛药物剂量。

5. 刺激与信号记录

  1. 术后7天，打开气体麻醉机的氧气供应，调节氧气流量调节器，将气体流量设定为300–500 mL/min。
  2. 将小鼠放入诱导室，关闭麻醉气体向面罩的输送。旋转蒸发器旋钮，调节适当的麻醉浓度（2%–2.5%）。
  3. 小鼠麻醉后，将其置于带有麻醉面罩的立体定位仪上。关闭诱导管路，使麻醉气体流入麻醉面罩。调节适当的维持麻醉浓度（1%–1.5%）。
  4. 用酒精清洁植入物的顶面，然后将光纤跳线插入已准备好的换能器中心。
  5. 使用26G针头和1 mL一次性注射器将水注入植入物与3D打印环之间的空隙，以湿润颅骨。用纸巾吸除多余水分。
  6. 使用26G针头和1 mL一次性注射器将耦合剂注入植入物与3D打印环之间的空隙，以促进超声波从换能器顺利传播至脑组织。
  7. 将植入物连接至光纤跳线。小心地将换能器插入已填充耦合剂的区域，并牢固拧紧螺钉。
  8. 将小鼠置于开放场地中，使其苏醒。将换能器连接至超声激励系统，同时将光纤跳线连接至光纤记录系统，确保小鼠可自由活动。
    注意：光纤跳线长度为2 m，直径为1.25 mm。405通道的光强为20 µW，470通道的光强为40 µW。
  9. 同时启动超声激励装置和光纤记录系统，以实现超声神经调控与光纤信号记录的同步。

结果

在距离换能器表面3.4 mm处的XY平面和XZ平面上，对应于小鼠前丘脑核位置的自由声场中的声压分布如图2B、C所示。这些测量数据是通过在XY域和XZ域进行水听器扫描获得的。在距离换能器表面3.4 mm处的经颅声场中，XY平面和XZ平面上的声压分布如图2D、E所示。测得中心频率为500 kHz时，自由声压为730 kPa，经颅声压为580 kPa。测得颅骨厚度平均约为0.2 mm。我们假设色散关系近似为线性，因此颅骨的衰减系数为19.98 dB/cm·MHz。该轻型换能器重量约为1.66 g，使小鼠能够自由活动，便于观察小鼠在FUN作用下的行为反应及其运动轨迹。

在 FUN 刺激下记录了光纤信号（图 4B、D），其中包络分别为方波和正弦波。实验共使用了五只雄性小鼠。方波持续时间为 300 ms，连续正弦波持续时间为 471 ms，以确保两种不同 FUN 刺激的总能量相同（图 4A、C）。光纤信号的增强表明神经活动增加。在 FUN 刺激下神经反应迅速，提示换能器具有足够的能量和优异的聚焦能力。

用于电导率测试的聚丙烯导线传感器组装示意图。
图1：换能器的制备流程。该流程依次包括将压电薄膜连接至导线，然后进行封装。请点击此处查看该图的放大版本。

超声换能器设置；包括水听器、电机系统、信号发生器、示波器。
图2：超声换能器的声场测量装置及表征。(A) 超声声场测量装置包括水听器、电机系统、控制软件、信号发生器和示波器。(B, D) 自由场和经颅声场中超声换能器测量的示意图，以及横向和纵向声场测量结果。(C, E) 换能器焦点位置处横向声场的示意图，红线表示-3 dB位置的声场。(F, G) 水听器测得的换能器输出波形图。红色虚线框内的区域和蓝色虚线框内的区域分别表示波形达到稳定振幅前的时段以及换能器结束时的振铃时段。橙色虚线框内的区域表示波形的稳定部分，用于计算声压振幅，记为 p。请点击此处查看该图的放大版本。

超声参数计算和脉冲波形图；正弦波、方波包络及强度度量。
图3：超声参数计算软件与超声参数。（A） 自制的超声参数计算界面，用于计算机械指数（MI）、空间峰值脉冲平均强度（Isppa）和空间峰值时间平均强度（Ispta）。该界面可从 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 获取。（B） 超声压力波形示意图，展示了正弦脉冲包络和矩形脉冲包络两种形式。周期（T）表示工作频率单个循环的持续时间。一次脉冲（即一次连续超声作用）持续特定的时间，称为脉冲持续时间（PD）。通常，脉冲以序列形式重复出现，称为脉冲串。脉冲串中两个连续脉冲之间的时间间隔称为脉冲重复间隔（PRI），其值为脉冲重复频率（PRF）的倒数。整个脉冲序列（即脉冲串）具有特定的持续时间，称为脉冲串持续时间。间隔时间指单次实验的持续时间。请点击此处查看该图的放大版本。

波形分析；z分数与时间的关系图；方波和正弦波；信号响应数据。
图 4：FUN期间光纤光度信号。(A, C) 被方波（B）和正弦波（D）包络的超声参数。(B, D) 分别对应于（A）和（C）中FUN期间的光纤光度信号。绿色阴影表示FUN持续时间。实线为平均值，蓝红阴影区域分别为记录信号的平均值和标准差。实验共使用了五只雄性小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方法结合了FUN与光学光度记录技术，能够用于研究小鼠脑功能 体内 FUN 机制。从换能器制备到手术操作的完整工作流程均已阐明，使领域外的研究人员也能独立开展 FUN 实验。

该实验方案的一个关键方面是确保光学植入物能够顺利插入换能器中，颅骨上的牙科水泥足够薄以允许超声波穿透至大脑，光学植入物牢固地连接在颅骨上以防止实验过程中发生移位，且换能器的能量输出足以实现有效的神经调控。围绕植入物的牙科水泥厚度应等于或小于换能器孔的直径。因此，建议在换能器制备过程和手术中使用同一根聚丙烯管。由于聚丙烯管不与牙科水泥粘连，故选择其作为模具，在植入物周围成型牙科水泥，并通过侧向切口设计，便于聚丙烯管的顺利移除。

电生理记录和光学光度记录是体内监测脑活动的常用技术，具有高时空分辨率。然而，电生理记录直接捕捉附着在电极上的神经元的放电信号，而超声波可直接引起电极振动，从而产生不必要的混杂效应。幸运的是，光纤光度技术侵入性较小，能够捕捉其下方神经元的活动，从而减少超声振动对植入物的干扰7,19,26。因此，在自由活动的小鼠中同步进行聚焦超声神经调控与光纤光度记录的技术，有助于研究超声神经调控的体内机制，并能够在无麻醉干扰的情况下观察小鼠的行为反应。

然而，光纤光度法的空间分辨率受到限制，因为它无法监测亚细胞结构和微环路的活动24。此外，由于该方法并不直接记录神经元活动产生的电信号，因此只能间接反映神经元活动。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了国家自然科学基金（32371151）、广东省高水平创新研究院（2021B0909050004）、香港研究资助局协作研究基金（C5053-22GF）、一般研究基金（15224323 和 15104520）、香港创新科技基金（MHP/014/19）、香港理工大学内部经费（G-SACD 和 1-CDJM）以及辽宁省自然科学基金——机器人学国家重点实验室联合开放基金（2022-KF-22-03）的支持。作者谨此感谢香港理工大学生命科学大学研究设施（ULS）和行为与系统神经科学大学研究设施（UBSN）提供的平台与技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1ml 一次性注射器DOUBLE-DOVE1ml注射针头
26 号针头Jin maoJM-J02制备用针头
70% 乙醇Dong de alcohol 0.7消毒
酒精Dong de alcohol 0.75清洁换能器表面
卡口式螺母连接器Risym75-5连接线的另一端连接至超声激励装置
铜环Guowei Metal Materials外径、壁厚、高度（8mm，0.2mm，8mm）换能器的外部保护外壳
一次性注射器DOUBLE-DOVE1ml吸入环氧树脂，以便将精确的小剂量注入铜管中
双面胶带3M3M55236用于固定换能器和导线，确保环氧银胶在干燥前不发生移动
电子焊台Victor868A+焊接导线并连接至 BNC 接口
环氧树脂胶KraftK 9741密封换能器后部
环氧导电银胶VonrollCB-052将导线粘附于压电陶瓷片的正负极，并保持低电阻
fader JOQOYP-7021去除小鼠头部毛发
气体麻醉机RWDR500用于小鼠麻醉
玻璃片Square glass80mm*80mm作为临时操作平台，用于放置压电陶瓷和导线，可在玻璃板表面涂覆双面胶带
氯胺酮/赛拉嗪 Shutai/shengxinZoletil 50/2ml*10麻醉小鼠
医用耦合剂Bestman120g耦合剂作为传导超声信号的介质
小鼠Bai shi tongGCaMp6实验对象
眼科软膏Yun Zhi0.5% x 2.5 g x1湿润眼部区域，防止失明
 压电陶瓷片Jiaming Electronics Factory直径、孔径、厚度（7mm，3mm，3.56mm）以超声形式发射电能
聚丙烯管Baihao Pipe Factory外径、内径、长度（3mm，2mm，500mm）防止环氧树脂堵塞孔洞，保留孔道通畅
聚维酮碘lefeke500ml消毒
光纤信号记录系统Thinker Tech Nanjing Biotech三色单通道光纤记录系统记录光纤光度信号
立体定位仪RWD68805固定小鼠头部并定位脑区
无菌生理盐水Shijiazhuang si yao500ML,4.5g作为溶剂，溶解药物
超声刺激 Deep Brain TechnologyDB-USNM为换能器提供稳定输入
电子天平Qin bo shi1718称量小鼠体重
导线Jinpeng Cable Factory0.3mm2为换能器提供电压

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