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基于针导不对称双侧颈总动脉狭窄的小鼠血管性认知障碍与痴呆模型

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DOI：

10.3791/67092

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2024年11月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Pittsburgh, 2Geriatric Research Education and Clinical Center, VA Pittsburgh Healthcare System, 3School of Arts & Sciences, Washington University in St. Louis, 4Animal Imaging Center, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

提出采用针法建立小鼠双侧颈总动脉不对称性狭窄模型，用于构建血管性认知障碍与痴呆的动物模型。该模型相较于既往已建立的模型可产生更长期的病理结果，且适用于活体磁共振成像。通过可视化操作演示为手术技术的掌握提供指导。

摘要

血管性认知障碍与痴呆（VCID）由脑血管损伤引起。鉴于VCID发病率较高，且随着人口老龄化预计将持续上升，建立一种可靠的动物模型对研究该疾病至关重要。本文介绍了一种基于双侧颈总动脉非对称性狭窄的新型小鼠VCID模型构建方法，该方法可模拟由颈动脉粥样硬化引起的人类慢性脑低灌注状态。

简而言之，使用7-0丝线将颈总动脉（CCAs）分别结扎于不同规格的针头（右侧颈总动脉使用32 G针头，左侧使用34 G针头），随后立即移除针头。残留的结扎环可导致持续的血流减少，并引发与白质损伤、微梗死及反应性胶质增生相关的长期认知功能障碍，从而高度模拟血管性认知障碍（VCID）的发病机制。重要的是，在该针头模型中，临床表型不会随时间逆转，因而可稳定产生长期认知障碍。此外，术后24周的存活率达到81.6%，相较于其他具有相似血流减少程度的VCID成熟模型，存活率更高。

其他优势包括材料成本低，并且由于未植入金属，可与磁共振成像（MRI）兼容，从而实现对活体动物脑损伤的监测。采用血管性认知障碍（VCID）针刺模型的主要挑战在于需要掌握高超的手术技能，因为小鼠的颈总动脉（CCA）直径不足0.6 mm，且极为脆弱。因此，高质量的手术可视化展示将有助于研究人员掌握该技术，推动对VCID的深入理解，并有望开发出新型治疗手段，以减轻与VCID相关的严重认知功能衰退。

引言

血管性认知障碍和痴呆（VCID）是导致认知功能下降的第二大原因。尽管在理解VCID发病机制及其风险因素方面已取得毋庸置疑的进展，但神经血管功能障碍如何导致认知能力下降的机制仍不明确。已有多种不同复杂程度的啮齿类动物模型被建立，用于诱导脑缺血，以模拟人类VCID的临床表现1。其中一些模型基于诱发短暂性脑低灌注；然而，大多数模型是通过诱导慢性脑低灌注建立的，后者是导致人类患者发生VCID的主要机制2。

慢性脑低灌注可通过双侧颈总动脉阻塞（BCAO）或双侧颈总动脉狭窄（BCAS）建立。BCAO可导致严重的缺血性损伤，但常引起动物死亡；而BCAS则是一种相对温和的方法。BCAS通常采用两种方式之一实施：一是在双侧颈总动脉（CCA）周围放置相同的微型线圈，造成对称性狭窄3；二是在左侧和右侧颈总动脉分别植入缩窄型夹（ameroid constrictor）和微型线圈，从而分别导致左侧和右侧颈总动脉逐渐闭塞，并使血流减少约50%4。这两种方法的缺点包括：若狭窄程度过重或颈总动脉完全闭塞，则死亡率较高；此外，由于体内存在金属材料，无法与活体动物磁共振成像（MRI）检查兼容。此外，已有少数遗传性小鼠模型被建立用于研究1,5,6,7,8。其他可选模型包括伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）小鼠模型9,10。然而，目前所有提出的模型均未能完全模拟人类患者所表现出的全部缺血性损伤特征，因此对更新的血管性认知障碍与痴呆（VCID）模型的探索仍在持续进行中。

本文介绍了一种在小鼠中诱导非对称性双侧颈总动脉狭窄（ABCS）的新型外科手术方法，该方法使用丝线缝合来实现颈总动脉（CCA）狭窄，并通过将不同直径的针头作为参照物进行结扎，随后立即取出针头以精确控制狭窄程度11。由此，特定直径的缝合环将永久留置于颈总动脉上，从而确保形成稳定的慢性狭窄。与对称性模型相比，ABCS的优势在于：右侧血流灌注减少程度较轻，有助于提高存活率；而左侧更显著的低灌注则可确保长期的神经功能和病理表型表现。该针头法相较于传统的双侧颈总动脉狭窄（BCAS）模型具有多项优势11，包括结果稳定、死亡率更低、成本极低、操作灵活，以及可采用特殊分析方法的可能性。

为了进一步说明这些优势，三次结扎会导致CCA出现节段性狭窄而非单点狭窄，从而在约90%的小鼠中引起持续性低灌注、白质损伤以及认知功能下降。采用针模型的小鼠死亡率约为17%，低于我们经验中Hattori所用的缩窄环/微线圈模型，后者在16周内的死亡率约为30%4。每只BCAS模型小鼠的成本通常约为100美元，原因是微线圈或缩窄环价格昂贵，而针模型每只小鼠的成本仅约1美元。此外，可根据研究对双侧血流限制的具体需求，调整所用针的规格。本文所介绍的该改良方法中，针模型模拟了严重颈动脉狭窄的病理生理过程，其特征为单侧永久性狭窄但未完全闭塞，这正是临床上该疾病最常见的表现形式11。此外，传统BCAS模型中使用的缩窄环和微线圈由金属制成，即使这些金属植入部位位于胸部而非脑部，在进行体内MRI 检查时仍可能产生显著的成像伪影。金属的存在对成像结果的具体影响可能难以准确预测。

通常，在植入微型线圈后进行的活体 MRI 主要为简单的解剖成像，不适合对多种损伤进行定量分析，而定量分析对于脑血管性认知障碍（VCID）研究极为重要。相比之下，本文介绍的针刺模型仅使用丝线缝合，且与任何类型的活体 MRI 完全兼容。这一点具有两个重要意义：（1）MRI 对微小脑损伤、微出血或表浅性含铁血黄素沉积具有极高的敏感性12，因此优于其他分析方法，如CT扫描；（2）相较于离体（ex vivo）MRI，应优先采用活体（in vivo）MRI，因为VCID研究无疑可从追踪病灶进展/愈合的动态变化中获益，尤其是在评估新型治疗方案的响应时。此外，可在针刺模型中进行功能MRI（fMRI），以深入揭示脑低灌注状态下神经血管耦合完整性的变化。因此，应用活体 MRI 的可能性为深入分析病灶大小与位置和认知功能以及神经血管耦合之间的复杂关联开辟了途径，尤其有利于药效动力学研究。

方案

所有动物实验方案均经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。所有可存活手术均须保持无菌操作。本研究中使用的实验动物为12周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重25-30 g。

1. 材料与工作空间的准备

  1. 准备针头碎片（约4 mm长；右侧CCA使用32 G，左侧CCA使用34 G）。通过将针尖轻轻敲击硬物表面使其略微钝化，并使用持针器小心地将针头从塑料部件上分离。将7-0丝线剪成1-2 cm长的小段。
  2. 通过高压灭菌或其他适当方法对手术器械、针头碎片和缝线进行灭菌。

2. 实施手术

  1. 称重小鼠，并通过将小鼠置于含有3%异氟烷与25%氧气混合气体通风的麻醉舱中2-3分钟以诱导麻醉2 和 72% N2O.
  2. 将小鼠（腹侧朝上）置于覆盖无菌手术单的加热垫上 以维持恒定的体温（37 °C），并使用含1%异氟烷与25%氧气混合气体的面罩进行通气固定2 和 74% N2O. 用胶带固定小鼠的四肢。
  3. 用电动剃须刀剃除颈部的毛发。使用胶带或键盘吸尘器清理细小的毛发。
  4. 消毒 用聚维酮碘溶液（10% 碘）对手术部位进行消毒。用70%乙醇脱碘。重复消毒3次。通过轻捏足趾无反应（足底反射消失）确认麻醉深度足够。
  5. 铺巾。然后沿气管做一垂直正中切口，用显微镊分离双侧甲状腺。用无菌小皮肤拉钩将皮肤和组织牵开。
  6. 在显微镜下，使用斜角镊子小心分离并钝性解剖一侧颈总动脉（CCA），避开迷走神经及其鞘膜。若颈总动脉易于与镊子粘连，可用无菌水或磷酸盐缓冲液（PBS）润湿切口部位。必要时，可在颈部下方放置一小塑料注射器以支撑体位。
    注意：务必小心，避免损伤颈总动脉（CCA）。
  7. 使用弯头镊子将三段预先剪好的丝线（7-0 规格）穿过颈总动脉下方（间距 1 mm）。
  8. 在一条缝合线碎片上，于颈总动脉（CCA）周围打一个非常松散的双结。
    注意：用无菌水或 PBS 润湿手术部位和缝线可能有助于打结。
  9. 将一段针头碎片（右侧CCA使用32 G，左侧CCA使用34 G）平行置于CCA内松散结内图1A）。小心收紧主结，将其扎紧在针头和颈总动脉（CCA）周围，直至观察不到血流，再用次级结固定。立即拔出针头以恢复部分血流，并剪除缝线末端。
    注意：打结完成后，外科医生在修剪缝线末端时必须格外小心。剪得离结太近可能导致结松脱。此外，在拔出针头后，必须观察颈总动脉（CCA）的情况，以确保结扎部位远端的血流仍然通畅。如果拔出针头后颈总动脉颜色显得非常苍白，说明颈总动脉受到过度压迫。
  10. 重复步骤 2.8–2.9，针对 2nd 和 3rd 同一颈总动脉上打结的缝合线，彼此间距约为1毫米（图1B).
  11. 使用32 G针头碎片，对另一侧CCA重复步骤2.6–2.10。
  12. 仔细检查两侧颈总动脉是否均被有效结扎：确认三条缝合线均牢固打结，但不可过紧，以免完全阻断血流（检查打结部位远端的颈总动脉是否未出现苍白）。确保每侧颈总动脉上的三个缝合结之间间距约为1 mm。
  13. 使用无菌单丝缝线缝合皮肤。
  14. 手术后立即腹腔注射100–150 µL酮洛芬（1 mg/mL储备液；5 mg/kg体重）以缓解术后疼痛。术后24小时和48小时各重复注射一次。
  15. 将小鼠置于37 °C恒温毯上，持续监测2小时，然后送回动物房。
    注意：进行假手术操作时，应省略步骤 2.7–2.12。

3. 模型验证

注意：脑损伤通过以下方法进行分析 体内 MRI 检测，并通过Luxol快蓝（LFB）染色和行为学实验进一步验证。

  1. 脑血流灌注成像。
    1. 使用1-1.5%异氟烷麻醉小鼠。用聚维酮碘溶液（10%碘）对术区进行消毒，随后用70%乙醇脱碘。
    2. 将动物颅骨固定于立体定位仪中，沿头皮正中矢状方向从前额骨至枕骨做切口以暴露颅骨，并用无菌生理盐水清洁颅骨表面。
    3. 使用二维激光散斑系统，在颅骨上方10 cm处放置一个电荷耦合器件相机。将探头架置于颅骨开窗部位并牢固固定。
    4. 在手术前5分钟及针头释放后立即，或术后第7、14、21、28、35和42天采集血流灌注图像。
    5. 使用无菌单丝缝线缝合皮肤。腹腔注射100–150 µL酮洛芬（储存液浓度1 mg/mL；剂量5 mg/kg体重）以缓解术后疼痛。分别在24小时和48小时后重复注射一次。
  2. 体内磁共振成像（MRI）
    1. 使用1-1.5%异氟烷麻醉小鼠，成像过程中持续监测呼吸，并通过暖风维持体温在37 °C。
    2. 使用9.4 T磁共振扫描仪、86 mm发射线圈和4通道小鼠脑部接收线圈阵列，并运行配套软件进行体内磁共振成像。完成定位及预扫描后，采用增强弛豫快速采集（RARE）序列获取T2加权图像（T2WI），参数如下：回波时间/重复时间（TE/TR）= 40/4,000 ms，平均次数 = 8，矩阵尺寸 256 × 256，16层切片，层厚0.5 mm，RARE因子 = 4，视野（FOV）为 20 × 20 mm。
    3. 采用与T2WI相同几何参数和设置的回波平面成像（EPI）-DTI序列采集扩散张量成像（DTI）数据，但以下参数除外：TR/TE = 2,300/22 ms，采集矩阵 = 128 × 128，2个分段，5张A0图像，30张非共线性扩散图像，Δ/δ = 10/3 ms，b值 = 1,000 s/mm2。
    4. 使用DSI Studio软件 （http://dsistudio.labsolver.org/）分析DTI数据，观察扩散标量参数的差异（包括各向异性分数（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散率（AD）和径向扩散率（RD））。在双侧半球的胼胝体（CC）、外囊（EC）、内囊（IC）、穹窿（Fimbria）、前连合（AC）、扣带（Cing）、海马（hippo）、皮层（C）、纹状体（Str）等区域绘制感兴趣区（ROIs）。
  3. 劳克坚牢蓝（LFB）染色
    1. 制备脑切片：将脑组织用4%多聚甲醛（PFA）固定24小时，随后浸入30%蔗糖溶液直至脑组织沉底。将脑组织置于OCT包埋剂中并在干冰上冷冻包埋。使用滑动式切片机切割20 µm厚的冠状脑切片。将脑切片保存于储存液（含30%甘油和30%乙二醇的PBS溶液）中。
    2. 将脑切片浸入LFB染液（0.1%醇溶液）中，56 °C下孵育过夜，随后用蒸馏水冲洗。
    3. 将脑切片在0.05%碳酸锂溶液中孵育，并通过梯度乙醇脱水。
    4. 用0.5%焦油紫染色5分钟，随后用70%乙醇分化。
    5. 使用封片介质封固染色后的脑切片。
  4. 采用改良莫里斯水迷宫实验评估认知功能
    1. 将一个圆形水箱注满水（25 oC，水深33 cm），并将一个约10 × 10 cm2的方形有机玻璃平台淹没于水面以下1.2 cm处，平台位于水池北、东、南或西边缘向内31 cm的位置。
      注：在整个测试期间，该平台应保持在同一位置。
    2. 打开天花板上安装的视频摄像机。将小鼠放入水箱中（不要从水面直接松手释放），使其面朝池壁，起始位置为东北、东南、西南或西北象限之一。允许小鼠最多游泳90秒以寻找隐藏平台。
    3. 若小鼠找到平台，允许其在平台上停留30秒；若未找到，则手动将小鼠放置于平台上停留30秒。
    4. 让小鼠休息5分钟后，重复游泳试验（步骤3.4.2 – 3.4.3）2次。
    5. 用布将小鼠擦干，并将其放回笼中，在加热灯下保暖。
    6. 连续5天，每天重复3次游泳试验。
    7. 根据视频记录，计算每次试验中小鼠逃逸潜伏期（即找到平台所需时间）。
    8. 在测试的最后一天，移除平台，记录小鼠在原平台所在象限停留的时间。

结果

长期不对称性脑低灌注
如前所述11，在最后一次（第三次）结扎后立即拔出针头时，测量颈总动脉（CCA）血流量。左侧CCA血流量减少约70%，右侧CCA血流量减少约50%。采用二维激光散斑技术动态监测脑血流灌注。手术导致双侧大脑半球均出现脑低灌注，其中左侧半球受损更为严重（图2）。术后至少24周内，脑低灌注状态持续存在11。

较低的死亡率
雄性小鼠术后6周以上的存活率为81.6%（图3）；小鼠在术后第一周内更易死亡。

体内 MRI 检测脑损伤
T2 加权成像显示，接受 ABCS 手术的小鼠海马（Hippo）、外囊（EC）、内囊（IC）、胼胝体（CC）和纹状体（Str）出现低信号或高信号区域，提示存在脑损伤（图 4A）。与假手术组相比，ABCS 小鼠的弥散张量成像（DTI）各向异性彩色编码图（DEC 图）中可见结构损伤（图 4B）。

定量分析显示，与假手术组相比，ABCS小鼠左侧海马（Hippo）、内囊（IC）、前联合（AC）、扣带束（Cg）和穹窿伞（Fi）的分数各向异性（FA）显著降低（P < 0.05）。 < 0.05 对照假手术组），表明左侧半球白质微结构受损（左上图） 图4C）。ABCS 小鼠右侧 Cg 中的 FA 和 Fi 也减少（P < 0.05 对照假手术组）。ABCS 小鼠左侧内囊的 FA 值和 Fi 值显著低于右侧（P < 0.05，左侧与右侧比较）。

类似地，与假手术组相比，ABCS小鼠左侧内囊（EC）、内侧丘脑（IC）、尾状壳核（Str）和海马伞（Fi）的轴向扩散系数（AD）显著降低，提示存在轴突损伤（右上图，图4C（P < 0.05，与假手术组比较））。仅在左侧尾状壳核（Str）观察到ABCS小鼠的平均扩散系数（MD）较假手术组降低（左下图，图4C）。ABCS小鼠左侧胼胝体（CC）、尾状壳核（Str）和海马伞（Fi）出现径向扩散系数（RD）差异（右下图，图4C），提示这些区域存在炎症反应及细胞密度增加13。

两侧大脑半球的不对称性脑损伤以及左侧半球白质区域的损伤
采用先前描述的方法进行LFB染色，进一步分析脑损伤情况14（图5）。低倍镜图像显示内囊（EC）和纹状体（Str）区域呈较浅的蓝色染色，提示这些区域存在脱髓鞘现象。高分辨率图像显示，假手术小鼠在内囊区域呈现结构有序且充分髓鞘化的轴突，少突胶质细胞呈线性排列；而在ABCS小鼠中，内囊区域的轴突消失，并可见广泛分布的蓝色染色细胞。假手术小鼠在纹状体区域显示出深蓝色染色且结构完整的纤维束；然而，在ABCS小鼠中，纤维束染色变浅、体积缩小，完整性受损，部分纤维束出现空泡样改变。在ABCS小鼠的前连合（AC）区域，纤维束结构扭曲，束间基质显著增厚。综上所述，ABCS手术可导致轴突脱髓鞘及结构损伤，白质损伤主要发生在左侧半球。

学习与记忆功能障碍
针刺ABCS手术导致显著的学习能力障碍，表现为在莫里斯水迷宫实验中找到淹没平台所需时间延长（逃逸潜伏期）（图6）。该功能障碍在手术后至少持续24周。记忆功能也受到显著影响，表现为平台移除后在目标象限停留的时间明显减少。

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图1：创建不对称双侧颈总动脉狭窄（ABCS）的针刺手术步骤。（A）暴露左侧颈总动脉（CCA），并将三根丝线穿置于CCA下方。在其中一根丝线末端打一松结，并将针平行置于CCA旁。（B）三个结扎环之间间隔约1 mm。缩写：ABCS = 不对称双侧颈总动脉狭窄；CCA = 颈总动脉。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2针刺ABCS模型中持续存在的脑部血流灌注不对称 术后脑血流的动态监测。双侧大脑半球均可见持续性脑低灌注，以左侧更为显著。黑色星号标记低灌注区域。缩写：ABCS = 不对称性双侧颈总动脉狭窄。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：针刺ABCS手术后的生存率。 手术后6周内的生存率为81.6%；死亡主要发生在术后第一周。缩写：ABCS = 不对称性双侧颈总动脉狭窄。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4: 体内 MRI检测针刺ABCS模型中的脑损伤。（A）假手术组和ABCS小鼠的代表性T2加权图像。红色箭头指示低信号或高信号区域。（B）针刺ABCS手术后2周的体内弥散张量成像（DTI）代表性方向编码彩色（DEC）图。颜色表示扩散主轴的方向性（红色=左右方向，绿色=背腹方向，蓝色=头尾方向）。（C）假手术组与ABCS小鼠的定量分析（单因素方差分析）。*表示ABCS组与假手术组相比p < 0.05（左侧半球）。#表示左侧与右侧相比p < 0.05。&表示ABCS组与假手术组相比p < 0.05（右侧半球）。数据以均值±标准误表示；假手术组n = 4，ABCS小鼠n = 4。缩写：ABCS = 不对称双侧颈总动脉狭窄；Hippo = 海马；EC = 外囊；IC = 内囊；CC = 胼胝体；Str = 纹状体；DEC = 方向编码彩色；DTI = 弥散张量成像；FA = 分数各向异性；MD = 平均弥散率；AD = 轴向弥散率；RD = 径向弥散率。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：代表性 针刺ABCS术后6周脑切片的LFB染色. (A假手术组和ABCS小鼠脑组织LFB染色的低倍镜图像。白色方框标示对应于高倍镜图像的位置 B. (B) EC（上图）、Str 1 和 Str 2（中图）以及 AC（下图）区域的高分辨率图像（200x）。黑色箭头指示正常纤维束，蓝色箭头指示受损纤维束，红色箭头指示空泡化纤维。比例尺 = 1 mmA), 100 µm (B缩写：ABCS = 单侧颈总动脉不对称性双侧狭窄；LFB = 露珠蓝；EC = 外囊；Str = 纹状体；AC = 前连合。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图6水迷宫实验中空间学习与记忆能力的评估 空间学习能力 评估（A）3 周和（B手术后24周，通过连续数天测量找到平台所需的时间来评估记忆功能。C）4 周和（D手术后24周，通过测量平台移除后在目标象限停留的时间来评估认知功能。手术导致认知功能长期受损。数据以均值表示 ± SEM，*p < 0.05 针刺组与假刺激组；**p < 0.01 与假手术组相比；双因素方差分析（two-way ANOVA）及 Neuman-Keuls 事后检验。假手术组 n = 10，针刺组 n = 10。该图已根据 Weng 等人的研究修改。11. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

已有多种利用不对称颈总动脉（CCA）狭窄诱导血管性认知障碍与痴呆（VCID）的方法被报道，这些方法均包含一个关键且重要的手术步骤——将颈总动脉与迷走神经及其周围鞘膜分离，并暴露颈总动脉，以便进行狭窄处理。尽管我们已在结扎前提供了高质量的颈总动脉暴露手术可视化指导，但仍建议研究人员参考观看其他在线可用的与小鼠和大鼠手术相关的颈总动脉分离视频15,16,17,18。在操作过程中需格外小心，避免压迫或损伤颈总动脉，因其是向大脑供应该含氧血液的主要动脉。

手术中另一个需要掌握的关键步骤是先打一个松结，然后用针将结进一步收紧固定在颈总动脉（CCA）上，接着移除针头。我们强烈建议在尝试对麻醉小鼠进行操作之前，先仅使用针头单独练习这一步骤。这有助于熟练掌握精细的镊子操作，并完善对缝线的操控技巧，同时避免伤害小鼠的风险。打结必须牢固，确保在移除针头时不会松脱；结的松紧度应适中，既要足够紧以固定针头，又要足够松，以便能用镊子将针头从打结的缝线上滑离。

重要的是，我们发现对每侧颈总动脉（CCA）进行单次结扎不足以可靠地减少血流量并维持长期的脑低灌注11。一种可能的解释是，单次结扎会导致点状狭窄，这可能引起局部压力升高，从而通过增加血流速度来代偿血流量的减少。我们建议进行三次结扎，每次结扎之间相距约1 mm，以形成一段狭窄区域。使用三次结扎的另一个优点是，若在移除针头过程中有一个结松脱，其余结扎可起到保险作用。事实上，通过三次独立结扎同一侧颈总动脉所形成的狭窄段可提高模型的一致性，使约90%的小鼠出现持续性脑低灌注。此外，与局灶性点状狭窄相比，节段性狭窄更精确地模拟了人类患者由动脉粥样硬化引起的颈总动脉狭窄，从而提高了该针法模型的临床相关性。

我们强烈建议在完成第一处结扎后立即拔出缝合针，以确保颈总动脉（CCA）血流部分恢复，之后再依次进行第二和第三处结扎。不建议在缝合针同时穿过全部三个结扎点的情况下完成所有三处结扎，因为这将显著延长完全阻断血流的时间。通常情况下，我们不建议在拔出缝合针前完全阻断颈总动脉血流超过1分钟。该建议基于已有文献报道：小鼠在经历3次、每次60秒的双侧颈总动脉阻断后，未表现出任何功能损害的迹象19。在我们的模型中，外科医生每次仅操作一侧颈总动脉，相较于双侧同时阻断，容错性更高；但我们仍建议遵循此时间规范，以排除因长时间阻断所致的干扰因素，而非单纯由单侧慢性低灌注引起的结果。

尽管该针模可通过使用不同直径的针（根据体重或血流限制的具体要求）来调整打结缝线的直径，但根据我们的经验，当右侧半球低灌注程度为中度而非重度时，小鼠的存活率更高。另一方面，左侧半球持续重度低灌注则会导致长期的病理和神经学后果。因此，我们建议采用不对称结扎法：使用较粗的针结扎右侧颈总动脉（导致右侧半球中度低灌注），而使用较细的针结扎左侧颈总动脉（导致左侧半球重度低灌注）。

最后，研究人员应当意识到，不同的小鼠品系在缺血或创伤性损伤后可能产生不同的结果，这主要是由于脑血管解剖结构的差异所致20,21。由于当前许多研究需要构建新型转基因小鼠，如果实验设计中任何阶段需进行BCAO手术，则必须仔细考虑背景品系的选择。例如，C57BL/6和SV129品系是目前用于脑卒中研究的转基因动物构建中常用的背景品系21。然而，已有充分文献表明，与其他测试品系（包括SV129小鼠）相比，C57BL/6小鼠对缺血更为敏感20,21。事实上，有证据显示，小鼠品系的影响甚至可能超过诱导VCID所用技术本身的影响21。因此，在所有涉及诱导啮齿类动物脑缺血损伤的实验中，保持小鼠背景品系的一致性至关重要。重要的是，研究人员可采用神经功能评分系统22在活体动物中评估手术效果，并将评分达到0.5作为纳入标准。此外，可通过Iba1免疫染色进一步确认脑损伤情况，该方法对脑损伤极为敏感，即使在轻微的局灶性损伤后也能检测到变化。

总之，重要的是要认识到，VCI 是一个复杂的术语，涵盖了多种临床表现和病因。因此，研究人员应始终牢记，应根据拟研究的 VCI 特征来选择合适的模型。不存在一种适用于所有 VCI 表现形式的通用模型。颈总动脉（CCA）狭窄模型会严重限制主要动脉的血流，从而模拟动脉粥样硬化性狭窄患者的情况。在 C57BL/6J 小鼠中采用新型针刺法建立不对称性双侧颈总动脉狭窄（BCAS）是一种可靠的血管性认知障碍（VCID）模拟方法，相较于既往报道的方法具有多项优势（尤其是高灵活性、低死亡率、可评估长期结局、成本低廉以及可进行活体 MRI 监测）。由于其相较于其他模型的优越性，该方法可用于进一步深化对 VCID 进展机制的认识，并为筛选潜在治疗药物以治愈或延缓 VCID 进展提供基础。与已报道的其他 BCAS 方法类似，针刺法需要较高的外科手术技能，但通过本视频演示作为指导，经过一定时间的训练后可逐步掌握。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目由美国国立卫生研究院/神经疾病与中风研究所资助，项目编号 RF1NS117509（G. Cao），以及美国退伍军人事务部杰出研究资助 BX003923 和 BX006454（G. Cao）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309659用于酮洛芬的腹腔注射
2.5 mm 钝头牵开器头端Kent Scientific CorporationSURGI-5016-2需要 2 个
Andis Ion T-Blade 宠物修剪器AndisBTF3用于剃除毛发
聚维酮碘溶液 Avrio Health L.P.NDC 67618-150-17
编织丝线缝合线，5-0 规格Teleflex Medical106-S用于皮肤缝合
编织丝线缝合线，7-0 规格Teleflex Medical103-S用于结扎颈总动脉（CCA）
摄像头Med Associates, IncVID-CAM-MONO-7用于模型验证
盖玻片Fisherbrand12-541-012用于模型验证
焦油紫Thermo ScientificC581-25用于模型验证
分配针头，柔性，34 号，1/4" 总长Jensen GlobalJG34-0.25HPX用于左侧颈总动脉（CCA）
DSIStudiohttps://dsi-studio.labsolver.org；用于 DTI 数据分析
Dumont 镊子；1 号型号Roboz Surgical Instrument CoRS-4960需要 2 个
Dumont 镊子；5 号型号，45 度角Roboz Surgical Instrument CoRS-5058需要 2 个
乙醇Fisher Scientific64-17-5稀释至 70%
乙二醇Thermo ScientificE178-4用于模型验证
圆针，4 号；3/8 圆弧，刃口，弦长 11 mmRoboz Surgical Instrument CoRS-7981-4用于皮肤缝合
E-Z Anesthesia Classic 系统E-Z systemsEZ-7000
甘油Thermo ScientificAAA16205AP用于模型验证
恒温监测系统Harvard BioscienceK 022258
EVOS FL Auto 成像系统Life TechnologiesAMAFD2000用于模型验证
异氟烷Covetrus11695-6777-2
酮洛芬Zoetis5487
Leica M320 F12 临床与手术显微镜LeicaM320 F12
利多卡因和丙胺卡因乳膏，USP 2.5%/2.5%PadagisNDC 0574-2042-30与 EMLA 乳膏通用
碳酸锂Thermo ScientificL119-500用于模型验证
Luxol 快蓝染料Thermo ScientificAC212170250用于模型验证
显微镜载玻片Fisherbrand12-550-403用于模型验证
切片机LeicaSM2010R用于模型验证
带隐藏平台的 Morris 水迷宫Maze Engineershttps://maze.conductscience.com/portfolio/morris-water-maze/
M-Prove 便携式天平SartoriusAY711用于称量小鼠体重
MRI 配 ParaVision 6.0.1 BrukerAV3HD 9.4T用于模型验证
多气体流量计 Aalborg InstrumentsGMR2-010334用于低流速气体混合（N₂O 和 O₂）
Nano 超细笔式针头 - 32G 4mmBD58320883用于右侧颈总动脉（CCA）
O.C.T. 包埋剂Thermo Scientific23-730-571用于模型验证
4% 多聚甲醛Thermo ScientificJ61899.AK用于模型验证
PBS 缓冲液Thermo ScientificBP399500用于模型验证
PeriCam PSI 系统配 Aperiflux 探头支架 Perimed IncPeriCam PSI HR用于模型验证
Permount 封片剂Thermo ScientificSP15-100用于模型验证
圆柄镊子；带打结平台的微缝合镊；弯型Roboz Surgical Instrument CoRS-5264辅助皮肤剪切与缝合
小型动物加热灯，75 瓦Morganville ScientificHL0100用于模型验证
小型棉签Fisher Scientific23-400-118
弹簧剪刀 - 8mm 刃口Fine Science tools15024-10
学生型 Halsey 缝合针持Fine Science tools91201-13需要 3 个：2 个用于固定皮肤牵开器，1 个用于皮肤缝合
蔗糖Thermo ScientificA15583.36用于模型验证
通用摄像头天花板支架Med Associates, IncENV-598用于模型验证
水浴锅VWR89032-226用于模型验证

参考文献

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