从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

摘要

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。

摘要

线粒体分离技术已有数十年历史，最初由分子生物学和生物化学领域的先驱建立，用于研究代谢障碍和疾病。要准确研究线粒体生理学和生物能量学，必须获得质量稳定的线粒体；然而，目前已有多种不同的线粒体分离方法见于文献。尽管不同的实验策略需要采用不同的分离方法，其基本原理和操作步骤相似。本方案详细描述了一种可从多种组织来源（包括小型动物和细胞）中提取功能良好偶联线粒体的方法。具体步骤包括器官解剖、线粒体纯化、蛋白质定量以及多项质量控制检测。用于鉴定高质量线粒体的主要质量控制指标是呼吸控制比（RCR）。RCR是指氧化磷酸化状态下的呼吸速率与无ADP存在时呼吸速率的比值。本文也讨论了其他可选的质量评估指标。采用本方案可获得相对于其组织来源而言较高的RCR值，同时多个步骤可根据研究人员的具体需求进行优化。该方法稳定可靠，在多种动物模型和组织来源中均能 consistently 获得高于平均水平的RCR值。

引言

线粒体是一种亚细胞器，能够建立适合特定细胞功能的胞质能量环境。尽管细胞、组织和生物体水平的研究可为线粒体功能提供见解，但分离线粒体能够实现其他方法无法达到的实验控制水平。自20世纪40年代以来，人们已开展线粒体分离工作，从而可在多种细胞和组织中对代谢和呼吸作用进行机制性研究^1,2。线粒体的历史重要性也已有充分记载³。作为ATP的主要生产者，线粒体在维持细胞和器官最佳功能方面发挥着多种关键作用⁴。在线粒体基质内，底物通过三羧酸循环（TCA循环）被氧化，产生还原当量以及NADH和UQH₂等可移动电子载体^5,6。细胞色素C是线粒体生化反应网络中的第三种主要可移动电子载体⁷。这些分子随后被嵌入线粒体内膜的电子传递系统（ETS）跨膜复合物所氧化⁸。ETS的氧化还原反应与质子从基质向膜间隙的转运相偶联。这些过程建立起电化学质子梯度，该梯度被F₁F₀ ATP合酶用于将ADP与Pi磷酸化，从而生成ATP^9,10。利用克拉克型电极或微孔板氧消耗测定法进行高分辨率呼吸测定，可深入探究每个复合体中发生的独立过程^11,12。此外，使用分离线粒体构建疾病模型及开展治疗研究，有助于确定线粒体功能在某些病理进展中的影响或重要性。这一方法在心脏病学领域已取得丰硕成果，通过改变燃料和底物的供给，阐明了线粒体功能障碍如何影响心力衰竭的发展^13,14,15,16。线粒体还被证实影响糖尿病、癌症、肥胖、神经系统疾病和肌病等其他疾病状态的发展^17,18。因此，使用分离或纯化的线粒体可对来源组织中的氧化代谢和ATP生成机制进行深入研究。

由于线粒体分离方案在生物能量学研究中的重要性，相关方法并不缺乏。此外，还可找到针对组织和细胞内线粒体亚群的高度特异性方法^19,20。不同分离方法的基本操作步骤相似，但可通过调整缓冲液组成、匀浆步骤和离心条件来提高线粒体的得率和质量。这些调整取决于组织的代谢需求、整体器官功能、线粒体密度及其他因素。在肝脏和骨骼肌等组织中，通常使用手持式匀浆器以维持线粒体完整性，并限制对线粒体膜的损伤²¹。然而，在从肾脏中分离线粒体时，一些方案建议采用手动匀浆或商用试剂盒以获得更优结果²²。尽管两种方法均可获得具有功能的线粒体，但使用这些方案所需时间较长，可能导致细胞器质量下降。离心在提取线粒体蛋白过程中也至关重要，因为它可将细胞核和其他细胞器与线粒体分离²³。在分离过程中，应采用差速离心还是密度梯度离心以获得更纯的线粒体，目前仍存在争议²⁴。虽然密度梯度离心能够将线粒体与过氧化物酶体等具有相似比重的细胞器分开，但尚不明确采用该方法分离的线粒体是否比差速离心法更能真实反映体内线粒体的功能状态。在线粒体生理学领域，密度梯度离心更受青睐，且易于调整以提高分离纯度。由于离心力（g值）、离心时间及离心次数的变化会显著影响线粒体纯化效果，因此在实验前应充分考虑是否引入这些参数的调整。此外，线粒体重悬—— arguably 分离过程中最关键的步骤——在不同研究中差异显著，包括刮取、涡旋混匀或再次匀浆等方式^23,25,26。此类机械性重悬操作可能过于剧烈，损害线粒体膜的完整性。因此，应采用轻柔的洗涤方式加以纠正。尽管存在大量改良方案和推荐方法，但适用于啮齿类动物模型、兼具高重复性和广泛适应性的综合性实验方案仍较为有限。

本文所述方法提供了一种详细、稳健且高度可重复的实验方案，可从小型动物心脏组织中分离出高纯度、功能完整的线粒体。如文中所示，该方法可轻松调整，以适应不同实验需求或实验室条件，用于从肾脏、肝脏及培养细胞中分离线粒体。此外，还可进一步修改本方案，以适用于本文未列出的其他组织和动物来源的线粒体分离。所有分离步骤所用缓冲液配方均已提供，可根据需要进行调整。与其它已发表的方案类似，本方法采用电动匀浆和差速离心技术；然而，针对不同组织来源，对剪切时间和离心力进行了优化调整，以确保 consistently 获得高质量的线粒体分离产物。值得注意的是，本方案与其他方法的区别在于采用了温和的洗涤步骤 通过 用移液器重悬沉淀的线粒体，有助于保持线粒体膜的完整性并维持细胞器的整体功能。线粒体蛋白含量可通过总蛋白测定或柠檬酸合酶活性检测进行定量。该分离方法的实用性和广泛适用性进一步得到了来自多种生物体和组织来源所获得的呼吸控制比（RCR）数值的支持。

方案

所有脊椎动物的使用和处理均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案进行。本方案使用雄性和雌性哈特利白化豚鼠以及斯普拉格-道利（SD）大鼠。用于分离心脏线粒体的豚鼠在4-6周龄（300-450 g）时处死。两性SD大鼠的心脏线粒体在10-13周龄（250-400 g）时获取。缓冲液的配方见表1，应提前配制。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 实验准备

1. 开始分离前，将两个50 mL离心管标记为 "自旋1和2" 和 "离心 3".
2. 将离心管、新解冻的分离缓冲液（IB）、锋利的剪刀、组装好的匀浆探针以及5 mL烧杯或同等大小的容器置于冰上。
3. 将新解冻的呼吸缓冲液（RB）放入孵育器中预热，用于后续呼吸测定实验。
4. 将制冷离心机预冷至 4 °C。
5. 确保所有设备已妥善放置，并加入 20 µL 浓度为 7–15 U/mg 的蛋白酶 枯草芽孢杆菌 已加入标记为的试管中 "自旋1和2".
6. 建立重力依赖性灌注压力系统 通过 使用心脏停搏液（CB, 表1），玻璃导管，以及带止流阀的塑料管。
7. 准备手术器械，包括适用于心脏解剖和插管的适当剪刀和镊子。
   注意：所有用水均应为高纯度水（18.2 MΩ·cm）

2. 组织解剖

1. 以每公斤体重500 U的剂量，向动物腹腔内注射无菌肝素硫酸盐。
2. 肝素给药后，将动物置于诱导室中静置15分钟。在此期间，以2 L/min的流速供应纯O₂气体，以充分氧合动物，使其镇静，并尽量减少可能对目标组织产生不利影响的应激反应。
3. 以0.5%的异氟烷持续气流开始麻醉诱导。1分钟后，将浓度提高至1%。此后每分钟增加1%，直至达到5%。达到5%后，等待1分钟，并监测动物的呼吸模式。
4. 当呼吸变慢且变得费力时（约在第6.5分钟），关闭异氟烷和氧气气流。
5. 迅速将动物从诱导室中取出，通过捏压足爪并检查角膜反射来判断麻醉深度。若动物对任一刺激有反应，则将其放回诱导室，重新给予麻醉，并重复麻醉深度检查。
6. 一旦达到适当的麻醉深度，立即使用断头器快速断头，切断颈椎，并将俯卧位的尸体置于冰上。
7. 从锁骨处开始，沿侧肋骨向下做两条平行的纵向切口，贯穿整个胸腔长度。确保切口足够深，以切开侧胸壁的肋骨，但避免损伤心脏或大血管等胸腔内结构。
   注：纵向切口的大小取决于所用动物种类。若使用豚鼠和大鼠，应切至膈肌（大鼠约6.35 cm，豚鼠约11 cm）。若使用小鼠，则进行标准开胸术²⁷。
8. 使用止血钳移开前胸壁，暴露心脏，并用冰填充暴露的胸腔。此步骤可最大限度缩短热缺血时间，提高分离细胞器的活性。
9. 使用镊子钝性分离胸腺和心包膜，充分暴露心脏。
10. 用镊子对心脏施加轻柔的向下牵引力，以暴露并识别主动脉。主动脉是从心脏基底部发出的最粗大的大血管。其他大血管（如肺静脉）明显比主动脉更透明。
11. 在主动脉根部上方约4–6 mm、颈动脉分支点下方处剪断主动脉。
12. 插管主动脉，并利用重力驱动的压力头，用冰冻的心脏停跳液（CB）溶液灌注心脏^28,29，直至冠状动脉内血液被清除，器官呈现苍白外观。
    注：对于大型啮齿类动物，推荐使用直径为1.8–2.2 mm的导管；对于小型啮齿类动物，建议使用直径为1.4–1.8 mm的导管。逆行灌注应在15–30秒内完成，以清除冠状血管内的血液。
13. 通过解剖去除心房、软骨性瓣膜组织和脂肪组织，分离心室心肌。
14. 将心室组织放入预冷的10 mL烧杯中，内含0.1–0.2 mL冰冻IB溶液。
15. 用锋利的手术剪将组织剪碎，直至组织块大小约为1 mm³。

3. 线粒体纯化与蛋白质定量

1. 将剪碎的组织转移至预冷的离心管中，该管已标记为"Spins 1 and 2"，并含有蛋白酶溶液。
2. 加入冰浴的 IB 缓冲液，使终体积达到 25 mL。
3. 使用电动手持转子-定子匀浆器，在冰上以 18,000 rpm 的速度分散组织 20–25 秒。
4. 将匀浆后的组织在标记为"Spins 1 and 2"的离心管中，于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
5. 倾倒上清液（含蛋白酶）至废液瓶中，并用 5 mL IB 缓冲液轻轻冲洗沉淀，以去除残留的蛋白酶。
6. 弃去冲洗液后，用新鲜的冰浴 IB 缓冲液轻柔涡旋重悬沉淀，终体积为 25 mL。
7. 在 4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟。
8. 小心倾倒上清液（含有线粒体）至预冷的 50 mL 离心管中，该管已标记为"Spin 3"。倾倒时注意避免扰动沉淀上层松散部分。也可选择使用移液管或排枪收集上清液。
9. 将上清液在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
10. 弃去所得上清液，保留含线粒体的沉淀。
11. 使用无尘擦拭纸吸除离心管内壁多余的上清液，注意避免扰动沉淀。尽可能将沉淀保持在 4 °C 冰上。
12. 为重悬线粒体，向离心管底部加入 80 µL 冰浴的 IB 缓冲液。通过反复用 IB 缓冲液冲洗沉淀，轻柔地重悬沉淀。
13. 为避免产生气泡，将微量移液器设置为吸取和释放 40–60 µL 的体积。
14. 随着线粒体沉淀逐渐分散，可逐步增加微量移液器的吸液体积，以更高效地重悬沉淀的线粒体。避免移液器吸头接触沉淀，同时避免产生气泡。
15. 重悬完成后，将线粒体转移至预冷的微量离心管中，并标记为线粒体储备液。记录总重悬体积。
16. 为测定样品中线粒体蛋白浓度，按照制造商说明书使用经典的 BCA 或 Bradford 蛋白定量法进行总蛋白检测。
    注意：评估产量的另一种或补充策略是测定柠檬酸合酶活性。作为参考，可通过参照 Vinnakota 等人³⁰描述的方案来定量线粒体含量。

4. 质量控制检查

1. 在预冷的微量离心管中，用 IB 将线粒体储备液稀释至所需的工作浓度。
   注意：当使用心脏组织分离的线粒体进行呼吸测定实验时，通常将线粒体储备液稀释至 40 mg/mL，以获得 0.1 mg/mL 的终浓度。
2. 用蒸馏水将氧电极室、塞子和微量注射器冲洗十次，以在呼吸测定实验前清洁这些部件。
3. 为检测线粒体分离物的活性和质量，向氧电极室中加入 2.3 mL 呼吸缓冲液（RB），并在 37 °C 下使氧气消耗信号平衡约 10 分钟，或直至消耗速率接近 0。
4. 信号平衡后，压下塞子，并吸除从塞子毛细管中溢出的多余缓冲液。
5. 使用微量注射器加入 1 mM EGTA，以螯合缓冲液或线粒体样品中任何残留的钙离子。
6. 为驱动呼吸，加入 5 mM 丙酮酸钠和 1 mM L-苹果酸。
7. 加入底物后，加入一定量的稀释线粒体以达到工作浓度，并允许呼吸进行 5 分钟。此阶段称为 LEAK 呼吸或状态 2 呼吸。
8. 在第 5 分钟时，加入 500 µM ADP 的脉冲量以启动状态 3 呼吸（也称为 OXHPOS），并允许线粒体呼吸直至缺氧。
9. 通过将状态 3 期间的最大氧气消耗速率除以状态 2 中加入 ADP 前的氧气消耗速率来计算呼吸控制比（RCR）（见 图 1）。
   注意：也可使用另一种 RCR 表达方式 1 - 1/RCR 作为质量指标，其值介于 0 和 1 之间；然而，当 RCR > 10 时，使用该指标难以区分质量差异（见 图 2）。
10. 用纯水将电极室和塞子冲洗 10 次，以清洁氧电极装置供后续实验使用。若呼吸测定已结束，则将电极室中充满 70% 乙醇，并将塞子置于电极室内，直至下次使用。

结果

线粒体分离完成后，应检测分离物的质量和功能特性 通过 量化氧气消耗速率（J_O₂) 使用高分辨率呼吸测定法进行检测。为此，将线粒体储备液稀释至40 mg/mL，以便在所有使用分离心肌线粒体的呼吸测定实验中，于2 mL呼吸缓冲液（RB）中获得0.1 mg/mL的工作浓度。呼吸底物包括5 mM丙酮酸钠和1 mM L-苹果酸，并添加1 mM EGTA（一种钙螯合剂），体系平衡5分钟以建立状态2呼吸。在此状态下，耗氧速率应平均为45–55 pmol/mL/s或27–33 nmol/mg/min。需注意电极本身可能引起的耗氧，必要时应进行相应的背景校正。在5分钟时点，通过一次性加入500 µM ADP启动氧化磷酸化（状态3）。底物添加步骤及代表性呼吸轨迹详见 图1功能正常的线粒体会立即增加J_O₂ 加入ADP后，其浓度范围根据组织来源而定，如图所示 图2不使用EGTA时，残留钙对J的最大速率具有可变的影响_O₂ 在OXPHOS过程中，结果会因线粒体浓度、底物可利用性及其他环境因素而有所不同。缓冲液的组成对于维持线粒体膜的完整性和功能至关重要。本方案中提及的所有缓冲液配方均在后续部分详细说明。 表1 并可用于本文所述的所有线粒体制备方法。

线粒体成功分离的标志是获得的呼吸控制率（RCR）值落在每种物种和组织来源的给定范围内，如表2所示。根据使用本方案收集的数据，若从豚鼠、大鼠或小鼠心脏中分离线粒体，其RCR值应分别≥16、≥8和≥5。若从大鼠肝脏或肾脏中分离，RCR值应≥6；而细胞来源的线粒体RCR值高于3.8即视为可接受。如果RCR值低于上述范围，或呼吸测定曲线出现定性差异，建议使用新的呼吸缓冲液（RB）和底物重新进行一次额外检测，以排除污染等因素的影响。尽管1-1/RCR转换可将数值限制在0至1之间，但当RCR值大于10时，不建议使用该指标来比较不同性别或物种间的线粒体质量。因此，在所有实验中均采用标准RCR值（State 3/State 2或OXPHOS/LEAK）进行定量分析。有关对该方案进行调整以更优地分离小鼠心脏、肝脏、肾脏及细胞中线粒体的信息详见表3。

图1：利用高分辨率呼吸测定法进行质量控制检查的关注区域。 呼吸室中加入2 mL RB缓冲液，并在37 °C下平衡，直至耗氧速率接近0。平衡后，加入1 mM EGTA（一种钙螯合剂）、5 mM丙酮酸钠和1 mM L-苹果酸。在加入这些底物后，将线粒体以所需的工作浓度（0.1 mg/mL）加入，并允许其呼吸5分钟，以达到State 2呼吸状态（黄色）。在5分钟时间点，加入500 µM ADP以启动State 3呼吸（红色）。通过时间平均红色和黄色框所示的耗氧速率来计算呼吸控制比（RCR），以比较State 3与State 2。绿色框表示State 4，代表胞质ATP酶对ATP的水解阶段，可用于细胞色素C实验中外膜完整性的评估。所示数据使用SD大鼠心脏线粒体制备获得。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：不同动物及组织来源的代表性 J_O2 轨迹图与呼吸控制比。 通过高分辨率呼吸测定法定量检测氧气消耗速率，以评估分离线粒体的质量。呼吸底物为 5 mM 丙酮酸钠和 1 mM L-苹果酸，并在 1 mM EGTA 存在下进行。加入底物和线粒体后，允许呼吸 5 分钟，使 State 2 呼吸状态趋于稳定。在加入 ADP 后测定最大耗氧速率，并与加入 ADP 前的 State 2 耗氧速率进行比较，以计算各组织的呼吸控制比（RCR）。进一步通过计算 1-1/RCR 值来评估线粒体质量，该值符合 P-L 控制效率标准。每条轨迹图右侧的柱状图表示特定组织中雄性（蓝色）和雌性（绿色）的平均 RCR 及 1-1/RCR 值，误差线表示标准差（± SD）。(A)、(B) 和 (C) 分别表示使用豚鼠、Sprague Dawley（SD）大鼠和 Friend 白血病病毒 B（FVB）小鼠心脏获得的数据。(D) 和 (E) 为 SD 大鼠肝脏和肾脏的结果，而 (F) 为 HEK293 细胞的结果。实验采集了肝脏的三个主要叶，而两个肾脏均用于线粒体分离。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：缓冲液配方。 在整个分离过程中使用的停跳液缓冲液（CB）、分离缓冲液（IB）和呼吸缓冲液（RB）应根据所列说明提前配制。CB可在4 °C下保存长达一个月，而IB和RB可在-80 °C下保存4个月。请点击此处下载该表格。

表2：呼吸控制比分析。 用于功能分析的线粒体分离实验在多种物种和组织来源中进行，包括雄性和雌性啮齿类动物以及HEK293细胞。每种性别、组织来源和物种的样本量均详细列出，并附有平均RCR值及1-1/RCR值（±标准差）。请点击此处下载该表格。

表3：为提高不同组织线粒体分离方案的蛋白产量所推荐的调整方法。 根据组织来源列出了蛋白酶用量及离心条件的调整。总蛋白平均产量（mg）根据BSA蛋白定量结果及最终线粒体沉淀重悬体积计算得出。数值以均值±标准差（SD）表示。离心列中加粗的说明指示了上清液应弃去、保留或合并。弃去指将上清液放入生物废弃物容器中处理，保留和合并分别指将上清液转移至下一离心管或收集用于最终离心。有关该方案调整的更多细节请参见讨论部分。请点击此处下载该表格。

讨论

遵循本方案中简要描述的方法，可从小型啮齿类动物的心脏组织以及其他组织类型和来源中分离出功能完整的线粒体。总体而言，整个过程应耗时3至3.5小时，在此期间，所有动物组织、样品和分离物应尽可能保持在冰上（4 °C），以减少降解。该方法具有良好的重复性，并可根据具体的实验目标和所用模型在多个方面进行调整。在组织解剖过程中可进行的一项调整是省略肝素的使用。肝素用于防止血液凝固³¹，但如果心脏能在断头后迅速插管并灌注（1.5分钟内完成），则无需使用肝素。此外，对于体型较大的啮齿类动物，建议使用CB液进行心脏灌注；而在处理小鼠心脏或其他器官时，建议在剪碎和初步匀浆前加入IB洗涤步骤。此步骤有助于去除解剖过程中残留的血液。其他可调整的参数包括匀浆和离心速度，以提高线粒体蛋白的得率。上述参数适用于从豚鼠和大鼠中分离心脏线粒体。重要的是，本方案也可经适当修改后用于从啮齿类动物的肝脏、肾脏、小鼠心脏以及细胞中分离线粒体。针对不同组织类型和动物，关于蛋白酶用量、匀浆条件及离心参数的推荐调整详见表3。

在最后一次离心步骤形成纯化的线粒体沉淀后，应将线粒体重悬于预冷的IB缓冲液中。所加入IB缓冲液的体积取决于线粒体沉淀的大小，对于豚鼠和大鼠，体积约为80 µL。若从小鼠心脏中分离线粒体，则加入60 µL IB缓冲液进行重悬。初次进行线粒体分离时，建议加入较小体积的IB缓冲液，以避免过度稀释原液。由于从小鼠肝脏和肾脏样品纯化后所得线粒体沉淀的质地较为致密，因此重悬时所需IB缓冲液的体积更少（20 µL）。其他方法建议采用机械法进行重悬。 通过 刮擦可能对线粒体膜产生磨损，降低其整体完整性^32,33使用本方案时，建议用IB轻柔地洗涤沉淀，以提高线粒体的质量。在此过程中，需注意避免产生气泡或用移液器枪头扰动沉淀，以免导致膜破裂和蛋白质错误折叠。³⁴仅将移液器推至第一停点有助于降低产生气泡的可能性。应轻柔地吹打混匀，直至沉淀物完全悬浮。从豚鼠和大鼠心脏中提取的线粒体总重悬体积应为150–200 µL，呈浅棕色。浓度更高的样品颜色会更深，呈深棕色，可在定量线粒体蛋白后根据需要稀释至目标工作浓度范围。

使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品的常规蛋白质测定法适用于线粒体蛋白的定量³⁵。蛋白质测定应根据制造商提供的方案，延迟并孵育推荐的时间和温度。对于分离的线粒体，在37 °C下孵育30分钟可实现充分显色，从而获得准确的蛋白定量结果。在测定总蛋白含量时，建议首先将重悬的线粒体和IB按1:50、1:100和1:200的比例进行稀释，以确保蛋白测定结果处于标准曲线的线性范围内。有关使用BSA作为标准品进行蛋白测定的更多细节，请参考制造商试剂盒的说明，因此本文所列建议可能不适用于所有情况。还应进行柠檬酸合酶（CS）活性测定，以确定每个样品中的线粒体含量。该方法已被广泛验证，若需研究不同线粒体亚型之间的生物学差异，还可用于进一步的数据归一化³⁶。

在测定蛋白质浓度后，应将线粒体储备液稀释至呼吸测定实验所需的最终工作浓度。来自豚鼠和大鼠心脏的线粒体应稀释至40 mg/mL，取5 µL该储备液加入呼吸室中，使工作浓度达到0.1 mg/mL。若从单个小鼠心脏或肾脏、肝脏中分离线粒体，则可能无需稀释线粒体储备液。也可加入较大体积的线粒体以达到所需浓度。在大多数呼吸测定分析中，State 2期间的耗氧速率在35–55 pmol/mL/s范围内是可接受的²⁸。图1及代表性结果部分详细说明了呼吸控制比（RCR）的测定与分析方法；但需注意，呼吸底物为丙酮酸和苹果酸。其他底物条件（如琥珀酸和鱼藤酮）将导致不同的RCR值，因为其P/O比及其他生物能量学参数存在差异³⁷。使用丙酮酸和苹果酸作为呼吸底物可实现接近最大化的三羧酸循环（TCA cycle）周转速率及还原当量的生成；然而，当使用5 mM丙酮酸、1 mM L-苹果酸和20 mM琥珀酸时，才能获得最大TCA循环活性和偶联的电子传递链（ETS）功能。在刺激氧化磷酸化以量化State 3期间耗氧速率时，所添加的ADP浓度应至少为腺苷酸转运蛋白ADP估计K_D值的10倍³⁸。这可通过一次性加入超过350 µM的ADP实现，因此所有实验测定中均采用500 µM ADP。若State 3持续时间过短，可使用较低的线粒体浓度以延长其持续时间。为进一步分析呼吸情况，可根据实验参数调整加入系统的ADP浓度³⁹。在最初建立本方案时，曾使用细胞色素C检测法评估所分离线粒体的外膜完整性⁴⁰。若RCR值低于预期范围，应进行细胞色素C检测，以判断外膜是否发生显著损伤。具体操作为：向呼吸室中加入10 µM细胞色素C，并确认呼吸速率的增加低于State 4速率的5%或10%。预期范围来自先前已发表的研究，具有物种、组织和底物特异性。若加入细胞色素C后State 4呼吸速率上升超过10%，可重复最后一次8,000 × g离心步骤以去除受损线粒体。但需注意，外膜损伤可能是某种疾病表型的一部分，因此解释细胞色素C检测结果时应考虑这一因素⁴¹。当持续获得高RCR值且细胞色素C刺激效应较低（<10%）时，仅在RCR值超出可接受范围的情况下才需要并建议进行该检测。若细胞色素C检测结果<10%而RCR值仍超出预期范围（如表2所述），则应在用蒸馏水清洗10次后，使用新的呼吸缓冲液（RB）重复呼吸测定实验。若仍观察到速率降低，则需重新配制新鲜试剂（丙酮酸、苹果酸、EGTA和ADP）以诊断问题所在。此外，也可通过ELISA方法或使用线粒体染料（如TMRE）进行细胞色素C检测^33,42。根据组织类型和来源不同，这些方法可能更适用于评估外膜完整性。

尽管使用本方案分离心脏线粒体不存在重大局限性，但在采用这些方法时仍需注意某些事项。线粒体分离物的质量受温度以及灌注心脏和重悬纯化沉淀所需时间的影响较大。因此，可能需要熟悉这些操作流程，才能获得与本文报道结果相当的呼吸控制率（RCR）。此外，分离过程中所用缓冲液和溶液的组成也很重要，因为它直接影响线粒体的完整性和功能⁴³。 表1 中列出的缓冲液可作为参考，已在多种组织来源中成功用于分离耦联良好的线粒体；但可对缓冲液成分进行调整，以减少呼吸分析中的氯离子含量，因为氯离子可能干扰腺苷酸转运和电子传递链（ETS）功能²⁸。缓冲液组成也可进一步优化，以更有效地分离肝脏线粒体。由于肝脏中脂肪酸浓度较高，若观察到RCR超出预期范围，建议使用牛血清白蛋白（BSA）浓度较高的缓冲液洗涤器官及剪碎的组织。尽管从肝组织获得的线粒体分离物通常耦联良好且结果稳定，但上述调整仍可能进一步改善细胞器功能。还应认识到，利用这些方法从细胞中分离线粒体需要大量培养细胞，这可能构成潜在限制。此外，本方案并非专为细胞分离设计，尽管实际应用中已证明其可行，但针对培养细胞的特异性分离方法可能更为适用。作为替代方案，研究人员也可选择使用荧光探针来计算RCR。光谱荧光法是一种常用方法，尤其适用于提取蛋白量较少的情况^44,45。

总体而言，本方案可用于从小型动物（如豚鼠和大鼠）中稳定地分离出功能良好、偶联完整的线粒体。通过调整匀浆速度、离心时间以及离心次数，可轻松修改该方案以提高蛋白产量，从而实现从小鼠心脏、肝脏、肾脏及细胞中分离线粒体。此外，本方案具有良好的通用性和稳健性，已被用于研究非哺乳动物物种（如海七鳃鳗）⁴⁶的线粒体功能，并利用传统电子显微镜和冷冻电镜进行结构分析^40,47。尽管近年来许多研究集中于完整细胞和组织系统中线粒体行为的探索，但使用这些方法从分离的线粒体中获取的信息在广度和深度上均揭示了其对代谢组学、氧化应激以及ATP生成的影响，其科学价值不可忽视。分离出功能良好、偶联完整的线粒体，使研究人员能够探究疾病发生与发展的关键方面，而这些方面在全细胞模型中通常难以实现。由于本方案具有高度的灵活性，因此可利用文中所述方法研究心血管疾病、糖尿病及神经系统疾病等病理状态下线粒体能量代谢的变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 微量离心管
10 mL 玻璃烧杯			用于器官解剖和剪碎
50 mL 离心管			离心
腺苷-5'-二磷酸单钾盐二水合物	Sigma	A5285	呼吸测定实验
BSA 蛋白定量检测试剂盒	Thermo Scentific	PI23225	线粒体蛋白定量
右旋葡萄糖	Sigma	DX0145	用于缓冲液（CB）
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸	Sigma	E4378	用于缓冲液（CB 和 IB）及呼吸测定实验
玻璃套管	Radnoti		豚鼠和大鼠心脏灌流
肝素钠（猪黏膜来源）	Sigma	SRE0027-250KU	动物腹腔注射
高分辨率呼吸计			克拉克型电极；带 2 mL 腔室的氧电极仪
诱导室
异氟烷	Sigma	792632	麻醉剂
L-苹果酸	Sigma	02288-50G	呼吸测定实验
氯化镁六水合物	Sigma	M9272	用于缓冲液（RB）
甘露醇	Sigma	MX0214	用于缓冲液（IB）
微升注射器			规格范围为 5–50 µL
酶标仪			必须能够在 37 °C 下孵育
MOPS	Sigma	475898	用于所有缓冲液
O2 气瓶
OMNI THQ 匀浆器	OMNI International	12-500	类似的转子-定子匀浆器也可使用
移液器			体积范围为 2–20 µL；20–200 µL；200–1000 µL
氯化钾	Sigma	P3911	用于缓冲液（RB 和 CB）
磷酸氢二钾	Sigma	795496	用于缓冲液（IB 和 RB）
来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶	Sigma	P5459
氯化钠	Sigma	S9888	用于缓冲液（CB）
丙酮酸钠	Fisher bioreagents	BP356-100	呼吸测定实验
蔗糖	Sigma	8510-OP	用于缓冲液（IB）
外科解剖器械包			根据动物种类和组织来源而定
台式离心机			必须能冷却至 4 °C