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方法文章

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

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DOI：

10.3791/67093

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2024年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

本文内容

摘要

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。

摘要

线粒体分离技术已有数十年历史，最初由分子生物学和生物化学领域的先驱建立，用于研究代谢障碍和疾病。要准确研究线粒体生理学和生物能量学，必须获得质量稳定的线粒体；然而，目前已有多种不同的线粒体分离方法见于文献。尽管不同的实验策略需要采用不同的分离方法，其基本原理和操作步骤相似。本方案详细描述了一种可从多种组织来源（包括小型动物和细胞）中提取功能良好偶联线粒体的方法。具体步骤包括器官解剖、线粒体纯化、蛋白质定量以及多项质量控制检测。用于鉴定高质量线粒体的主要质量控制指标是呼吸控制比（RCR）。RCR是指氧化磷酸化状态下的呼吸速率与无ADP存在时呼吸速率的比值。本文也讨论了其他可选的质量评估指标。采用本方案可获得相对于其组织来源而言较高的RCR值，同时多个步骤可根据研究人员的具体需求进行优化。该方法稳定可靠，在多种动物模型和组织来源中均能 consistently 获得高于平均水平的RCR值。

引言

线粒体是一种亚细胞器，能够建立适合特定细胞功能的胞质能量环境。尽管细胞、组织和生物体水平的研究可为线粒体功能提供见解，但分离线粒体能够实现其他方法无法达到的实验控制水平。自20世纪40年代以来，人们已开展线粒体分离工作，从而可在多种细胞和组织中对代谢和呼吸作用进行机制性研究1,2。线粒体的历史重要性也已有充分记载3。作为ATP的主要生产者，线粒体在维持细胞和器官最佳功能方面发挥着多种关键作用4。在线粒体基质内，底物通过三羧酸循环（TCA循环）被氧化，产生还原当量以及NADH和UQH2等可移动电子载体5,6。细胞色素C是线粒体生化反应网络中的第三种主要可移动电子载体7。这些分子随后被嵌入线粒体内膜的电子传递系统（ETS）跨膜复合物所氧化8。ETS的氧化还原反应与质子从基质向膜间隙的转运相偶联。这些过程建立起电化学质子梯度，该梯度被F1F0 ATP合酶用于将ADP与Pi磷酸化，从而生成ATP9,10。利用克拉克型电极或微孔板氧消耗测定法进行高分辨率呼吸测定，可深入探究每个复合体中发生的独立过程11,12。此外，使用分离线粒体构建疾病模型及开展治疗研究，有助于确定线粒体功能在某些病理进展中的影响或重要性。这一方法在心脏病学领域已取得丰硕成果，通过改变燃料和底物的供给，阐明了线粒体功能障碍如何影响心力衰竭的发展13,14,15,16。线粒体还被证实影响糖尿病、癌症、肥胖、神经系统疾病和肌病等其他疾病状态的发展17,18。因此，使用分离或纯化的线粒体可对来源组织中的氧化代谢和ATP生成机制进行深入研究。

由于线粒体分离方案在生物能量学研究中的重要性，相关方法并不缺乏。此外，还可找到针对组织和细胞内线粒体亚群的高度特异性方法19,20。不同分离方法的基本操作步骤相似，但可通过调整缓冲液组成、匀浆步骤和离心条件来提高线粒体的得率和质量。这些调整取决于组织的代谢需求、整体器官功能、线粒体密度及其他因素。在肝脏和骨骼肌等组织中，通常使用手持式匀浆器以维持线粒体完整性，并限制对线粒体膜的损伤21。然而，在从肾脏中分离线粒体时，一些方案建议采用手动匀浆或商用试剂盒以获得更优结果22。尽管两种方法均可获得具有功能的线粒体，但使用这些方案所需时间较长，可能导致细胞器质量下降。离心在提取线粒体蛋白过程中也至关重要，因为它可将细胞核和其他细胞器与线粒体分离23。在分离过程中，应采用差速离心还是密度梯度离心以获得更纯的线粒体，目前仍存在争议24。虽然密度梯度离心能够将线粒体与过氧化物酶体等具有相似比重的细胞器分开，但尚不明确采用该方法分离的线粒体是否比差速离心法更能真实反映体内线粒体的功能状态。在线粒体生理学领域，密度梯度离心更受青睐，且易于调整以提高分离纯度。由于离心力（g值）、离心时间及离心次数的变化会显著影响线粒体纯化效果，因此在实验前应充分考虑是否引入这些参数的调整。此外，线粒体重悬—— arguably 分离过程中最关键的步骤——在不同研究中差异显著，包括刮取、涡旋混匀或再次匀浆等方式23,25,26。此类机械性重悬操作可能过于剧烈，损害线粒体膜的完整性。因此，应采用轻柔的洗涤方式加以纠正。尽管存在大量改良方案和推荐方法，但适用于啮齿类动物模型、兼具高重复性和广泛适应性的综合性实验方案仍较为有限。

本文所述方法提供了一种详细、稳健且高度可重复的实验方案，可从小型动物心脏组织中分离出高纯度、功能完整的线粒体。如文中所示，该方法可轻松调整，以适应不同实验需求或实验室条件，用于从肾脏、肝脏及培养细胞中分离线粒体。此外，还可进一步修改本方案，以适用于本文未列出的其他组织和动物来源的线粒体分离。所有分离步骤所用缓冲液配方均已提供，可根据需要进行调整。与其它已发表的方案类似，本方法采用电动匀浆和差速离心技术；然而，针对不同组织来源，对剪切时间和离心力进行了优化调整，以确保 consistently 获得高质量的线粒体分离产物。值得注意的是，本方案与其他方法的区别在于采用了温和的洗涤步骤 通过 用移液器重悬沉淀的线粒体，有助于保持线粒体膜的完整性并维持细胞器的整体功能。线粒体蛋白含量可通过总蛋白测定或柠檬酸合酶活性检测进行定量。该分离方法的实用性和广泛适用性进一步得到了来自多种生物体和组织来源所获得的呼吸控制比（RCR）数值的支持。

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方案

所有脊椎动物的使用和处理均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案进行。本方案使用雄性和雌性哈特利白化豚鼠以及斯普拉格-道利（SD）大鼠。用于分离心脏线粒体的豚鼠在4-6周龄（300-450 g）时处死。两性SD大鼠的心脏线粒体在10-13周龄（250-400 g）时获取。缓冲液的配方见表1，应提前配制。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 实验准备

  1. 开始分离前，将两个50 mL离心管标记为 "自旋1和2" 和 "离心 3".
  2. 将离心管、新解冻的分离缓冲液（IB）、锋利的剪刀、组装好的匀浆探针以及5 mL烧杯或同等大小的容器置于冰上。
  3. 将新解冻的呼吸缓冲液（RB）放入孵育器中预热，用于后续呼吸测定实验。
  4. 将制冷离心机预冷至 4 °C。
  5. 确保所有设备已妥善放置，并加入 20 µL 浓度为 7–15 U/mg 的蛋白酶 枯草芽孢杆菌 已加入标记为的试管中 "自旋1和2".
  6. 建立重力依赖性灌注压力系统 通过 使用心脏停搏液（CB, 表1），玻璃导管，以及带止流阀的塑料管。
  7. 准备手术器械，包括适用于心脏解剖和插管的适当剪刀和镊子。
    注意：所有用水均应为高纯度水（18.2 MΩ·cm）

2. 组织解剖

  1. 以每公斤体重500 U的剂量，向动物腹腔内注射无菌肝素硫酸盐。
  2. 肝素给药后，将动物置于诱导室中静置15分钟。在此期间，以2 L/min的流速供应纯O2气体，以充分氧合动物，使其镇静，并尽量减少可能对目标组织产生不利影响的应激反应。
  3. 以0.5%的异氟烷持续气流开始麻醉诱导。1分钟后，将浓度提高至1%。此后每分钟增加1%，直至达到5%。达到5%后，等待1分钟，并监测动物的呼吸模式。
  4. 当呼吸变慢且变得费力时（约在第6.5分钟），关闭异氟烷和氧气气流。
  5. 迅速将动物从诱导室中取出，通过捏压足爪并检查角膜反射来判断麻醉深度。若动物对任一刺激有反应，则将其放回诱导室，重新给予麻醉，并重复麻醉深度检查。
  6. 一旦达到适当的麻醉深度，立即使用断头器快速断头，切断颈椎，并将俯卧位的尸体置于冰上。
  7. 从锁骨处开始，沿侧肋骨向下做两条平行的纵向切口，贯穿整个胸腔长度。确保切口足够深，以切开侧胸壁的肋骨，但避免损伤心脏或大血管等胸腔内结构。
    注：纵向切口的大小取决于所用动物种类。若使用豚鼠和大鼠，应切至膈肌（大鼠约6.35 cm，豚鼠约11 cm）。若使用小鼠，则进行标准开胸术27。
  8. 使用止血钳移开前胸壁，暴露心脏，并用冰填充暴露的胸腔。此步骤可最大限度缩短热缺血时间，提高分离细胞器的活性。
  9. 使用镊子钝性分离胸腺和心包膜，充分暴露心脏。
  10. 用镊子对心脏施加轻柔的向下牵引力，以暴露并识别主动脉。主动脉是从心脏基底部发出的最粗大的大血管。其他大血管（如肺静脉）明显比主动脉更透明。
  11. 在主动脉根部上方约4–6 mm、颈动脉分支点下方处剪断主动脉。
  12. 插管主动脉，并利用重力驱动的压力头，用冰冻的心脏停跳液（CB）溶液灌注心脏28,29，直至冠状动脉内血液被清除，器官呈现苍白外观。
    注：对于大型啮齿类动物，推荐使用直径为1.8–2.2 mm的导管；对于小型啮齿类动物，建议使用直径为1.4–1.8 mm的导管。逆行灌注应在15–30秒内完成，以清除冠状血管内的血液。
  13. 通过解剖去除心房、软骨性瓣膜组织和脂肪组织，分离心室心肌。
  14. 将心室组织放入预冷的10 mL烧杯中，内含0.1–0.2 mL冰冻IB溶液。
  15. 用锋利的手术剪将组织剪碎，直至组织块大小约为1 mm3。

3. 线粒体纯化与蛋白质定量

  1. 将剪碎的组织转移至预冷的离心管中，该管已标记为"Spins 1 and 2"，并含有蛋白酶溶液。
  2. 加入冰浴的 IB 缓冲液，使终体积达到 25 mL。
  3. 使用电动手持转子-定子匀浆器，在冰上以 18,000 rpm 的速度分散组织 20–25 秒。
  4. 将匀浆后的组织在标记为"Spins 1 and 2"的离心管中，于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
  5. 倾倒上清液（含蛋白酶）至废液瓶中，并用 5 mL IB 缓冲液轻轻冲洗沉淀，以去除残留的蛋白酶。
  6. 弃去冲洗液后，用新鲜的冰浴 IB 缓冲液轻柔涡旋重悬沉淀，终体积为 25 mL。
  7. 在 4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟。
  8. 小心倾倒上清液（含有线粒体）至预冷的 50 mL 离心管中，该管已标记为"Spin 3"。倾倒时注意避免扰动沉淀上层松散部分。也可选择使用移液管或排枪收集上清液。
  9. 将上清液在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
  10. 弃去所得上清液，保留含线粒体的沉淀。
  11. 使用无尘擦拭纸吸除离心管内壁多余的上清液，注意避免扰动沉淀。尽可能将沉淀保持在 4 °C 冰上。
  12. 为重悬线粒体，向离心管底部加入 80 µL 冰浴的 IB 缓冲液。通过反复用 IB 缓冲液冲洗沉淀，轻柔地重悬沉淀。
  13. 为避免产生气泡，将微量移液器设置为吸取和释放 40–60 µL 的体积。
  14. 随着线粒体沉淀逐渐分散，可逐步增加微量移液器的吸液体积，以更高效地重悬沉淀的线粒体。避免移液器吸头接触沉淀，同时避免产生气泡。
  15. 重悬完成后，将线粒体转移至预冷的微量离心管中，并标记为线粒体储备液。记录总重悬体积。
  16. 为测定样品中线粒体蛋白浓度，按照制造商说明书使用经典的 BCA 或 Bradford 蛋白定量法进行总蛋白检测。
    注意：评估产量的另一种或补充策略是测定柠檬酸合酶活性。作为参考，可通过参照 Vinnakota 等人30描述的方案来定量线粒体含量。

4. 质量控制检查

  1. 在预冷的微量离心管中，用 IB 将线粒体储备液稀释至所需的工作浓度。
    注意：当使用心脏组织分离的线粒体进行呼吸测定实验时，通常将线粒体储备液稀释至 40 mg/mL，以获得 0.1 mg/mL 的终浓度。
  2. 用蒸馏水将氧电极室、塞子和微量注射器冲洗十次，以在呼吸测定实验前清洁这些部件。
  3. 为检测线粒体分离物的活性和质量，向氧电极室中加入 2.3 mL 呼吸缓冲液（RB），并在 37 °C 下使氧气消耗信号平衡约 10 分钟，或直至消耗速率接近 0。
  4. 信号平衡后，压下塞子，并吸除从塞子毛细管中溢出的多余缓冲液。
  5. 使用微量注射器加入 1 mM EGTA，以螯合缓冲液或线粒体样品中任何残留的钙离子。
  6. 为驱动呼吸，加入 5 mM 丙酮酸钠和 1 mM L-苹果酸。
  7. 加入底物后，加入一定量的稀释线粒体以达到工作浓度，并允许呼吸进行 5 分钟。此阶段称为 LEAK 呼吸或状态 2 呼吸。
  8. 在第 5 分钟时，加入 500 µM ADP 的脉冲量以启动状态 3 呼吸（也称为 OXHPOS），并允许线粒体呼吸直至缺氧。
  9. 通过将状态 3 期间的最大氧气消耗速率除以状态 2 中加入 ADP 前的氧气消耗速率来计算呼吸控制比（RCR）（见 图 1）。
    注意：也可使用另一种 RCR 表达方式 1 - 1/RCR 作为质量指标，其值介于 0 和 1 之间；然而，当 RCR > 10 时，使用该指标难以区分质量差异（见 图 2）。
  10. 用纯水将电极室和塞子冲洗 10 次，以清洁氧电极装置供后续实验使用。若呼吸测定已结束，则将电极室中充满 70% 乙醇，并将塞子置于电极室内，直至下次使用。

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结果

线粒体分离完成后，应检测分离物的质量和功能特性 通过 量化氧气消耗速率（JO₂) 使用高分辨率呼吸测定法进行检测。为此，将线粒体储备液稀释至40 mg/mL，以便在所有使用分离心肌线粒体的呼吸测定实验中，于2 mL呼吸缓冲液（RB）中获得0.1 mg/mL的工作浓度。呼吸由5 mM丙酮酸钠和1 mM L-苹果酸供能，并在含有1 mM钙螯合剂EGTA的条件下进行；体系平衡5分钟以建立State 2呼吸状态。在此状态下，耗氧速率应平均为45–55 pmol/mL/s 或 27–33 nmol/mg/min。需注意电极自身相关的耗氧速率，并在必要时进行相应的背景校正。在第5分钟时，通过一次性加入底物启动氧化磷酸化（State 3）。 500 µM ADP。底物添加和代表性示踪的详细信息见于 图1功能正常的线粒体会立即增加JO₂ 加入ADP后，其浓度范围根据组织来源而定，如图所示 图2. 不使用EGTA时，残留钙对J的最大速率具有可变的影响O₂...

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讨论

遵循本方案中简要描述的方法，可从小型啮齿类动物的心脏组织以及其他组织类型和来源中分离出功能完整的线粒体。总体而言，整个过程应耗时3至3.5小时，在此期间，所有动物组织、样品和分离物应尽可能保持在冰上（4 °C），以减少降解。该方法具有良好的重复性，并可根据具体的实验目标和所用模型在多个方面进行调整。在组织解剖过程中可进行的一项调整是省略肝素的使用。肝素用于防止血液凝固31，但如果心脏能在断头后迅速插管并灌注（1.5分钟内完成），则无需使用肝素。此外，对于体型较大的啮齿类动物，建议使用CB液进行心脏灌注；而在处理小鼠心脏或其他器官时，建议在剪碎和初步匀浆前加入IB洗涤步骤。此步骤有助于去除解剖过程中残留的血液。其他可调整的参数包括匀浆和离心速度，以提高线粒体蛋白的得率。上述参数适用于从豚鼠和大鼠中分离心脏线粒体。重要的是，本方案也可经适当修改后用于从啮齿类动物的肝脏、肾脏、小鼠心脏以及细胞中分离线粒体。针对不同组织类型和动物，关于蛋白酶用量、匀浆条件及离心参数的推荐调整详见表3。

在最后一次离心步骤形成...

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披露

作者声明无任何披露内容。

致谢

我们谨向 Daniel A. Beard 和 Kalyan C. Vinnakota 致以谢意，感谢他们为本实验方案所做出的基础性贡献。本工作由美国国家科学基金会职业奖项目 MCB-2237117 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 微量离心管
10 mL 玻璃烧杯用于器官解剖和剪碎
50 mL 离心管离心
腺苷-5'-二磷酸单钾盐二水合物Sigma A5285呼吸测定实验
BSA 蛋白定量检测试剂盒Thermo ScentificPI23225线粒体蛋白定量
右旋葡萄糖Sigma DX0145用于缓冲液（CB）
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 Sigma E4378用于缓冲液（CB 和 IB）及呼吸测定实验
玻璃套管Radnoti豚鼠和大鼠心脏灌流
肝素钠（猪黏膜来源）Sigma SRE0027-250KU动物腹腔注射
高分辨率呼吸计克拉克型电极；带 2 mL 腔室的氧电极仪
诱导室
异氟烷Sigma 792632麻醉剂 
L-苹果酸Sigma 02288-50G呼吸测定实验
氯化镁六水合物Sigma M9272用于缓冲液（RB）
甘露醇Sigma MX0214用于缓冲液（IB）
微升注射器规格范围为 5–50 µL
酶标仪必须能够在 37 °C 下孵育
MOPSSigma 475898用于所有缓冲液
O2 气瓶
OMNI THQ 匀浆器OMNI International 12-500类似的转子-定子匀浆器也可使用
移液器体积范围为 2–20 µL；20–200 µL；200–1000 µL
氯化钾Sigma P3911用于缓冲液（RB 和 CB）
磷酸氢二钾Sigma 795496用于缓冲液（IB 和 RB）
来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶Sigma P5459
氯化钠Sigma S9888用于缓冲液（CB）
丙酮酸钠Fisher bioreagentsBP356-100呼吸测定实验
蔗糖Sigma 8510-OP用于缓冲液（IB）
外科解剖器械包根据动物种类和组织来源而定
台式离心机必须能冷却至 4 °C 

参考文献

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