从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

摘要

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。

摘要

线粒体分离技术已有数十年历史，最初由分子生物学和生物化学领域的先驱建立，用于研究代谢障碍和疾病。要准确研究线粒体生理学和生物能量学，必须获得质量稳定的线粒体；然而，目前已有多种不同的线粒体分离方法见于文献。尽管不同的实验策略需要采用不同的分离方法，其基本原理和操作步骤相似。本方案详细描述了一种可从多种组织来源（包括小型动物和细胞）中提取功能良好偶联线粒体的方法。具体步骤包括器官解剖、线粒体纯化、蛋白质定量以及多项质量控制检测。用于鉴定高质量线粒体的主要质量控制指标是呼吸控制比（RCR）。RCR是指氧化磷酸化状态下的呼吸速率与无ADP存在时呼吸速率的比值。本文也讨论了其他可选的质量评估指标。采用本方案可获得相对于其组织来源而言较高的RCR值，同时多个步骤可根据研究人员的具体需求进行优化。该方法稳定可靠，在多种动物模型和组织来源中均能 consistently 获得高于平均水平的RCR值。

引言

线粒体是一种亚细胞器，能够建立适合特定细胞功能的胞质能量环境。尽管细胞、组织和生物体水平的研究可为线粒体功能提供见解，但分离线粒体能够实现其他方法无法达到的实验控制水平。自20世纪40年代以来，人们已开展线粒体分离工作，从而可在多种细胞和组织中对代谢和呼吸作用进行机制性研究^1,2。线粒体的历史重要性也已有充分记载³。作为ATP的主要生产者，线粒体在维持细胞和器官最佳功能方面发挥着多种关键作用⁴。在线粒体基质内，底物通过三羧酸循环（TCA循环）被氧化，产生还原当量以及NADH和UQH₂等可移动电子载体^5,6。细胞色素C是线粒体生化反应网络中的第三种主要可移动电子载体⁷。这些分子随后被嵌入线粒体内膜的电子传递系统（ETS）跨膜复合物所氧化⁸。ETS的氧化还原反应与质子从基质向膜间隙的转运相偶联。这些过程建立起电化学质子梯度，该梯度被F₁F₀ ATP合酶用于将ADP与Pi磷酸化，从而生成ATP^9....

方案

所有脊椎动物的使用和处理均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案进行。本方案使用雄性和雌性哈特利白化豚鼠以及斯普拉格-道利（SD）大鼠。用于分离心脏线粒体的豚鼠在4-6周龄（300-450 g）时处死。两性SD大鼠的心脏线粒体在10-13周龄（250-400 g）时获取。缓冲液的配方见表1，应提前配制。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 实验准备

1. 开始分离前，将两个50 mL离心管标记为 "自旋1和2" 和 "离心 3".
2. 将离心管、新解冻的分离缓冲液（IB）、锋利的剪刀、组装好的匀浆探针以及5 mL烧杯或同等大小的容器置于冰上。
3. 将新解冻的呼吸缓冲液（RB）放入孵育器中预热，用于后续呼吸测定实验。
4. 将制冷离心机预冷至 4 °C。
5. 确保所有设备已妥善放置，并加入 20 µL 浓度为 7–15 U/mg 的蛋白酶 枯草芽孢杆菌 已加入标记为的试管中 "自旋1和2".
6. 建立重力依赖性灌注压力系统 通过 使用心脏停搏液（CB, 表1），玻璃导管，以及带止流阀的塑料管。
7. 准备....

结果

线粒体分离完成后，应检测分离物的质量和功能特性 通过 量化氧气消耗速率（J_O₂) 使用高分辨率呼吸测定法进行检测。为此，将线粒体储备液稀释至40 mg/mL，以便在所有使用分离心肌线粒体的呼吸测定实验中，于2 mL呼吸缓冲液（RB）中获得0.1 mg/mL的工作浓度。呼吸由5 mM丙酮酸钠和1 mM L-苹果酸供能，并在含有1 mM钙螯合剂EGTA的条件下进行；体系平衡5分钟以建立State 2呼吸状态。在此状态下，耗氧速率应平均为45–55 pmol/mL/s 或 27–33 nmol/mg/min。需注意电极自身相关的耗氧速率，并在必要时进行相应的背景校正。在第5分钟时，通过一次性加入底物启动氧化磷酸化（State 3）。 500 µM ADP。底物添加和代表性示踪的详细信息见于 图1功能正常的线粒体会立即增加J_O₂ 加入ADP后，其浓度范围根据组织来源而定，如图所示 图2. 不使用EGTA时，残留钙对J的最大速率具有可变的影响_O₂.......

讨论

遵循本方案中简要描述的方法，可从小型啮齿类动物的心脏组织以及其他组织类型和来源中分离出功能完整的线粒体。总体而言，整个过程应耗时3至3.5小时，在此期间，所有动物组织、样品和分离物应尽可能保持在冰上（4 °C），以减少降解。该方法具有良好的重复性，并可根据具体的实验目标和所用模型在多个方面进行调整。在组织解剖过程中可进行的一项调整是省略肝素的使用。肝素用于防止血液凝固³¹，但如果心脏能在断头后迅速插管并灌注（1.5分钟内完成），则无需使用肝素。此外，对于体型较大的啮齿类动物，建议使用CB液进行心脏灌注；而在处理小鼠心脏或其他器官时，建议在剪碎和初步匀浆前加入IB洗涤步骤。此步骤有助于去除解剖过程中残留的血液。其他可调整的参数包括匀浆和离心速度，以提高线粒体蛋白的得率。上述参数适用于从豚鼠和大鼠中分离心脏线粒体。重要的是，本方案也可经适当修改后用于从啮齿类动物的肝脏、肾脏、小鼠心脏以及细胞中分离线粒体。针对不同组织类型和动物，关于蛋白酶用量、匀浆条件及离心参数的推荐调整详见表3。

在最后一次离心步骤形成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 微量离心管
10 mL 玻璃烧杯			用于器官解剖和剪碎
50 mL 离心管			离心
腺苷-5'-二磷酸单钾盐二水合物	Sigma	A5285	呼吸测定实验
BSA 蛋白定量检测试剂盒	Thermo Scentific	PI23225	线粒体蛋白定量
右旋葡萄糖	Sigma	DX0145	用于缓冲液（CB）
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸	Sigma	E4378	用于缓冲液（CB 和 IB）及呼吸测定实验
玻璃套管	Radnoti		豚鼠和大鼠心脏灌流
肝素钠（猪黏膜来源）	Sigma	SRE0027-250KU	动物腹腔注射
高分辨率呼吸计			克拉克型电极；带 2 mL 腔室的氧电极仪
诱导室
异氟烷	Sigma	792632	麻醉剂
L-苹果酸	Sigma	02288-50G	呼吸测定实验
氯化镁六水合物	Sigma	M9272	用于缓冲液（RB）
甘露醇	Sigma	MX0214	用于缓冲液（IB）
微升注射器			规格范围为 5–50 µL
酶标仪			必须能够在 37 °C 下孵育
MOPS	Sigma	475898	用于所有缓冲液
O2 气瓶
OMNI THQ 匀浆器	OMNI International	12-500	类似的转子-定子匀浆器也可使用
移液器			体积范围为 2–20 µL；20–200 µL；200–1000 µL
氯化钾	Sigma	P3911	用于缓冲液（RB 和 CB）
磷酸氢二钾	Sigma	795496	用于缓冲液（IB 和 RB）
来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶	Sigma	P5459
氯化钠	Sigma	S9888	用于缓冲液（CB）
丙酮酸钠	Fisher bioreagents	BP356-100	呼吸测定实验
蔗糖	Sigma	8510-OP	用于缓冲液（IB）
外科解剖器械包			根据动物种类和组织来源而定
台式离心机			必须能冷却至 4 °C