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方法文章

测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

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DOI：

10.3791/67094

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2025年2月21日

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

本文内容

摘要

气液界面培养常用于通过分化原代正常人支气管上皮细胞来构建假复层气道上皮，以模拟肺气道的顶面结构。本文介绍一种通过监测其生物物理特性（如纤毛功能和膜完整性）来评估其质量的简便方案。

摘要

在气液界面（ALI）中分化原代肺气道上皮细胞是一种常用技术，可用于构建模拟肺气道顶面的多细胞假复层气道上皮。尽管原代肺气道细胞的分化是预期结果，但对纤毛功能和膜不透性等生物物理特性的评估可提供气道上皮的质量评价，并确保实验的可靠性。本文介绍了一种在ALI培养体系中构建多细胞假复层气道上皮的简便方案，并评估两个重要的生物物理特性：纤毛功能和膜不透性。为测定纤毛功能，我们使用连接倒置显微镜的高速相机记录培养4周后气道上皮的纤毛运动，随后利用Simon Amon视频分析系统（SAVA）对纤毛摆动频率（CBF）进行量化。此外，我们使用伏欧姆计测量跨上皮电阻（TEER），以评估气道上皮屏障的完整性。

引言

哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和囊性纤维化等慢性呼吸系统疾病是全球主要的健康问题之一1。由甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等病毒引起的呼吸系统疾病的流行也带来了沉重的经济和公共卫生负担2。因此，迫切需要开发针对导致不可逆呼吸组织损伤的呼吸道疾病的治疗方案。呼吸上皮组织不仅参与氧气摄取，还作为屏障保护机体免受病原体和有害化学物质的侵袭3。呼吸上皮具有复杂的细胞结构，主要由三种细胞类型组成：纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞。最近有研究报道了气道上皮中存在一种新型但稀有的离子细胞4。这些结构复杂的组织通过协调作用，发挥先天免疫功能，例如分泌抗菌肽、释放细胞因子以激活适应性免疫应答，以及进行黏液纤毛清除5。缺乏合适的气道模型是研究呼吸道感染及开发治疗方法的主要障碍之一。

气液界面（ALI）模型正成为呼吸系统疾病研究的关键工具6有效的 体外 肺气道模型中，主要的肺气道细胞分化为假复层气道上皮，该上皮至少由三种通常位于气道顶端侧的细胞组成。第一，纤毛细胞覆盖气道顶端侧的大部分区域，参与黏液纤毛清除。第二，杯状细胞产生黏液，是与纤毛细胞共同位于气道顶端侧的最大细胞。第三，基底细胞位于气道的基底层，是可分化为不同类型上皮细胞的前体细胞5,7尽管离子细胞和簇细胞在气道上皮中较为罕见，但它们也可能在纤毛功能和膜通透性方面发挥作用。4该技术不同于传统的浸没式细胞培养，后者无法模拟 体内 肺部环境。由于气液界面（ALI）模型来源于健康人、哮喘患者和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的原代上皮细胞，因此为研究感染反应和疾病病理生理学提供了更为多样的研究平台。

对气液界面（ALI）培养体系的健康评估是监测培养细胞活力、功能性和生理相关性的关键环节，有助于增强对ALI培养模型完整性、可靠性和可重复性的信心。如先前发表的研究所述，我们课题组通过评估两个生物物理参数来评价ALI培养的完整性：一是通过量化纤毛搏动频率（CBF）来评估纤毛功能，二是通过测定跨上皮电阻（TEER）来评估上皮屏障的完整性6,7,8。黏液纤毛清除（MCC）是气道上皮的重要功能之一，由纤毛细胞介导。纤毛细胞表面存在一种称为纤毛的特化细胞器，其以异时性波动的方式协调摆动，从而清除附着于气道上皮黏液层中的病原体和吸入颗粒物。有效的MCC完全依赖于正常的纤毛活动9。良好的CBF是健康且结构完整气道上皮的标志，因此对ALI培养模型的CBF进行监测可为上皮完整性提供重要信息10。尽管已有多种量化CBF的方法，例如高速视频显微技术11和相位分辨多普勒光学相干断层扫描技术12，但这些方法均需要专业技术知识和专用设备。在本实验方案中，我们提供了一种更为简便且技术门槛较低的方法，用于量化分化后气道上皮的CBF。同时，我们也描述了对同一上皮组织TEER值的测定方法，该参数可反映上皮组织的完整性和屏障功能13。

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方案

该实验方案应在生物安全二级的超净工作台（生物安全柜）内无菌条件下进行。所有培养基和溶液在使用前应于37 °C解冻。离心操作应在4 °C进行。实验中使用的所有材料必须保持无菌。原代细胞（去标识供体）由内布拉斯加大学医学中心（UNMC），奥马哈，内布拉斯加州的Kristina Bailey博士合作提供。这些原代细胞来源于去标识的供体，不属于美国国立卫生研究院（NIH）定义的人类受试者范畴。细胞的获取遵循北达科他大学，大福克斯，北达科他州与内布拉斯加大学医学中心，奥马哈，内布拉斯加州之间签署并获批的材料转让协议（MTA）。本研究中使用的是第4代人正常支气管上皮（NHBE）细胞。尽管更高代次的NHBE细胞（最高至第8代）也被证明可分化为气道上皮，但我们常规使用第4代NHBE细胞，因为在第1至第4代细胞之间，全基因组转录谱无明显差异6,14。

1. 原代细胞培养

注意：原代细胞的操作需格外小心。整个实验流程应避免对原代细胞进行剧烈处理或过度移液。

  1. 使用无菌刻度移液管向100 mm组织培养（TC）培养皿中加入5 mL胶原蛋白溶液，以预包被培养皿。将TC培养皿在室温（RT）下孵育20分钟。
  2. 使用无菌刻度移液管，吸除TC培养皿中的胶原蛋白溶液，并替换为8 mL预解冻的完全气道上皮细胞（AEC）培养基，其中添加2%（v/v）青霉素-链霉素和1%（v/v）两性霉素B（表1）。
  3. 在37 °C水浴中解冻一管原代正常人支气管上皮（NHBE）细胞（每管含5 × 105个细胞）。
  4. 用5 mL无菌刻度移液管，将1 mL预解冻的完全AEC培养基逐滴加入细胞中，使NHBE细胞适应环境，并将全部细胞收集至无菌15 mL锥形管中。
  5. 在4 °C下以212 × g离心5分钟，使细胞沉淀。轻柔地弃去管中上清液，并通过轻轻敲击管壁，用管内残留的少量培养基重悬细胞。
    注意：应避免剧烈或过度敲击。
  6. 使用5 mL无菌刻度移液管，缓慢向重悬的细胞中加入2 mL完全AEC培养基，并收集全部细胞。
  7. 将细胞加入已预先加入8 mL完全AEC培养基的培养皿中。水平移动TC培养皿，使细胞在皿内均匀分布。
  8. 将细胞置于37 °C、85%–95%湿度的CO2细胞培养箱中孵育。24小时后，在显微镜下以10倍或20倍物镜观察NHBE细胞在TC培养皿上的贴壁情况和生长状态。若细胞悬浮于培养基中，则表明为死细胞。
  9. 48小时后，使用无菌刻度移液管吸除TC培养皿中的旧培养基。
  10. 使用无菌刻度移液管，向细胞中缓慢加入10 mL预温的完全AEC培养基。将培养基缓慢加至培养皿的一个角落，避免直接倾倒于细胞上方。
  11. 每48小时更换一次完全AEC培养基，直至细胞达到95%–100%汇合度。

2. 气液界面培养

  1. 使用 P200 移液器，将 100 µL 胶原蛋白加入预先包被的 6.5 mm Transwell 小室（孔径 0.4 μm，聚酯膜）中 膜（此后称为插入物）并在室温下孵育20分钟。
  2. 使用无菌刻度移液管，吸除汇合的NHBE细胞中的培养基。
  3. 使用无菌血清移液管，向组织培养皿的一角加入 5 mL 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）。
  4. 轻轻晃动培养板以洗涤细胞，然后使用无菌血清移液管吸除1x DPBS。在整个实验过程中，务必确保细胞始终不干燥。
  5. 使用血清移液管向细胞中加入 5 mL TrypsinLE，在 37 °C 湿润的 CO₂ 培养箱中孵育2 细胞培养箱中孵育，直至所有细胞从培养板底部表面解离。
  6. 使用无菌刻度移液管，收集所有细胞至一个15 mL锥形管中。再用无菌刻度移液管向培养皿中加入3 mL胰蛋白酶，收集残留的细胞。
  7. 通过离心（212 x g）沉淀细胞 g 4 °C下孵育5分钟。弃去培养基，轻轻敲击离心管，利用管内残留的胰蛋白酶液滴重悬细胞。
  8. 使用血清学移液管向重悬的细胞中加入 2 mL 完全 AEC 培养基。
  9. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  10. 用完全AEC培养基稀释细胞，每个插入式培养小室加入5 x 104 200 µL 体积中的细胞
  11. 使用无菌镊子将插入物转移至24孔培养板中的一个空孔内。
  12. 使用 P1000 移液器，向培养板的基底室中加入 500 µL 完全 AEC 培养基。
  13. 使用无菌镊子将插入物转移回已添加完全AEC培养基的基底孔中。
  14. 使用P200移液器，加入5 x 104 将NHBE细胞重悬于200 µL完全AEC培养基中，并加入至插入式培养小室的顶端。于37 °C、85%–95%湿度的CO₂培养箱中孵育细胞2 细胞培养箱
  15. 24小时后，在显微镜下观察细胞，检查其是否已在孔内形成融合单层。
    注意：如果细胞未形成融合单层，需每隔48小时用新鲜的完全AEC培养基更换基础AEC培养基，直至细胞形成融合的单层。更换基础培养基时，使用无菌镊子将插入式培养小室转移至空孔中，用P1000移液器吸除旧培养基，加入新鲜培养基，然后将插入式培养小室放回含新鲜完全AEC培养基的孔中。
  16. 待细胞长至融合后，用无菌镊子将插入式培养小室转移至不含培养基的空孔中。使用P1000移液器吸除所有基础AEC培养基。
  17. 使用 P1000 移液器，向基底孔中加入 500 µL 新鲜的完全气液界面分化（ALI）培养基，培养基中添加 2%（v/v）青霉素-链霉素和 1%（v/v）两性霉素 B。 
  18. 使用无菌镊子将插入物转移至已加入完全ALI培养基的基底室。用P200移液器轻轻吸除顶端AEC培养基。
    注意：不要向顶端加入完全的ALI培养基。从顶端小心吸出AEC培养基，避免细胞脱落。
  19. 在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育细胞2 细胞培养箱。48小时后，用无菌镊子将插入物转移至不含培养基的空孔中。
  20. 使用 P1000 移液器吸除旧培养基，并加入 500 µL 新鲜的完全 ALI 培养基。
  21. 使用无菌镊子将插入物放回含有新鲜培养基的孔中。每隔48小时更换一次完全的ALI培养基，直至第28天（四周）。
  22. 第28天，使用P200移液器向插入物的顶侧加入100 µL的1x DPBS，并在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育2 将细胞置于培养箱中孵育30分钟。使用P200移液器吸除1x DPBS。
    注意：应加入DPBS 倾倒 在壁上 而不是直接接触细胞。吸取DPBS时，应避免触碰上皮层以及剧烈吹打，因为任何对上皮层的损伤都可能破坏其上皮（类组织）完整性。
  23. 从第2个nd 分化第1周，通过显微镜观察上皮表面是否存在因黏液产生的较深色层，以评估黏液分泌情况。过量黏液可通过DPBS洗涤去除。简而言之，在24孔板的Transwell插入膜顶侧加入200 µL 1× DPBS，将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育2 细胞培养箱中孵育30分钟。移除DPBS，将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中继续培养。2 细胞培养箱

3. 纤毛搏动频率的测定

注意：如需在 37 °C 下测定脑血流量（CBF），显微镜必须配备环境培养室，能够提供 37 °C、5% CO2 及适宜湿度的环境。

  1. 打开显微镜及其连接的计算机和环境培养箱。打开培养箱门，将含有小室的培养板放置在显微镜载物台上。
  2. 将培养板放置于载物台后，关闭培养箱。使用显微镜载物台操作旋钮移动培养板，使小室进入视野。
  3. 选择相差模式下的 20 倍物镜。通过显微镜目镜观察培养板，并使用调焦旋钮对细胞进行聚焦。
  4. 在计算机屏幕上，点击 SAVA system 图标。SAVA 程序应已安装在连接显微镜的计算机上。
  5. 在软件界面中，点击 Configure Experiment。在下一个选项卡中，点击 Create Experiment。
  6. 将弹出一个新选项卡，请在“Enter Experiment Directory Name”中输入数据存储目录，在“Enter Experiment Description”中输入实验详细信息，然后点击 OK。
  7. 点击在“Experiments”目录下已创建的 The Experiment。
  8. 点击 Modify ，并在“Sample Description”中填写样品信息。点击 Add ，然后点击 Exit 退出该选项卡。
  9. 在主软件界面的实验槽位中，从主界面的下拉菜单中选择已创建的实验。
  10. 点击 Record Video ，并在计算机屏幕上监测纤毛摆动频率（CBF）。屏幕将显示清晰的纤毛运动图像。
  11. 对每个小室，以每秒 120 帧的速度记录 6 个不同随机视野，每个视野 2.1 秒。点击 Save Video 以保存 CBF 数据。
  12. 要分析数据，请在软件界面中点击 Analyse Video 。在下一个选项卡中，点击 OK。
  13. 在接下来的选项卡中，点击 Analyse All。将每次实验生成的电子表格下载至计算机的 SAVA 数据采集文件夹中。
  14. 采用高斯平均频率进行数据展示。

4. 跨上皮电阻的定量检测

注意：经上皮电阻（TEER）定量检测需要在气道上皮的顶侧存在液体。为建立本实验方案，可在已含有基础培养基（实验组）的插入式培养小室的气道上皮顶侧加入 100 µL 的 1× DPBS，或加入 500 µL 的 1× DPBS。

  1. 使用电源开关打开EVOM2伏欧表。将测试电阻连接到EVOM2的INPUT插槽。
  2. 监测EVOM2屏幕上的读数。如果读数高于或低于1000，则需要进行校准。使用镊子调节EVOM2伏欧表上的ADJ开关，直至显示稳定的1000读数。
  3. 取一个空插入物以进行实验对照读数。使用P200移液器在空插入物的顶端侧加入100 µL的1x DPBS，同时使用P1000移液器在基底侧加入500 µL的1x DPBS。
  4. 断开测试电阻，将STX2电极连接至EVOM2的INPUT插槽。用70%乙醇轻轻清洁STX2电极。
  5. 将STX2电极插入含有1x DPBS的空插入物中，保持较短的电极腿位于每个插入物的顶端部分，较长的电极腿位于基底部分。
  6. 记录EVOM2屏幕上的稳定读数，因为读数可能由于移动或其他未确定的原因而波动。
  7. 将STX2电极插入含有28天分化上皮的插入物中，保持较短的电极腿位于每个插入物的顶端部分，较长的电极腿位于培养基中的基底部分。
  8. 记录EVOM2屏幕上的稳定读数。进行多次独立测量以计算可靠的平均值。在计算时，从实验插入物的读数中减去背景（空插入物读数）。

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结果

我们评估了来自两位独立匿名供体（两位非吸烟健康成人或患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）的成人，均为50岁以上女性）的原代正常人支气管上皮（NHBE）细胞分化所得的气道上皮的纤毛功能及膜通透性。为测定纤毛功能，我们检测了培养28天后分化气道上皮的纤毛搏动频率（CBF）。我们观察到两种气道上皮的CBF均达到至少3 Hz，与先前发表的结果相当（图1)6,7,14我们还通过测定跨上皮电阻（TEER）来评估同一气道上皮的膜不通透性。测得的TEER值约为800 ohm/cm2 对于气道上皮而言，结果与先前已发表的数据相似（图2)6,7,14因...

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讨论

人原代气道上皮（ALI 培养）作为一种体外肺模型，正越来越多地用于生物学评估，以研究其功能与机制，并减少动物实验的使用14。相较于任何单层浸没式培养，ALI 具有多种优势。例如，它可形成类似组织的假复层气道上皮，模拟肺气道的顶面结构6,7,14。然而，为了提高实验的可靠性和可重复性，应评估分化后假复层气道上皮的质量与完整性。两项关键的生物物理指标——纤毛功能和膜不透性，可提供高度分化气道上皮顶面质量的重要信息。尽管这些特性可在原代上皮 细胞在 ALI 条件下分化的早期阶段进行评估，但在感染性疾病研究中，通常采用 3 至 4 周的分化时间以稳定生成假复层气道上皮6,15,16。不同供体来源的细胞在生长和分化为气道...

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致谢

本研究 由NIH P20GM113123和UND SMHS试点项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x DPBSThermo Fisher Scientific, USA14190-144
气道上皮细胞生长培养基PromoCell, GermanyC-21060
两性霉素BThermo Fisher Scientific, USA15290-026
EVOM2伏特欧姆计World Precision Instruments, USA不适用
肝素溶液STEMCELL technologies, USA07980
氢化可的松储备液STEMCELL technologies, USA07926
显微镜：Leica DMI8（Leica Microscope），配备与显微镜相连的120帧/秒高速相机（Basler），显微镜还固定有i8型载物台培养箱。Leica, USA不适用
青霉素-链霉素Corning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI基础培养基 STEMCELL technologies, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
Sisson-Ammons视频分析（SAVA）系统，软件版本V.2.1.15 Amson Engineering, USA不适用

参考文献

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