确定假复层肺气道上皮的睫状功能和膜不可渗透性

Summary

气液界面培养通常用于通过分化模拟肺气道顶端的原代正常人支气管上皮细胞来形成假复层气道上皮。在这里，我们描述了一种通过监测其生物物理特性（例如睫状功能和膜完整性）来确定其质量的简单方案。

Abstract

在气液界面 （ALI） 中分化原代肺气道上皮细胞是一种流行的技术，用于开发模拟肺气道顶端的多细胞伪复层气道上皮。虽然原代肺气道细胞的分化是意料之中的，但对纤毛功能和膜不通透性等生物物理特性的评估提供了气道上皮的质量评估，并确保了实验的可靠性。在这里，我们描述了在 ALI 培养中开发多细胞假复层气道上皮的简单方案，并评估了两个重要的生物物理特性:睫状功能和膜不通透性。为了确定睫状功能，我们使用连接到倒置显微镜的高速相机捕捉了 4 周分化气道上皮的睫状运动，然后使用 Simon Amon 视频分析 （SAVA） 系统量化睫状跳动频率 （CBF）。我们还使用伏特欧姆表测量了跨上皮电阻 （TEER），以确定气道上皮的上皮屏障完整性。

Introduction

哮喘、慢性阻塞性肺病 （COPD） 和囊性纤维化等慢性呼吸系统疾病是全球主要的健康问题¹。由人类甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒 （RSV） 和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 等病毒引起的呼吸道疾病的流行也造成了经济和公共卫生负担²。因此，非常需要为导致不可逆的呼吸组织损伤的呼吸系统疾病制定治疗方案。呼吸道上皮组织本身不仅参与摄氧，而且还提供屏障，保护身体免受病原体和有害化学物质的侵入³。呼吸道上皮具有复杂的细胞组织，由三种主要细胞类型组成:纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞。最近，有报道称气道上皮中存在新颖但罕见的离子细胞⁴。复杂组织以协调的方式发挥作用，以提供先天免疫反应，例如分泌抗菌肽、释放细胞因子以激活适应性免疫反应和粘膜纤毛清除⁵。缺乏合适的气道模型是呼吸道感染研究和治疗方法开发的障碍之一。

气液界面 （ALI） 模型正在成为呼吸系统疾病研究的关键工具⁶。这是一种有效的体外肺气道模型，因为原代肺气道细胞分化成假复层气道上皮，该细胞由至少三种类型的细胞组成，这些细胞通常位于气道的顶....

Protocol

该方案应在无菌条件下在生物安全 2 级层流罩（生物安全柜）下进行。所有培养基和溶液在使用前应在 37 °C 下解冻。离心应在 4 °C 下进行。 实验中使用的所有材料都必须是无菌的。原代细胞（去标识化供体）是与内布拉斯加州奥马哈市内布拉斯加大学医学中心 （UNMC） 的 Kristina Bailey 博士合作获得的。原代细胞来自去标识化的供体，细胞不属于 NIH 人类受试者。这些细胞是根据北达科他大学（北达科他大学）和内布拉斯加州奥马哈 UNMC 之间批准的材料转让协议 （MTA） 获得的。在这里，我们使用了传代的 4 个 NHBE 细胞。尽管高传代 NHBE 细胞（直至第 8 代）也被证明分化为气道上皮，但我们通常使用第 4 代 NHBE 细胞，因为第 1 至第 4 代之间的全基因组转录谱没有明显差异 ^6,14。

1. 原代细胞培养

注意:小心处理原代细胞至关重要。整个方案应避免原代细胞的苛刻处理和过度移液。

1. 使用无菌血清移液管将 5 mL 胶原蛋白添加到 100 mm 组织培养 （TC） 培养皿中，以预涂培养皿。将 TC 培养皿与胶原蛋白在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。....

Results

我们评估了从两个独立的去身份化供体 （两名不吸烟、健康成人或患有 COPD 的成人、50 岁以上的女性） 分化原代 NHBE 细胞获得的气道上皮的睫状功能和气道上皮膜不通透性。为了确定睫状功能，我们确定了 28 天分化气道上皮的 CBF。我们观察到两个气道上皮的 CBF 至少达到 3 Hz，这与之前发表的结果相当（图 1）^6,7,14。我们还通过测定 TEER 评估了同一气道上皮的膜通透性。我们发现两个气道上皮的 TEER 约为 800 ohm/cm²，类似于以前发表的数据（图 2）^6,7,14。因此，我们的研究强调了在开发

Discussion

人原代气道上皮（ALI 培养）越来越多地用作体外肺模型，用于生物评估，以研究功能和机制并减少动物使用¹⁴。与任何单层浸没培养相比，ALI 具有多项优势。例如，它提供了一个组织状假复层气道上皮，模拟肺气道的顶端 ^6,7,14。然而，应评估分化的假复层气道上皮的质量和完整性，以提高实验的可靠性和可重复性。提供有关高度分化的顶端气道上皮质量信息的两个关键生物物理指标是睫状功能和膜不通透性。虽然这些特性可以在 ALI 原代上皮细胞分化的早期阶段进行评估，但在传染病研究中，3 周或 4 周的分化已被可靠地用于产生假复层气道上皮 ^6,15,16。在不同的供体中观察到.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific，美国	14190-144
气道上皮细胞生长培养基	PromoCell，德国	C-21060
两性霉素 B	Thermo Fisher Scientific，美国	15290-026
EVOM2 伏特欧姆表	World Precision Instruments，美国	不适用
素溶液	STEMCELL 技术，美国	07980
氢化可的松库存	STEMCELL 技术，美国	07926
显微镜：徕卡 DMI8（徕卡显微镜），带有与显微镜相关的 120f/sec 高速相机 （Basler）。Microsope 也用载物台室培养箱 i8 固定。	美国徕卡	不适用
青霉素-链霉素	康宁，美国	30-002-CI
PneumaCult-ALI 基础培养基	STEMCELL technologies，美国	05002
PureCol	Advanced BioMatrix，美国	5005
Sisson-Ammons 视频分析 （SAVA） 系统。软件 v.2.1.15	Amson Engineering， 美国	不适用