方法文章

一种用于采集和数字化年轮样芯的新工作流程

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DOI：

10.3791/67098

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2024年9月27日

 ,  , 
1Forest Dynamics/Dendrosciences, Swiss Federal Research Institute WSL

本文内容

摘要

我们提出一种使用3D打印夹具在野外固定增量钻孔样本的方案，无需将其拆包并粘贴到木质夹具上。新型GSC夹持器可将样本直接放入切片机中切割表面，并可立即转移至数字成像系统进行图像采集。

摘要

本文介绍了一种新的工作流程，涵盖从野外采集树木年轮样芯、样品的储存与运输到实验室，再到对年轮进行数字化以供后续树木生态学分析的全过程。该流程采用了一种新型的样芯载体—— Gärtner Schneider Core（GSC）样芯 holder。该载体通过三维（3D）建模软件设计，并最终由3D打印机打印而成。从野外采样开始即使用这种载片，样芯可直接在样芯切片机上进行切片，并利用新型高分辨率图像采集系统对表面进行数字化，无需额外调整位置，从而可立即用于分析。该系统不仅可用于对样芯和树盘的年轮进行数字化，还可利用透射光对长切片（最长可达40 cm）进行成像。这一功能在树木生态学和地貌学研究中具有特殊意义，可用于识别由样芯切片机制备的微切片中任何干扰事件的起始点。

引言

通过交叉定年技术对树木年轮进行定年的原理，最早由奥地利林学家Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent于1881年首次提出120世纪上半叶th 世纪，该技术由 "树木年轮学之父" 安德鲁·埃利科特·道格拉斯，他将该方法广泛应用于考古遗址和活体树木的年代测定2.

如今，树木生态学作为树木年轮学的一种环境研究框架，被定义为研究树木年轮及其由生态和环境随时间变化所引起的内在生长变异3。在树木生态学研究中，除了年轮宽度变异外，还利用许多其他特征，如稳定同位素、晚材密度或单个年轮内的细胞特征，将这些数据与环境参数进行关联，以更深入地理解环境条件对树木长期生长的影响4。随着木材解剖学研究持续融入树木生态学领域，过去十年中树木生态学研究不断发展，如今已成为重建过去气候状况的重要支柱5,6,7,8。

尽管在过去十年中，样品制备与分析技术，特别是在木材解剖学领域取得了显著进展9,10,11,12,13,14，但在采样技术的简化方面却几乎未取得实质性进展15。尽管已有诸如声波技术等方法16，但迄今为止，仍缺乏一种可靠的"非破坏性"方法用于提取树木年轮特征。

因此，所有与树木年轮相关的研究仍然依赖于从目标地点的树木或灌木采集的木材样本。在针对树木的研究中，标准操作程序是从树干钻取生长锥芯样本15。

使用生长锥获取样本常被称为一种"非破坏性"技术17。与从树干截取圆盘相比，这种说法是正确的；然而，该取样方法会在树干上留下直径约1 cm的孔洞，通常深入至髓心之外3。树木能够自行愈合该伤口，但此过程会引发生长反应，导致伤口附近区域的正常结构发生变化，并因真菌感染而在孔洞周围的木材中产生不同程度的变色18,19。因此，该方法更应被称为"微侵入性"，而非"非破坏性"。

通过使用机械钻取设备，钻取增量圆芯的技术 recently 得到发展，从而获得了更高质量的样品，特别是适用于木材解剖学分析15。与人工钻芯相比，该方法在野外也节省了大量时间。然而，从树木中提取圆芯后的处理流程仍保持不变，包括标记、储存以备运输，以及在实验室中为各种可能的分析技术进行样品制备。

样品芯仍需装入稳定的容器中，例如塑料或纸质吸管，以防止在运输过程中发生断裂。样品芯的标记可直接用软铅笔标注在样品芯上，或（更常见）标注在每根吸管的外侧。当使用塑料容器时，必须在短时间内将样品芯取出，以避免真菌滋生，因此样品芯需要再次从容器中取出。为在样品芯开始干燥时保持其稳定并防止弯曲，需将其固定在载具上。这也有助于后续进行表面处理以开展进一步分析。操作时，还需将原有标签一并转移至相应的载具上。标准操作方法是将样品芯粘贴在木质载具上，或用胶带固定在瓦楞板的凹槽中。其中，粘贴至木质载具是最常用的技术。尽管该方法在稳定、打磨或切割样品芯方面效果良好，但在可能进行的化学、同位素甚至木材解剖学分析方面存在若干缺点。另一个缺点是，尽管耗时较长，但将每个样品芯的标签逐一转移至新载具的过程容易出错。

在树木年轮学中，基于年轮宽度测量的精确断代是所有树木生态学研究的基础20。尽管许多实验室仍依赖于使用测量台（例如配备双目显微镜的Lintab21）进行人工测量，但目前正逐渐转向使用平板扫描仪对树芯表面进行数字化，并借助CooRecorder22或WinDENDRO23等软件进行年轮宽度测量。然而，这些扫描仪（如广泛使用的Epson Expression 10000XL）分辨率不足，无法清晰呈现早材或晚材管胞等微观结构（图1）。因此，所获得的图像难以用于识别非常狭窄的年轮或密度波动等复杂结构，在不重新借助双目显微镜观察原始树芯的情况下，将影响交叉定年过程的准确性24,25。

由于高图像分辨率是树木年轮科学研究中进行充分图像分析不可或缺的先决条件10，瑞士联邦森林、雪与景观研究所（WSL）开发了一种新的图像采集系统（Skippy；https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/），利用数码相机对树芯表面的年轮进行数字化，所获图像的分辨率高于所有现有的平板扫描仪。该系统基于2007年开发的ATRICS系统26的理念。最近，一种与Skippy类似、简单而高效的图像采集系统被作为自助组装套件推出27。

对树木年轮进行数字化，即反射光图像采集，是创建生长轮芯或轮盘高分辨率图像的重要步骤，有助于实现高效、基于数字的年轮宽度测量。瑞士联邦森林、雪与景观研究所（WSL）开发的系统还可利用透射光对长微切片（最长可达40 cm）进行成像。这一附加功能在树轮地貌学应用中具有重要意义，例如可用于识别微切片中应力木形成的起始位置。

本研究介绍了一种简化野外和实验室中岩心处理流程的方案。该新方法的核心是一种可重复使用的固定装置——新型GSC固定器（GärtnerSchneiderCore，GSC固定器），其使用3D建模软件设计，并通过3D打印机打印而成。GSC固定器使得在野外采集的岩心在无需重新包装或重新标记的情况下即可实现简便操作。我们还介绍了一种高效的新系统，用于对制备好的岩心表面进行数字化处理。该方案涵盖了从野外采样、样品制备、岩心表面数字化以供后续分析，直至最终将样品存入档案库的完整流程。

方案

1. 制备GSC固定装置

  1. 在兼容3D打印机的切片程序中打开支架的3D模型。创建一个3D打印机可读的打印文件（在本例中为 "*.gcode" 文件）。
    注意：3D模型可使用任意3D建模软件进行设计。
  2. 通过存储卡或U盘将打印文件传输至3D打印机，并在3D打印机上启动该打印文件。
  3. 支架打印完成后，等待其冷却至室温（RT）。随后，将支架所附着的打印平台从打印机上取下，并轻微弯曲平台，直至支架与表面分离。
  4. 清除支架上所有多余的线材或附着物。
    注意：单次打印的支架数量取决于打印机的尺寸。在打印平台尺寸为36 cm × 36 cm的3D打印机上，可一次性打印约30个长度为35 cm的支架。打印30个支架所需时间因设备而异，平均约需8小时（可进行过夜打印）。

2. 在野外提取、稳定和运输树木年轮样芯

  1. 使用配备扭矩增强器和生长锥的无线电钻，选择钻取位置，并将生长锥垂直于茎的生长轴放置。
    注意：也可手动操作生长锥完成相同步骤，无需使用无线电钻。
  2. 开始钻取，直至生长锥深入至少达到茎直径的一半。通过将取芯器（与生长锥等长）沿生长锥外侧平行放置，按上述方法检查钻取深度。
  3. 若使用无线电钻，需先取下电钻，将手柄装到生长锥上（手动使用生长锥时手柄已安装），然后取下取芯器，使其开口朝上，并完全插入生长锥内。
  4. 将生长锥反向旋转一圈，以切断树芯与茎的连接。取出包含树芯的取芯器。
  5. 将树芯从取芯器中取出。检查树芯的纤维方向，确保将树芯放入样品槽时纤维方向保持竖直。
    注意：可在树芯两端及侧面检查纤维方向。具体方法为将树芯对着光源并缓慢旋转，直至观察到某一侧面反光增强。这是由于该侧的径向细胞壁被纵向切割，反射光线的方式与其他部分不同。
  6. 将树芯置于样品槽上方，保持纤维方向竖直。用所有手指按压树芯顶部，直至其完全滑入样品槽中。
  7. 使用软铅笔在样品槽侧面标记树芯编号，该铅笔可在玻璃表面书写。
    注意：标记内容后续可用普通橡皮擦除。
  8. 将装有树芯的样品槽放入运输箱，并盖好箱盖。

3. 在实验室中制备已安装的岩心样本

  1. 可选：将已固定的芯样包埋于石蜡中，以备后续显微切片。
    1. 将一个带盖的钢盒（盖上装有可连接真空泵的阀门）置于加热板上，加入石蜡至约 2 cm 深度，加热至完全熔化。
    2. 从运输盒中取出已固定的芯样，将带有芯样的夹具直接放入熔化的石蜡中，然后盖上盖子。
    3. 启动真空泵，对容器施加持续且轻微的负压，持续约 2 小时。由于夹具结构开放，石蜡可无阻碍地渗入芯样内部。
    4. 停止真空泵并打开盖子，取出带芯样的夹具，放置于网格上，使其自然冷却。
    5. 如有需要，可去除夹具侧面多余的石蜡。
  2. 制备芯样表面
    1. 从运输盒或石蜡浴中取出已固定的芯样，将带芯样的夹具直接放入轮盘式切片机的样品夹中。确保芯样方向正确，使年轮的晚材部分朝向刀刃。
    2. 拧紧样品夹的螺丝，确保芯样夹具完全固定。
    3. 抬起样品夹，使芯样轻微接触刀刃，然后将刀刃沿芯样全长推进，切去顶部最表层部分。
    4. 将刀具退回到芯样后方，将样品夹向上移动数微米，重复上述操作，直至获得宽度至少为 2–3 mm 的平整表面。
    5. 一旦表面按预期切好，立即将芯样夹具从切片机的样品夹中取出。
      注意：建议使用轮盘式切片机切割芯样而非砂纸打磨，因为前者可获得更清洁、平整的表面，且细胞中不会残留粉尘。

4. 核心表面的数字化

  1. 将岩心夹持器带有平整岩心表面的一侧放置在成像系统的工作台上，本文以 WSL-Skippy 系统为例进行说明。
  2. 确保岩心夹持器与工作台或相机的移动方向对齐。
  3. 调整工作台位置，使带有岩心夹持器的部分位于相机正下方，并将最外圈环置于镜头视野中心。
  4. 在岩心起始端旁边放置一个标尺，并拍摄一张图像用于校准。
    注意：若连续拍摄多个岩心图像，此步骤仅需执行一次。
  5. 在软件中设定岩心长度，然后启动图像采集过程。当最后一张图像拍摄完成后，工作台将自动返回起始位置。
  6. 从工作台上取下样品，将下一个岩心夹持器置于相机下方，重复前述操作步骤，重新设定岩心长度，直至所有岩心均完成拍照。
  7. 使用无畸变的图像拼接软件（例如 PTGui）将各单幅图像拼接成一幅完整的岩心表面图像。

5. 芯片的保存

  1. 将装有分析样品的岩心架放入用3D打印机打印的便携式存储架中。
  2. 对存储架进行标记，以便从外部识别岩心样品。
  3. 将存储架放置在货架或其他可用的存档位置中保存。

结果

GSC-样品管架
默认情况下，样品管架的打印长度为 35 cm，几乎接近所用 3D 打印机（Original Prusa XL，构建体积 36 cm × 36 cm × 36 cm）的最大打印尺寸。若需容纳更长的岩心样品，可通过各管架两端的凹槽，使用小型连接件将多个管架连接，从而实现管架的延伸（图 2A）。

进行野外工作时，将岩心直接存入样品架所需的时间与将其简单放入吸管或其他包装材料的时间相当。尽管在将岩心压入样品架之前需要确认每根岩心的纤维方向（图2），但这一额外操作仅需数秒钟，且可借助放大镜完成。根据我们的经验，每10个岩心所需的额外时间（如有）总计约1分钟。这一极短的额外时间也适用于断裂的岩心。对于断裂岩心，无需逐段装入吸管，而只需将各段依次放入样品架并压紧即可。

为确保岩心在野外和运往实验室过程中的安全，我们设计并打印了一种特殊的运输盒，用于存放岩心及其夹持器（图3）。夹持器可直接放入该运输盒中，并通过盒内特制的小凸起固定，这些凸起恰好嵌入夹持器两端的凹槽内。运输盒可通过侧面的槽口插入盖子进行封闭。

新样品架的真正优势在实验室中尤为明显。无需再将岩心从麦管（或其他容器）中取出，使用胶水制备木质载片，将岩心固定在载片上，将标签转移至新载片，并等待至少数小时直至胶水完全干燥且稳定后才能进行后续处理。使用该样品架时，岩心可直接（i）固定在岩心切片机上以切出平整表面，或（ii）直接使用砂光机进行打磨，无需任何额外的预处理步骤。尤其避免了将标签转移到新载片过程中可能出现的传递错误。

由于样品 holder 可针对任意核心直径进行设计，因此无论需要用于“标准”5 mm 样品，还是用于同位素或其他化学分析的 10 mm 或 12 mm 样品，均不受影响。

与同位素或化学分析相关，该样品架的优点在于无需使用胶水或其他固定介质即可固定样品芯，因此样品芯不会受到污染，并且可以轻松地从样品架上取下以进行更特定的分析。此外，在木材解剖学分析方面，能够轻松地将样品芯从样品架上取下，便于对样品芯进行显微切片制备的常规操作。

将固定在持针器中的样本芯进行包埋是可选操作，可稳定敏感结构，因为细胞壁较薄的细胞在切片过程中容易破裂。与单纯添加玉米淀粉溶液相比，通过石蜡包埋来固定样本芯在许多情况下效率更高。

当需要对岩心进行后续检查或重新分析时，这种方案的另一个优势也会显现。这些样品架可放入专门设计的支架中（图4），也可使用3D打印机打印，其存储方式与运输箱中的存储方式类似。带有岩心的GSC样品架可直接放置于支架内，随后可在任意位置存放。支架的宽度，即单个支架可固定岩心的数量，取决于货架或存储空间的可用面积。支架模型可根据具体需求进行调整并相应打印。

对树芯或圆盘表面进行数字化
该图像采集系统由WSL开发（图5），可用于树轮的数字化（自动图像采集），以生成树木年轮增量芯或圆盘的高分辨率图像，从而支持高效、基于数字的年轮宽度测量。该系统由一块固定在螺纹杆上的平台组成，可在预设的0.1至1 cm步长下，带动样本在6100万像素相机（Sony Alpha 7R IV）的镜头（Sony FE 90 mm f/2.8 Macro）下方移动。图像通过相机的自动对焦系统拍摄，以确保每张单幅图像均清晰对焦。该相机的分辨率可实现每幅图像6500 dpi的实际分辨率，该数值通过使用SilverFast分辨率标板（USAF 1951）测试得出。与标称分辨率为4800 dpi的平板扫描仪相比，这一数值看似略低。然而，当使用Epson XL扫描仪以4800 dpi分辨率拍摄同一标板的图像进行测试时，所得图像的实际分辨率仅为1825 dpi（图6）。本系统所获图像的高分辨率可清晰显示单个细胞结构，从而在图像中准确界定年轮边界（图7）。若树芯或圆盘表面制备良好，则无需返回原始样本重新检查结构。在完成单幅图像的拼接后，所得的整根树芯图像即可使用用户偏好的分析软件进行分析。

该图像采集系统还可利用透射光对长度达40 cm的微小切片进行成像。此功能在树轮地貌学研究中具有重要意义，例如可用于识别整根树木年轮切片中反应木的形成起始位置或其他特定结构特征（图8）。

木材纹理分辨率对比，6400 dpi 与 4800 dpi 扫描，显微分析，放大细节。
图 1：Larix decidua Mill. 的扫描图像。 使用平板扫描仪以不同分辨率扫描的年轮图像。请点击此处查看此图的放大版本。

静力平衡示意图；展示结构分析、载荷分布和几何设置。
图2：GSC夹持器的示意图。（A）夹持器两端的开口可用于连接一根短杆，以固定较长的岩心。绿色箭头表示夹持器安装在岩心切片机中时所受压力的方向。左侧：白色箭头指示允许空气或液体（用于包埋）流通的开口。右侧：已压入岩心的GSC夹持器。（B）岩心的纤维方向必须保持垂直。（C）白线表示岩心的切割面。请点击此处查看该图的放大版本。

带盖筷子收纳盒，展示有序排列的筷子，便于取用和存放。
图3：用于在野外存放和运输带有岩心的GSC-支架的转运箱。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于沉积物和水过滤实验的玻璃珠过滤系统，展示分层结构。
图 4：用于最终存档保存 GSC 持有装置的存储架。 这些架子可堆叠放置，以节省空间。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于精密工程的数控机床设置，显示用于控制和分析的计算机界面。
图 5：WSL 开发的图像采集系统。 请点击此处查看此图的放大版本。

USAF 分辨率测试图对比；光学分辨率分析、扫描仪评估示意图。
图6：平板扫描仪与图像采集系统之间的图像分辨率比较。（A）SilverFast 分辨率测试标板（USAF 1951）。（B）使用指定分辨率为 4800 dpi（插值）的平板扫描仪扫描的图像，及其下方相应区域的放大图。（C）使用图像采集系统拍摄的图像，及其下方相应区域的放大图。请点击此处查看该图的放大版本。

年轮放大示意图；年龄分析、树木年轮学研究、细胞结构细节。
图 7：Larix decidua Mill. 增长芯样（上图）及其对应区域的局部放大图（下图）的组合图像。 组合图像中的单个图像由图像采集系统拍摄。请点击此处查看此图的高清版本。

显示肌节结构和横纹的横纹肌纤维显微图像，生物学研究。
图8：完整年轮增量钻取样本（Larix decidua Mill.）显微切片的合成图像及其相应区域的放大图。 合成图像中的各个单幅图像由图像采集系统在透射光下拍摄获得。请点击此处查看该图的高清大图。

讨论

将木材解剖学纳入树木生态学研究，极大地拓展了这些研究对过去环境条件进行新方法和深入分析的可能性28,29,30。这些新技术也加大了分析工作的强度，即生成目标数据所需的实验室时间有所增加。已有大量研究尝试优化实验工作流程，以减少木材解剖学技术在实验室中所需的时间9,12,13,15,30。然而，几乎无人致力于简化这些研究中常见的样本芯的处理、制备和储存流程。

3D打印在这方面提供了新的可能性9。这种新型3D打印岩心夹持器是首次尝试简化整个流程，使其耗时更少，因而效率更高。

虽然保存在塑料吸管31,32或类似容器中的岩心需要取出，以防止真菌在岩心外部（并很快蔓延至内部）生长，但固定在GSC样品架中的岩心则可保持原状。就此而言，其效果类似于将岩心保存在纸吸管中33。

一旦不再需要进行以下整个流程，其优势便显而易见：（i）从麦秆（或其他容器）中取出岩心，（ii）将岩心粘贴到木制载片上或固定在其他物体（如电缆支架）上，以及（iii）逐一转移每根岩心所对应编号的过程——后者几十年来几乎已成为标准操作，但可能存在出错风险34。

GSC固定架的开放式结构可避免样本在储存过程中发生真菌污染，而使用塑料容器储存则可能存在此类风险。如上所述，该固定架还支持石蜡包埋以增强结构稳定性。然而，这种"简易"包埋方法无法与常规使用包埋盒将样本完整包埋于石蜡块中的方法相媲美，后者常用于微芯样本的处理35。这种简易技术更类似于在切取显微切片时使用玉米淀粉进行支撑36。它能更好地稳定细胞结构，防止切片过程中细胞破裂，但相比直接添加玉米淀粉而言更为耗时。此类包埋方式并不能像整体包埋成蜡块那样对整个岩心样本提供充分支撑。若岩心发生断裂，切片也将随之破裂。由于GSC固定架可适配岩心切片机37，因此为后续数字化过程准备切片表面仅需数分钟。

在对树木年轮进行数字化处理时，常用于蓝光强度测量的平板扫描仪38,39在获取年轮结构的更精细图像方面效果不理想，因其生成的图像质量相对较低。尽管这些图像中能够观察到针叶树常见（较宽）年轮的边界，但窄年轮甚至密度波动几乎无法识别。

尽管目前出现了一些引人注目的高分辨率树木年轮数字化新方法，例如X射线CT40，但使用高分辨率数码相机仍然是生成高质量图像以进行后续测量的最高效且成本最低的方法。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Jussi Grießinger 教授对研发新型支架构想的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
核心切片机WSLhttps://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/用于从生长锥钻取的增量芯中切割显微切片的切片机
Epson Expression 10000XL EPSONhttps://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA平板扫描仪
GSC 样品架WSLin-house3D 打印的固定装置，用于样品芯的运输、制备、分析和储存
Skippy 图像采集系统WSLhttps://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) 由 WSL 开发的图像采集系统，配备 6100 万像素相机（Sony Alpha 7R IV 及 Sony FE 90mm f/2.8 Macro 镜头）

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