本文以采血进行免疫表型分析为例，介绍用于“野生型小鼠”的设施的结构和操作流程，包括微生物 containment 措施。
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方法文章
具有天然微生物群的小鼠实验设施的操作与生物安全防护程序：免疫表型分析流程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
使用具有天然微生物组的实验小鼠（如"野生型小鼠"）作为研究工具，因其与人类超级有机体高度相似，为基础科学和应用科学提供了极具前景的研究手段。然而，这类小鼠携带包括细菌、病毒和寄生虫在内的多样化微生物组 ，其繁育与维持对科研机构的动物饲养设施构成了重大挑战。为应对这些挑战，柏林夏里特大学医学中心（Charité - Universitätsmedizin Berlin）开发了一种专门用于饲养"野生型小鼠"的设施设计方案。该方案通过设计具备特定结构特征和运行规程的设施，有效控制天然微生物组的扩散，从而保护更高卫生标准区域的安全。
本文展示了一种从无特定病原体（SPF）小鼠和"野生型小鼠"采血用于免疫表型分析的方法，重点介绍了实验设施中实施的操作流程和生物安全防护措施。显著的研究结果表明，暴露于天然微生物组的"野生型小鼠"会形成独特的免疫细胞群体，而在严格无菌条件下饲养和维持的小鼠中，这些免疫细胞群体则显著减少。
本研究的意义在于有望为研究人员提供具有天然微生物组和成熟免疫系统（类似于成年人类）的小鼠模型。这种方法可能提高临床前研究结果向临床实践转化的能力，从而推动生物医学研究领域的发展。
引言
在基础科学和应用科学研究（如临床前研究和毒理学研究）中，小鼠实验仍然不可或缺。然而，实验室环境中的卫生标准化旨在减少生物噪声并最大限度地降低实验结果的变异性，在很大程度上排除了自然微生物群的存在。因此，卫生条件高度标准化、特定病原体不含（SPF）的小鼠从出生到饲养的环境，与人类和动物通常所暴露的真实世界环境存在显著差异。这种实验室条件与人类疾病实际发生环境之间的不匹配，导致了“标准化谬误”的产生：即认为最小化实验条件的变异能够改善研究成果向临床应用的转化。然而事实上，这种做法限制了研究发现的生物学相关性1,2。例如，研究已表明，SPF小鼠体内微生物和环境多样性的缺失可能导致免疫系统发育不全，从而削弱免疫学和临床前研究结果的有效性3。
已提出多种方法来应对小鼠模型中的生物学变异，每种方法都有其自身的优势和局限性，包括与野生小鼠和宠物店小鼠同笼饲养3,4,5,6,7,8、逐步暴露于共生微生物9、将动物饲养在户外围栏中10或使用大型动物的垫料11，以及来自野生小鼠的粪便移植12。“野生化小鼠”（Wildling mice）模型是一种具有前景的新型小鼠模型，适用于临床前和毒理学研究，该模型采用携带天然微生物组的标准实验室小鼠品系13。这些“野生化小鼠”通过将实验室小鼠品系的胚胎移植到捕获的野生母鼠体内而获得。在出生过程中，实验室小鼠品系会获得其代孕母鼠的天然微生物组，模拟人类分娩过程中发生的自然接种过程13。“野生化小鼠”可像其他任何实验室小鼠品系一样进行繁育，并且其天然微生物组可在多代之间稳定维持。
“野生型小鼠”携带多样化的微生物群——包括细菌、病毒和寄生虫——这些微生物通常被排除在SPF级小鼠设施之外。因此，在研究机构中维持自然微生物组存在挑战，因为必须在不损害整体SPF卫生标准的前提下对这些微生物进行管控。
在柏林夏里特大学医学中心，建立了一个专门用于“野生型小鼠”的设施，该设施通过严格的生物 containment 措施与 SPF 区域隔离开来。该设施包括繁殖和实验区域，确保“野生型小鼠”的天然微生物组得以维持，同时保护 SPF 区域（图 1）。
Charité 实验室种群的创始对小鼠引自德国埃尔兰根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）埃尔兰根大学医院微生物组研究中心建立的“野生小鼠”种群。在引进种群创始个体前，这些小鼠均附有健康证明，并经过扩展的动物源性病原体检测。将使用哨兵鼠对微生物组进行长期监测。无特定病原体（SPF）小鼠与“野生小鼠”均在相同条件下饲养。小鼠优先在II型长型独立通风笼具（IVC）中以每笼五只的群体进行繁育和饲养。设施内的温度为22 °C，光照/黑暗周期为12小时。小鼠饲喂标准谷物型饲料，并自由饮用自来水。“野生小鼠”无需对垫料和环境丰富物进行灭菌处理。然而，在饲养SPF小鼠的区域，对这些物品进行高压灭菌可防止材料混淆。
本方案展示了SPF小鼠和“野生型小鼠”的免疫表型分析流程，重点介绍了“野生型小鼠”设施中严格的微生物控制措施。这些措施在确保SPF环境完整性的同时，使研究人员能够利用携带天然微生物组的小鼠开展实验。
图1：野生型小鼠设施的布局。E1 = 设施入口。箭头表示进入设施的路径。E2 = 从设施外部进入层流空气舱的通道。PA = 带有风淋装置的人员气闸室。AS = 风淋装置。R1、R2 = 野生型小鼠繁育房间。R3 = 用于饲养野生型小鼠的房间。R4 = 用于饲养SPF级小鼠的房间。PR1 = SPF小鼠操作间。PR2 = 野生型小鼠操作间。SB = 无菌工作台。EE = 紧急出口。CR = 层流空气舱前的更衣室。LAF = 在保护性气流条件下进行操作的层流空气舱。A = 高压灭菌器。ER = 设备间。绿色箭头表示操作SPF动物时可通行的路径，黄色箭头表示经过风淋后可通往操作野生型小鼠的路径。蓝色箭头仅表示饲养人员的通行路径。红线标记的是层流空气舱内的玻璃墙，将空间划分为两个区域，分别可通过E1经PR2进入，或通过E2经CR进入。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
该设施用于 "野生小鼠" 涉及活体动物的实验程序已获得负责动物实验的州级主管部门批准， "柏林健康与社会事务局" （柏林卫生与消费者保护局，LAGeSo）。该方案的最重要步骤总结如下： 图2.
1. 获取Wilding设施的使用权限
- 从负责的动物福利官员处接受有关设施操作和生物 containment 程序的个人指导。
- 获取应答器钥匙以进入设施 "野生小鼠" 并通过在线预约系统预订操作间。
2. 进入设施 "野生小鼠"
- 将衣物存放在更衣室。
- 更换区域专用服装：裤子、罩衫和一次性鞋套（图3）。
3. 在SPF区域内对SPF小鼠进行采血
- 将SPF级小鼠（雄性和雌性，8-20周龄）从饲养房间（R4）通过封闭式IVC笼具转移至SPF动物操作间（PR1）。
- 开启层流工作台，并使用70%体积比的乙醇对工作台面进行消毒。所有操作均应在工作台内进行。
- 检查毛细管是否存在断裂或破损部位，以避免增加断裂风险或造成伤害。
- 在吸入式异氟烷短暂全身麻醉下（诱导浓度为5%异氟烷，使用富氧医用空气，随后以1.5%-2.0%维持麻醉），待小鼠足底回缩反射消失（通过夹趾测试确认）后，通过抓握颈部背侧皮肤褶皱压迫颈静脉。
- 用一只手以拇指和食指固定动物头部。将一根新的毛细管以45°角插入眼内眦处瞬膜下方，确保毛细管位于眼球与眼眶骨壁之间。
注意：为避免造成创伤，切勿使毛细管尖端接触眼球表面。 - 以轻柔的轴向旋转动作将毛细管穿过窦膜。持续在眼眶后部旋转毛细管，直至血液流出。使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管收集至少15 µL血液（约1滴）。
- 在拔出毛细管前，松开对颈部皮肤褶皱的抓握，以尽量减少组织内出血。为确保良好止血，使用干净的纱布垫或棉拭子压迫止血。
- 轻轻旋转采血管以混匀血液与EDTA，切勿剧烈震荡。将血液样本置于冰上保存。
- 对操作台面进行消毒，并关闭层流工作台。将SPF小鼠通过封闭式IVC笼具送回SPF饲养室（R4）。
4. 进入该区域以 "野生小鼠"
- 在风淋室（PA）的前室脱下鞋子和袜子。穿上区域专用袜子，以及包括Tyvek连体服、发网（如需要）、棉质手套、丁腈手套和口罩在内的全身个人防护装备（PPE）（图3）。
- 穿着袜子通过粘性地垫进入风淋室。在风淋过程中，举起双臂并完成360°旋转。
- 离开风淋室，并在另一侧穿上区域专用鞋。
5. 从"野生型小鼠"采血
- 将"野生型小鼠"（雄性和雌性，8–20 周龄）从饲养房间（R3）以封闭的 IVC 饲养盒转移至操作房间（PR2）。
- 开启超净工作台，并对工作区域表面进行消毒。
- 按照第 3 节中步骤 2–8 所述的 SPF 小鼠采样流程进行操作。
- 完成采血后，更换手套，对所有物品和表面进行消毒，关闭超净工作台。
6. 血液样本的外运 "野生小鼠" 通过层流空气柜（LAF 柜）区域
注意：操作间（PR2）内设有层流柜，用作物料传递舱和无菌操作室。样品通过层流柜转移出室。该区域从“Wildling”区域内部（经E1和PR2）和外部（经E2和CR）均可进入，中间由带滑动门的玻璃墙隔开（图1）。转移材料需两人配合完成：人员1（位于Wildling区域内，经PR2进入）执行步骤6.1和6.2；人员2（位于Wildling区域外，经E2进入）执行步骤6.3–6.5。
- 对样本容器进行消毒。通过LAF工作台玻璃墙上的滑动门取出样本容器。
- 在将样本容器移交至人员2完成后，从LAF工作台另一侧的人员2（在舱室罩衣间内穿戴防护服）处接收防护服，并将其处置。对所有表面进行消毒。
- 在LAF工作台前方的进入用LAF区域穿戴防护服（CR，图1）。
- 通过LAF工作台玻璃墙上的滑动门，无接触地从Wildling区域接收已消毒的样本容器。
- 脱下防护服，并通过滑动门将其传递至LAF工作台内部区域进行处置。
7. 用于"野生型小鼠"的设施离开流程
- 将一次性防护服和区域专用鞋留在区域内。丢弃发网、橡胶手套和口罩。
注意：鞋子和防护服可重复使用。 - 立即穿着区域专用袜进入风淋室。举起双臂，在风淋过程中完成360°旋转。
- 离开风淋室后，将区域专用袜放入洗衣收集箱。穿上自己的袜子和鞋子，并套上一次性鞋套。将区域专用衣物放入更衣室的洗衣收集箱中，并在更衣室内换上个人衣物。
8. 血液样本的处理与分析
- 将血液样本送至实验室。
- 配制荧光素偶联抗体染色液：每个样本加入 0.25 µL Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 TCR-β 链抗体、0.25 µL APC 标记的抗小鼠 CD4 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 785 标记的抗小鼠 CD8 抗体、0.25 µL FITC 标记的抗小鼠 CD44 抗体，以及 0.25 µL PerCP/Cyanine5.5 标记的抗小鼠 CD62L 抗体，溶于 50 µL 流式细胞术缓冲液（磷酸盐缓冲液，含 2 mM EDTA、0.1% 牛血清白蛋白，4 °C）中。避光冰上保存，直至步骤 8.8。
注意：所用荧光素可根据用于样本采集的流式细胞仪配置进行调整。
- 配制荧光素偶联抗体染色液：每个样本加入 0.25 µL Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 TCR-β 链抗体、0.25 µL APC 标记的抗小鼠 CD4 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 785 标记的抗小鼠 CD8 抗体、0.25 µL FITC 标记的抗小鼠 CD44 抗体，以及 0.25 µL PerCP/Cyanine5.5 标记的抗小鼠 CD62L 抗体，溶于 50 µL 流式细胞术缓冲液（磷酸盐缓冲液，含 2 mM EDTA、0.1% 牛血清白蛋白，4 °C）中。避光冰上保存，直至步骤 8.8。
- 对采血管进行消毒。向一个 5 mL 圆底聚苯乙烯管中加入 2 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液，并将该管置于冰上。
- 打开采血管，将 10 µL 血液加入含有流式细胞术缓冲液的管中，短暂涡旋混匀。
- 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液。加入 1 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液，短暂涡旋后，室温（RT）孵育 3 分钟。
- 加入 100 µL 10 倍浓缩 PBS。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
- 重复步骤 8.5–8.6。
- 吸除上清液。加入 50 µL 抗体染色液，涡旋混匀后，避光冰上孵育 20 分钟。
- 加入 1 mL 流式细胞术缓冲液。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液。加入 180 µL 流式细胞术缓冲液。
- 加入 20 µL SYTOX Blue 活死细胞染料（终浓度 1:1000），用于活细胞与死细胞的区分。
- 在流式细胞仪上采集样本，并使用流式细胞仪采集软件或流式细胞术数据分析程序进行数据分析。
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结果
“野生型小鼠”可能携带通常被排除在SPF设施之外的微生物，这对坚持严格卫生标准的科研机构动物饲养实践构成了挑战。在过去4年中，柏林夏里特医学院（Charité - Universitätsmedizin Berlin）与德国实验动物保护中心（Bf3R）的科学家和兽医通过合作，建立了一个专门用于饲养具有自然微生物组小鼠的设施，并实施了严格的生物 containment 措施（图1）。为实现这一设计，原有的小鼠设施进行了大规模改建，包括安装了气闸室和层流空气柜。饲养“野生型小鼠”与SPF小鼠的区域由气闸室分隔，且两个区域各自设有专用的操作室。耐热物品仅可通过高压灭菌器离开“野生型小鼠”区域，而热敏感材料（如样本）则可通过层流柜运出，以便在实验室区域进一步处理（图2）。必须严格遵守所有生物 containment 措施，以防止对维持SPF卫生条件的区域造成污染（图3）。总体而言，柏林夏里特医学院“野生型小鼠”设施的设计与生物 containment 措施为科研人员提...
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讨论
具有天然微生物组的小鼠由于更接近人类超级生物体，在基础科学和应用科学研究中是一种极具前景的研究工具3,9,10,11,12。将生物学复杂性纳入小鼠模型的尝试已催生出多种方法，每种方法均有其自身的优势与局限性3,7,8,9,10,11,12。"野生型...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由 Charité 3R| 替代 - 减少 - 优化项目资助。 S.P.R. 获德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）Emmy Noether 计划 RO 6247/1-1（项目编号 446316360）、DFG SFB1160 IMPATH（项目编号 256073931）以及 TRR 359 PILOT（项目编号 491676693）资助。S.J. 获德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）JO 1216/2-1 项目和德国多发性硬化症协会（DMSG e.V.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45 抗体 | BioLegend | 103127 | 克隆号 30F-11 |
| 动物饲料 | Altromin | 1324 | |
| APC 抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100515 | 克隆号 RM4-5 |
| 血液采集管 | Greiner | 450475 | MiniCollect K3E, K3EDTA |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| Brilliant Violet 605 抗小鼠 TCR-β 链抗体 | BioLegend | 109241 | 克隆号 H57-597 |
| Brilliant Violet 785 抗小鼠 CD8 抗体 | BioLegend | 100749 | 克隆号 53-6.7 |
| 毛细管 | Hirschmann | 9000210 | Hirschmann minicaps, Na-hep |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| FITC 抗小鼠 CD44 抗体 | BioLegend | 103021 | 克隆号 IM7 |
| PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD62L 抗体 | BioLegend | 104431 | 克隆号 MEL-14 |
| 磷酸盐缓冲液 (10x) | Gibco | 12579099 | |
| 磷酸盐缓冲液 (1x) | Gibco | 14190094 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | BioLegend | 420302 | |
| 圆底聚苯乙烯管 | Sarstedt | 55.476.005 | |
| SYTOX Blue 死细胞染料 | Invitrogen | S34852 | |
| Tyvek 防护服 (DuPont) | Fisher Scientific | 11371633 |
参考文献
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- Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).
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