具有天然微生物群的小鼠实验设施的操作与生物安全防护程序：免疫表型分析流程

摘要

本文以采血进行免疫表型分析为例，介绍用于“野生型小鼠”的设施的结构和操作流程，包括微生物 containment 措施。

摘要

使用具有天然微生物组的实验小鼠（如"野生型小鼠"）作为研究工具，因其与人类超级有机体高度相似，为基础科学和应用科学提供了极具前景的研究手段。然而，这类小鼠携带包括细菌、病毒和寄生虫在内的多样化微生物组 ，其繁育与维持对科研机构的动物饲养设施构成了重大挑战。为应对这些挑战，柏林夏里特大学医学中心（Charité - Universitätsmedizin Berlin）开发了一种专门用于饲养"野生型小鼠"的设施设计方案。该方案通过设计具备特定结构特征和运行规程的设施，有效控制天然微生物组的扩散，从而保护更高卫生标准区域的安全。

本文展示了一种从无特定病原体（SPF）小鼠和"野生型小鼠"采血用于免疫表型分析的方法，重点介绍了实验设施中实施的操作流程和生物安全防护措施。显著的研究结果表明，暴露于天然微生物组的"野生型小鼠"会形成独特的免疫细胞群体，而在严格无菌条件下饲养和维持的小鼠中，这些免疫细胞群体则显著减少。

本研究的意义在于有望为研究人员提供具有天然微生物组和成熟免疫系统（类似于成年人类）的小鼠模型。这种方法可能提高临床前研究结果向临床实践转化的能力，从而推动生物医学研究领域的发展。

引言

在基础科学和应用科学（如临床前研究和毒理学研究）中，小鼠实验仍然不可或缺。然而，实验室环境中的卫生标准化旨在减少生物噪声并最大限度地降低实验结果的变异性，在很大程度上导致了自然微生物群的缺失。因此，经过卫生标准化、特定病原体阴性（SPF）的小鼠从出生到饲养的条件，与人类和动物通常所暴露的真实世界环境存在差异。这种实验室条件与人类疾病实际发生环境之间的不匹配，导致了“标准化谬误”的产生：即认为最小化实验条件的变异可改善转化研究的结果。然而事实上，这种做法限制了研究发现的生物学相关性^1,2。例如，研究显示，SPF小鼠缺乏微生物和环境多样性，可能导致其免疫系统发育不全，从而削弱免疫学和临床前研究的有效性³。

已有多种方法被提出以应对小鼠模型中的生物学变异，每种方法均有其优势与局限性，包括与野生小鼠和宠物店小鼠同笼饲养^3,4,5,6,7,8、逐步暴露于共生微生物⁹、将动物饲养在户外围栏中¹⁰或使用大型动物的垫料¹¹，以及来自野生小鼠的粪便移植¹²。“野生化小鼠”（Wildling mice）模型是一种具有前景的新型小鼠模型，适用于临床前及毒理学研究，该模型采用携带天然微生物组的标准实验室小鼠品系¹³。这些“野生化小鼠”通过将实验室小鼠品系的胚胎移植到野外捕获的小鼠体内而获得。在出生过程中，实验室小鼠品系会获得其代孕母鼠的天然微生物组，模拟人类分娩过程中发生的自然接种过程¹³。“野生化小鼠”可像其他任何实验室小鼠品系一样进行繁育，并且其天然微生物组可在多代之间稳定维持。

“野生型小鼠”携带多样化的微生物群——包括细菌、病毒和寄生虫——这些微生物通常被排除在SPF级小鼠设施之外。因此，在研究机构中维持自然微生物组面临挑战，因为必须在不损害整体SPF卫生标准的前提下 containment 这些微生物。

在柏林夏里特大学医学中心，建立了专门用于“野生型小鼠”的设施，该设施通过严格的生物 containment 措施与SPF区域隔离开来。该设施包括繁育和实验房间，确保在维持“野生型小鼠”天然微生物组的同时保护SPF区域（图1）。

Charité 实验室小鼠种群的创始对来自德国埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）埃尔朗根大学医院微生物组研究中心建立的“野生型小鼠”种群。在引进种群创始鼠之前，这些小鼠均附有健康证明，并经过扩展的动物源性病原体检测。将使用哨兵鼠对微生物组进行长期监测。无特定病原体（SPF）小鼠与“野生型小鼠”在相同条件下饲养。小鼠优先在II型长型独立通风笼具（IVC）中以每组五只的规模进行繁育和饲养。设施内的温度为22 °C，光照/黑暗周期为12小时。小鼠饲喂标准谷物型饲料，并自由饮用自来水。“野生型小鼠”无需对垫料和环境丰富物品进行灭菌。然而，在饲养SPF小鼠的区域，对这些物品进行高压灭菌可避免材料混淆。

本方案展示了SPF小鼠和“野生型小鼠”的免疫表型分析流程，重点介绍了“野生型小鼠”设施中严格的微生物控制措施。这些措施在确保SPF环境完整性的同时，提供了利用具有天然微生物组的小鼠进行研究的优势。

图1：野生型小鼠设施布局图。E1 = 设施入口。箭头表示进入设施的路径。E2 = 从设施外部进入层流洁净台的通道。PA = 带有气淋装置的人员气闸室。AS = 气淋装置。R1、R2 = 野生型小鼠繁育房间。R3 = 野生型小鼠饲养房间。R4 = SPF级小鼠饲养房间。PR1 = SPF级小鼠操作室。PR2 = 野生型小鼠操作室。SB = 无菌操作台。EE = 紧急出口。CR = 层流洁净台前的更衣室。LAF = 在保护性气流条件下进行操作的层流洁净台。A = 高压灭菌器。ER = 设备间。绿色箭头表示操作SPF动物时可通行的路径，黄色箭头表示经过气淋后可通往操作野生型小鼠区域的路径。蓝色箭头仅表示饲养人员的通行路线。红线标记的是层流洁净台内部的玻璃隔墙，该墙将空间划分为两个区域，分别可通过E1经PR2进入，或通过E2经CR进入。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

该设施用于 "野生小鼠" 涉及活体动物的实验程序已获得负责动物实验的州级主管部门批准， "柏林健康与社会事务局" （柏林卫生与消费者保护局，LAGeSo）。该方案的最重要步骤总结如下： 图2.

1. 获取Wilding设施的使用权限

1. 从负责的动物福利官员处接受有关设施操作和生物 containment 程序的个人指导。
2. 获取应答器钥匙以进入设施 "野生小鼠" 并通过在线预约系统预订操作间。

2. 进入设施 "野生小鼠"

1. 将衣物存放在更衣室。
2. 更换区域专用服装：裤子、罩衫和一次性鞋套（图3）。

3. 在SPF区域内对SPF小鼠进行采血

1. 将SPF级小鼠（雄性和雌性，8-20周龄）从饲养房间（R4）通过封闭式IVC笼具转移至SPF动物操作间（PR1）。
2. 开启层流工作台，并使用70%体积比的乙醇对工作台面进行消毒。所有操作均应在工作台内进行。
3. 检查毛细管是否存在断裂或破损部位，以避免增加断裂风险或造成伤害。
4. 在吸入式异氟烷短暂全身麻醉下（诱导浓度为5%异氟烷，使用富氧医用空气，随后以1.5%-2.0%维持麻醉），待小鼠足底回缩反射消失（通过夹趾测试确认）后，通过抓握颈部背侧皮肤褶皱压迫颈静脉。
5. 用一只手以拇指和食指固定动物头部。将一根新的毛细管以45°角插入眼内眦处瞬膜下方，确保毛细管位于眼球与眼眶骨壁之间。
   注意：为避免造成创伤，切勿使毛细管尖端接触眼球表面。
6. 以轻柔的轴向旋转动作将毛细管穿过窦膜。持续在眼眶后部旋转毛细管，直至血液流出。使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管收集至少15 µL血液（约1滴）。
7. 在拔出毛细管前，松开对颈部皮肤褶皱的抓握，以尽量减少组织内出血。为确保良好止血，使用干净的纱布垫或棉拭子压迫止血。
8. 轻轻旋转采血管以混匀血液与EDTA，切勿剧烈震荡。将血液样本置于冰上保存。
9. 对操作台面进行消毒，并关闭层流工作台。将SPF小鼠通过封闭式IVC笼具送回SPF饲养室（R4）。

4. 进入该区域以 "野生小鼠"

1. 在风淋室（PA）的前室脱下鞋子和袜子。穿上区域专用袜子，以及包括Tyvek连体服、发网（如需要）、棉质手套、丁腈手套和口罩在内的全身个人防护装备（PPE）（图3）。
2. 穿着袜子通过粘性地垫进入风淋室。在风淋过程中，举起双臂并完成360°旋转。
3. 离开风淋室，并在另一侧穿上区域专用鞋。

5. 从"野生型小鼠"采血

1. 将"野生型小鼠"（雄性和雌性，8–20 周龄）从饲养房间（R3）以封闭的 IVC 饲养盒转移至操作房间（PR2）。
2. 开启超净工作台，并对工作区域表面进行消毒。
3. 按照第 3 节中步骤 2–8 所述的 SPF 小鼠采样流程进行操作。
4. 完成采血后，更换手套，对所有物品和表面进行消毒，关闭超净工作台。

6. 血液样本的外运 "野生小鼠" 通过层流空气柜（LAF 柜）区域

注意：操作间（PR2）内设有层流柜，用作物料传递舱和无菌操作室。样品通过层流柜转移出室。该区域从“Wildling”区域内部（经E1和PR2）和外部（经E2和CR）均可进入，中间由带滑动门的玻璃墙隔开（图1）。转移材料需两人配合完成：人员1（位于Wildling区域内，经PR2进入）执行步骤6.1和6.2；人员2（位于Wildling区域外，经E2进入）执行步骤6.3–6.5。

1. 对样本容器进行消毒。通过LAF工作台玻璃墙上的滑动门取出样本容器。
2. 在将样本容器移交至人员2完成后，从LAF工作台另一侧的人员2（在舱室罩衣间内穿戴防护服）处接收防护服，并将其处置。对所有表面进行消毒。
3. 在LAF工作台前方的进入用LAF区域穿戴防护服（CR，图1）。
4. 通过LAF工作台玻璃墙上的滑动门，无接触地从Wildling区域接收已消毒的样本容器。
5. 脱下防护服，并通过滑动门将其传递至LAF工作台内部区域进行处置。

7. 用于"野生型小鼠"的设施离开流程

1. 将一次性防护服和区域专用鞋留在区域内。丢弃发网、橡胶手套和口罩。
   注意：鞋子和防护服可重复使用。
2. 立即穿着区域专用袜进入风淋室。举起双臂，在风淋过程中完成360°旋转。
3. 离开风淋室后，将区域专用袜放入洗衣收集箱。穿上自己的袜子和鞋子，并套上一次性鞋套。将区域专用衣物放入更衣室的洗衣收集箱中，并在更衣室内换上个人衣物。

8. 血液样本的处理与分析

1. 将血液样本送至实验室。
   1. 配制荧光素偶联抗体染色液：每个样本加入 0.25 µL Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 TCR-β 链抗体、0.25 µL APC 标记的抗小鼠 CD4 抗体、0.25 µL Brilliant Violet 785 标记的抗小鼠 CD8 抗体、0.25 µL FITC 标记的抗小鼠 CD44 抗体，以及 0.25 µL PerCP/Cyanine5.5 标记的抗小鼠 CD62L 抗体，溶于 50 µL 流式细胞术缓冲液（磷酸盐缓冲液，含 2 mM EDTA、0.1% 牛血清白蛋白，4 °C）中。避光冰上保存，直至步骤 8.8。
      注意：所用荧光素可根据用于样本采集的流式细胞仪配置进行调整。
2. 对采血管进行消毒。向一个 5 mL 圆底聚苯乙烯管中加入 2 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液，并将该管置于冰上。
3. 打开采血管，将 10 µL 血液加入含有流式细胞术缓冲液的管中，短暂涡旋混匀。
4. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
5. 吸除上清液。加入 1 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液，短暂涡旋后，室温（RT）孵育 3 分钟。
6. 加入 100 µL 10 倍浓缩 PBS。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
7. 重复步骤 8.5–8.6。
8. 吸除上清液。加入 50 µL 抗体染色液，涡旋混匀后，避光冰上孵育 20 分钟。
9. 加入 1 mL 流式细胞术缓冲液。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
10. 吸除上清液。加入 180 µL 流式细胞术缓冲液。
11. 加入 20 µL SYTOX Blue 活死细胞染料（终浓度 1:1000），用于活细胞与死细胞的区分。
12. 在流式细胞仪上采集样本，并使用流式细胞仪采集软件或流式细胞术数据分析程序进行数据分析。

结果

“野生型小鼠”可能携带通常被SPF设施排除的微生物，这对坚持严格卫生标准的科研机构动物饲养实践构成了挑战。在过去4年中，柏林夏里特医科大学（Charité - Universitätsmedizin Berlin）和德国实验动物保护中心（Bf3R）的科学家与兽医通过合作，建立了一个专门用于拥有自然微生物组小鼠的设施，并实施了严格的生物 containment 措施（图1）。为实现这一设计，原有的小鼠设施经历了大规模改造，包括安装了气闸淋浴间（air shower）和层流空气柜（laminar airflow cabin）。饲养“野生型小鼠”与SPF小鼠的区域由气闸淋浴间分隔，且两个区域各自配备独立的操作室。耐热材料仅可通过高压灭菌器离开“野生型小鼠”区域，而热敏感材料（如样本）则可通过层流柜运出，以便在实验室区域进一步处理（图2）。必须严格遵守所有生物 containment 措施，以防止对维持SPF卫生条件的区域造成污染（图3）。总体而言，柏林夏里特医科大学“野生型小鼠”设施的设计与生物 containment 措施，使科研人员能够在开展具有自然微生物组小鼠研究的同时，有效防止微生物向更高卫生等级动物区域的扩散。

流式细胞术是细胞免疫学中的金标准方法，用于研究血液和组织中免疫细胞群体在环境条件改变时的响应情况。例如，成年人体内有大量在外周血中循环的记忆T细胞，这些细胞是在暴露于环境中微生物后发育形成的³。在此，流式细胞术被用于检测在SPF条件下饲养的小鼠血液中的记忆T细胞，以及“野生型小鼠”血液中的记忆T细胞（图4）。“野生型小鼠”定植了天然微生物组，其体内存在一个独特的记忆T细胞群体。相比之下，在SPF条件下饲养和维持的小鼠，其外周血中的记忆T细胞数量显著减少。因此，流式细胞术可用于表征不同微生物环境对免疫系统组成的影响。通过增加更多的免疫细胞标志物，可进一步提高数据的精细程度。近年来发展的流式细胞技术，如飞行时间流式细胞术（Cytometry by Time-of-Flight, CyTOF）和光谱流式细胞术，能够获取多个参数的信息，从而扩展在同一份血液或组织样本中可定量的免疫细胞（亚）群的数量。此外，细胞因子的细胞内产生情况也可通过流式细胞术进行评估，从而揭示细胞在天然微生物组刺激下的功能特性。

图2：野生型动物设施中的工作流程。 血液采样与样本处理仅为示例，可替换为其他操作，例如伴随组织取样的外科干预及组织学分析。有关缩写，请参见图1的图注。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：SPF区域与野生型动物区域个人防护装备（PPE）要求的比较。 在SPF区域（左侧），标准PPE仅需单层防护服装。相比之下，进入野生型动物区域（右侧）前需完成三步PPE流程，方可进入风淋室：首先穿戴kasac（防护内衣 = 第1步），然后在外层套上连体防护服（第2步）。这一额外的防护层有助于维持卫生，并防止区域间的交叉污染。通过风淋后，必须更换为指定用于野生型动物区域的鞋子（第3步）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：“野生化小鼠”的免疫表型分析。采集14周龄雄性SPF级小鼠（n = 5）和“野生化小鼠”（n = 5）的血液样本，使用针对CD45、TCR-β链、CD4、CD8、CD44和CD62L的荧光标记抗体混合物进行染色。数值表示亲本设门范围内的细胞比例，±标准差。SPF小鼠的设门策略如图所示，最后两张图分别为SPF小鼠和“野生化小鼠”的结果。与在SPF条件下繁育和饲养的小鼠相比，“野生化小鼠”中的中央记忆性T细胞和效应记忆性T细胞比例增加。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

具有天然微生物组的小鼠由于更接近人类超级生物体，在基础科学和应用科学研究中是一种极具前景的研究工具^3,9,10,11,12。将生物学复杂性纳入小鼠模型的尝试已催生出多种方法，每种方法均有其自身的优势与局限性^{3,7,8,9,10,11,12}。"野生型小鼠"结合了受控实验室环境与天然微生物组的优势。该方法在保持实验条件稳定性的同时，保留了研究复杂生物相互作用所必需的天然微生物多样性。因此，在"野生型小鼠"中开发和测试的生物医学疗法在向临床应用转化方面具有巨大潜力。

然而，仍需确定在哪些临床前疾病模型中“野生型小鼠”"，优于SPF小鼠。此外，具有自然微生物组的小鼠携带一些高传染性的寄生虫等微生物，这些微生物通常被排除在机构设施之外。因此，在研究机构中繁育和使用这类小鼠对动物饲养管理实践构成了挑战。

建立“"野生型小鼠"”设施是柏林夏里特医学院（Charité - Universitätsmedizin）、德国实验动物保护中心（Bf3R）以及埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）的科学家、兽医和机构官员共同协作完成的。在完成设施方案设计后，一座现有的小鼠设施经历了大规模改建，以纳入严格的生物 containment 措施。该设施已获得生物安全二级（BSL-2）认证，可用于涉及人类病原体的研究工作。

此处为设施内的操作与生物 containment 程序 "野生小鼠" 以流式细胞术进行免疫表型分析的血液采样为例进行描述。在设施内工作时，必须严格遵守生物安全 containment 措施。 "野生小鼠" 为防止微生物扩散至动物设施的其他区域，必须采取相应措施。这包括将进入设施的人员限制在研究团队所需的最少人数。此外，在首次进入设施前，必须参加由机构动物福利官员组织的强制性入门培训。有关在Wildling设施内工作的通用信息和标准操作规程（SOP）也可在内部网站上获取。"野生型维基")^14,15.

在设施内工作时，必须正确穿戴个人防护装备（PPE）。例如，必须确保没有头发暴露在发网外，因为寄生虫卵可能附着在头发上。如果实验同时涉及"Wildling小鼠"和SPF小鼠，则必须优先处理SPF小鼠。设施内"Wildling小鼠"和SPF小鼠的区域由风淋室隔开，每个区域均配备专用的操作间。这些操作间可通过在线预约系统进行预订，以确保工作流程顺畅并限制设施内的人员数量。每个屏障区域内，每个操作间（PR1、PR2、LAF）最多允许两人同时工作。若实验需要额外人员以确保操作符合伦理且技术熟练，则可例外。小鼠在其所属区域内通过密闭的IVC笼盒在房间之间转移，笼盒只能在层流台下打开，以确保微生物 containment 和操作安全。"Wilding小鼠"区域的操作间内还设有层流柜（LAF cabin）。该层流柜必须用于"Wildling小鼠"的解剖和手术操作，包括胚胎移植。胚胎移植在"Wilding小鼠"研究中是一项关键操作，用于构建新的"Wildling小鼠"模型。例如，将遗传修饰（GMO）小鼠品系的胚胎移植到野生型"Wilding小鼠"体内，可用于创建Wildling GMO品系。层流柜 也用于样本的外运，此过程需要与"Wildling小鼠"区域外的人员协调。进一步的样本处理可在相邻的实验空间进行，使研究人员能够就地处理时间敏感性材料，同时限制来自"Wildling小鼠"的样本处理地点。

所有其他材料必须保留在Wildling设施内，或在带出设施前经过高压灭菌处理。工作结束后，所有材料和表面均须使用适用于BSL2条件的消毒剂进行消毒。进入该设施的人员在离开前 "野生小鼠" 当天禁止进入其他任何动物设施。

在该机构中，研究工作是在科学联盟的框架下进行的 "健康与疾病中的野生型小鼠模型（Wildling HeaD）" 促进使用相关技术的科研人员之间的交流 "野生小鼠"，以及方法与专业知识的交流。该联盟由柏林健康研究所（BIH）负责任研究 QUEST 中心的 Responsible PrecliniX 项目支持，该中心协助开展动物实验的预注册程序、严谨的实验设计和质量管理（www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix）。

总之，已建成一个配备严格生物 containment 措施的先进设施，以支持安全且符合伦理的临床前研究。该设施有助于开展 "野生小鼠，" 这些设施拥有天然的微生物组，有效弥合了受控实验室条件与类似真实世界的微生物环境之间的差距。要建设此类设施，必须优先推动团队科学和跨学科合作，整合科学家、兽医和机构管理人员的专业知识，以确保高生物安全防护环境的有效设计与运行。此外，实施严格的生物安全防护措施、提供全面的培训以及制定明确的标准操作程序（SOPs）至关重要。建立高效的沟通机制（例如内部维基系统），并持续监测和验证实验条件，将进一步提升设施在管理复杂模型时的有效性与安全性。 "野生小鼠".

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45 抗体	BioLegend	103127	克隆号 30F-11
动物饲料	Altromin	1324
APC 抗小鼠 CD4 抗体	BioLegend	100515	克隆号 RM4-5
血液采集管	Greiner	450475	MiniCollect K3E, K3EDTA
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Brilliant Violet 605 抗小鼠 TCR-β 链抗体	BioLegend	109241	克隆号 H57-597
Brilliant Violet 785 抗小鼠 CD8 抗体	BioLegend	100749	克隆号 53-6.7
毛细管	Hirschmann	9000210	Hirschmann minicaps, Na-hep
EDTA	Corning	46-034-CI
FITC 抗小鼠 CD44 抗体	BioLegend	103021	克隆号 IM7
PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD62L 抗体	BioLegend	104431	克隆号 MEL-14
磷酸盐缓冲液 (10x)	Gibco	12579099
磷酸盐缓冲液 (1x)	Gibco	14190094
红细胞裂解缓冲液	BioLegend	420302
圆底聚苯乙烯管	Sarstedt	55.476.005
SYTOX Blue 死细胞染料	Invitrogen	S34852
Tyvek 防护服 (DuPont)	Fisher Scientific	11371633