本文以采血进行免疫表型分析为例，介绍用于“野生型小鼠”的设施的结构和操作流程，包括微生物 containment 措施。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
具有天然微生物群的小鼠实验设施的操作与生物安全防护程序：免疫表型分析流程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
使用具有天然微生物组的实验小鼠（如"野生型小鼠"）作为研究工具，因其与人类超级有机体高度相似，为基础科学和应用科学提供了极具前景的研究手段。然而，这类小鼠携带包括细菌、病毒和寄生虫在内的多样化微生物组 ，其繁育与维持对科研机构的动物饲养设施构成了重大挑战。为应对这些挑战，柏林夏里特大学医学中心（Charité - Universitätsmedizin Berlin）开发了一种专门用于饲养"野生型小鼠"的设施设计方案。该方案通过设计具备特定结构特征和运行规程的设施，有效控制天然微生物组的扩散，从而保护更高卫生标准区域的安全。
本文展示了一种从无特定病原体（SPF）小鼠和"野生型小鼠"采血用于免疫表型分析的方法，重点介绍了实验设施中实施的操作流程和生物安全防护措施。显著的研究结果表明，暴露于天然微生物组的"野生型小鼠"会形成独特的免疫细胞群体，而在严格无菌条件下饲养和维持的小鼠中，这些免疫细胞群体则显著减少。
本研究的意义在于有望为研究人员提供具有天然微生物组和成熟免疫系统（类似于成年人类）的小鼠模型。这种方法可能提高临床前研究结果向临床实践转化的能力，从而推动生物医学研究领域的发展。
引言
在基础科学和应用科学研究（如临床前研究和毒理学研究）中，小鼠实验仍然不可或缺。然而，实验室环境中的卫生标准化旨在减少生物噪声并最大限度地降低实验结果的变异性，在很大程度上排除了自然微生物群的存在。因此，卫生条件高度标准化、特定病原体不含（SPF）的小鼠从出生到饲养的环境，与人类和动物通常所暴露的真实世界环境存在显著差异。这种实验室条件与人类疾病实际发生环境之间的不匹配，导致了“标准化谬误”的产生：即认为最小化实验条件的变异能够改善研究成果向临床应用的转化。然而事实上，这种做法限制了研究发现的生物学相关性1,2。例如，研究已表明，SPF小鼠体内微生物和环境多样性的缺失可能导致免疫系统发育不全，从而削弱免疫学和临床前研究结果的有效性3。
已提出多种方法来应对小鼠模型中的生物学变异，每种方法都有其自身的优势和局限性，包括与野生小鼠和宠物店小鼠同笼饲养3,4,5,6,7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
该设施用于 "野生小鼠" 涉及活体动物的实验程序已获得负责动物实验的州级主管部门批准， "柏林健康与社会事务局" （柏林卫生与消费者保护局，LAGeSo）。该方案的最重要步骤总结如下： 图2.
1. 获取Wilding设施的使用权限
- 从负责的动物福利官员处接受有关设施操作和生物 containment 程序的个人指导。
- 获取应答器钥匙以进入设施 "野生小鼠" 并通过在线预约系统预订操作间。
2. 进入设施 "野生小鼠"
- 将衣物存放在更衣室。
- 更换区域专用服装：裤子、罩衫和一次性鞋套（图3）。
3. 在SPF区域内对SPF小鼠进行采血
- 将SPF级小鼠（雄性和雌性，8-20周龄）从饲养房间（R4）通过封闭式IVC笼具转移至SPF动物操作间（PR1）。
- 开启层流工作台，并使用70%体积比的乙醇对工作台面进行消毒。所有操作均应在工作台内....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
“野生型小鼠”可能携带通常被排除在SPF设施之外的微生物，这对坚持严格卫生标准的科研机构动物饲养实践构成了挑战。在过去4年中，柏林夏里特医学院（Charité - Universitätsmedizin Berlin）与德国实验动物保护中心（Bf3R）的科学家和兽医通过合作，建立了一个专门用于饲养具有自然微生物组小鼠的设施，并实施了严格的生物 containment 措施（图1）。为实现这一设计，原有的小鼠设施进行了大规模改建，包括安装了气闸室和层流空气柜。饲养“野生型小鼠”与SPF小鼠的区域由气闸室分隔，且两个区域各自设有专用的操作室。耐热物品仅可通过高压灭菌器离开“野生型小鼠”区域，而热敏感材料（如样本）则可通过层流柜运出，以便在实验室区域进一步处理（图2）。必须严格遵守所有生物 containment 措施，以防止对维持SPF卫生条件的区域造成污染（图3）。总体而言，柏林夏里特医学院“野生型小鼠”设施的设计与生物 containment 措施为科研人员提.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
具有天然微生物组的小鼠由于更接近人类超级生物体，在基础科学和应用科学研究中是一种极具前景的研究工具3,9,10,11,12。将生物学复杂性纳入小鼠模型的尝试已催生出多种方法，每种方法均有其自身的优势与局限性3,7,8,9,10,11,12。"野生型.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由 Charité 3R| 替代 - 减少 - 优化项目资助。 S.P.R. 获德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）Emmy Noether 计划 RO 6247/1-1（项目编号 446316360）、DFG SFB1160 IMPATH（项目编号 256073931）以及 TRR 359 PILOT（项目编号 491676693）资助。S.J. 获德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）JO 1216/2-1 项目和德国多发性硬化症协会（DMSG e.V.）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45 抗体 | BioLegend | 103127 | 克隆号 30F-11 |
| 动物饲料 | Altromin | 1324 | |
| APC 抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100515 | 克隆号 RM4-5 |
| 血液采集管 | Greiner | 450475 | MiniCollect K3E, K3EDTA |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| Brilliant Violet 605 抗小鼠 TCR-β 链抗体 | BioLegend | 109241 | 克隆号 H57-597 |
| Brilliant Violet 785 抗小鼠 CD8 抗体 | BioLegend | 100749 | 克隆号 53-6.7 |
| 毛细管 | Hirschmann | 9000210 | Hirschmann minicaps, Na-hep |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| FITC 抗小鼠 CD44 抗体 | BioLegend | 103021 | 克隆号 IM7 |
| PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD62L 抗体 | BioLegend | 104431 | 克隆号 MEL-14 |
| 磷酸盐缓冲液 (10x) | Gibco | 12579099 | |
| 磷酸盐缓冲液 (1x) | Gibco | 14190094 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | BioLegend | 420302 | |
| 圆底聚苯乙烯管 | Sarstedt | 55.476.005 | |
| SYTOX Blue 死细胞染料 | Invitrogen | S34852 | |
| Tyvek 防护服 (DuPont) | Fisher Scientific | 11371633 |
参考文献
- Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
- Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
- Beura, L. K., et al.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
