微针贴片的制备与表征及其用于外泌体装载与递送

摘要

外泌体具有重要的临床应用潜力，但其实际应用受限于易降解和难以稳定保存等问题 体内 清除率高且稳定性差。微针技术通过穿透生理屏障实现局部递送，并可在干燥状态下保存，从而克服了外泌体给药的局限性，拓展其临床应用价值。

摘要

外泌体作为一种新兴的"下一代"生物治疗剂和药物递送载体，在从药物递送、再生医学到疾病诊断和肿瘤免疫治疗等多个生物医学领域展现出巨大潜力。然而，传统推注给药方式导致外泌体迅速被清除，且其稳定性较差，限制了其临床应用。微针可作为一种解决方案，延长外泌体在给药部位的滞留时间，从而维持药物浓度，实现持续的治疗效果。此外，微针还具备维持生物活性物质稳定性的能力。因此，我们介绍一种用于负载和递送外泌体的微针贴片，并分享相关方法，包括外泌体的分离、载外泌体微针贴片的制备及其表征。该微针贴片采用海藻糖和透明质酸作为针尖材料，聚乙烯吡咯烷酮作为背衬材料，通过两步浇铸法制备而成。微针具有良好的机械强度，针尖可承受2 N的力。实验中使用猪皮模拟人体皮肤，微针刺入皮肤后，针尖在60秒内完全溶解。从微针中释放的外泌体在形态、粒径、标志蛋白及生物学功能方面均与新鲜外泌体相当，能够被树突状细胞摄取并促进其成熟。

引言

外泌体是由细胞释放到细胞外基质中的小囊泡，被认为在多种疾病和癌症的治疗中具有作为生物治疗剂和药物递送载体的潜力¹在生物合成过程中，外泌体包裹了细胞内的多种生物活性分子，包括功能蛋白和核酸²因此，在运输过程中被受体细胞摄取后，外泌体能够调控靶细胞中的基因表达和细胞功能³作为一种天然的信息传递介质，外泌体已在组织再生、免疫调节以及作为递送载体方面得到充分应用⁴通过工程技术，可将特定配体富集于外泌体表面，从而诱导或抑制受体细胞中的信号事件，或靶向特定细胞类型⁵化疗药物也可被载入外泌体用于癌症治疗⁶此外，外泌体能够穿过血脑屏障以递送治疗性载荷，因此在脑部疾病治疗中具有广阔的应用前景⁷与脂质体相比，外泌体表现出更强的细胞摄取能力和更优的生物相容性⁸它们能够高效进入其他细胞，同时表现出更好的耐受性和更低的毒性⁹然而，外泌体的传统团注给药方式容易在血液中被肝脏、肾脏和脾脏截留并迅速清除¹⁰此外，外泌体的稳定性较差 体外 且易受储存条件影响，限制了其临床应用....

方案

本研究无需伦理审批，因为第3节所述实验所用猪皮系从市场购买的食用猪耳，而非来源于实验动物。

1. 外泌体的分离

1. 细胞培养
   1. 在直径为15 cm的培养皿中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液（100×）（见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养小鼠卵巢上皮癌细胞ID8。
   2. 将ID8细胞置于CO₂培养箱（见材料表）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养，直至细胞密度达到90%。
2. 外泌体的分离
   1. 移除培养皿中的培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次。加入不含胎牛血清（见材料表）和青霉素-链霉素溶液（见材料表）的DMEM培养基20 mL。继续在37 °C、5% CO₂条件下培养48小时。
   2. 收集20个直径15 cm培养皿的细胞培养上清液。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，收集上清液以去除游离细胞。
   3. 在4 °C条件下以2000 × g离心10分钟，收集上清液以去除细胞碎片。
   4. 将0.2....

结果

本文介绍了一种外泌体分离、exo@MN 贴片制备及其表征的实验方案。图1展示了exo@MN贴片的制备流程图。将外泌体与海藻糖和透明质酸（HA）混合后，加入微针模具中并进行离心。该过程促使外泌体在针尖处聚集，从而实现快速释放。干燥后，加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液并再次离心，以完全填充模具。待其完全干燥后，脱模即获得exo@MN贴片。采用显微镜和扫描电镜（SEM）对微针的形貌进行表征，结果如图2所示。exo@MN贴片的针尖呈圆锥形，排列为10 × 10阵列，针尖锐利且结构完整。微针针尖可承受2 N的力，足以穿透皮肤屏障。此外，采用猪皮作为人皮肤的替代模型，模拟exo@MN贴片的应用过程。将贴片按压至猪皮表面以观察释放时间，结果显示微针针尖在60秒内完全溶解。将exo@MN贴片溶解于DPBS中进行表征，结果如图3所示。透射电镜（TEM）图像显示囊泡具有典型的杯状结构，符合外泌体的形态特征。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定exo@MN溶液的粒径分布，结果显示颗粒.......

讨论

目前，分离外泌体的主要方法包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫亲和磁珠法以及微流控技术²⁴。由于微针针尖空间较小，导致其载药能力有限，因此有必要提高外泌体的浓度以实现更高载量。为此，我们选择先采用超滤法浓缩细胞培养上清液，再通过超速离心法分离外泌体。通过少量液体重悬的方式提高了外泌体的浓度，使微针能够负载数十至数百微克的外泌体。然而，该方法所获得的外泌体溶液中仍含有大量蛋白质杂质，且在离心过程中会造成显著的外泌体损失。目前，外泌体在治疗应用中的局限性之一，正是缺乏能够高效、高纯度、大规模分离外泌体的有效方法。随着外泌体临床潜力的不断探索，未来亟需开发更先进的技术以应对提取过程中的各项挑战。

本研究的关键技术在于基于外泌体的微针设计。为了最大限度减少外泌体的浪费并实现更强的治疗效果，采用了一种两步浇铸法来制备exo@MN贴片。已有文献报道，海藻糖是适合用于外泌体冻干保存的材料²⁵，而透明质酸（HA）具有优异的生物相容性、亲水性，并在抑制炎症和促进皮肤修复方面发挥功能

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100倍青霉素-链霉素溶液	杰润生物科学	MA0110	细胞培养
180 kDa 预染蛋白标记物	赛默飞世尔科技	26616	蛋白质印迹法
3% 醋酸铀酰	河南瑞鑫实验用品	GZ02625	外泌体的形态学表征
3D 打印机	BMF 技术	nanoArch S130	模具制备
4%–20% 预制胶	Genscript	ExpressPlus PAGE 凝胶	蛋白质印迹法
5× SDS-PAGE 上样缓冲液	泰坦	04048254	蛋白质印迹法
抗小鼠Alix抗体	Biolegend	12422-1-AP	蛋白质印迹法
抗小鼠CD63抗体	Biolegend	ab217345	蛋白质印迹法
APC 抗小鼠 CD80 抗体	Biolegend	104713	抗体
自动匀胶机	自主	JBA5-100	微针的形态学表征
BCA 法检测试剂盒	Beyotime	P0012	蛋白质浓度测定
离心	赛默飞世尔科技	Muitifuge X1R pro	细胞离心机
循环水真空泵	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	过滤
CO2培养箱	Eppendorf	CellXpert C170	细胞培养
共聚焦激光扫描显微镜	尼康	A1HD25	荧光成像
铜网	北京中精科仪科技	JF-ZJKY/300	外泌体的形态学表征
D-(+)-海藻糖二水合物	Aladdin	5138-23-4	微针的制备
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’s 培养基	Meilunbio	MA0212	细胞培养
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液	美仑生物	MA0010	细胞培养
电泳系统	Bio-rad	PowerPac-basic	蛋白质印迹法
胎牛血清	杰润生物科学	JR100	细胞培养
FITC 标记的抗小鼠 CD11c 抗体	Biolegend	117305	抗体
流式细胞术	BD	LSR Fortessa	荧光检测
凝胶成像仪	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	蛋白质印迹法
HRP标记的山羊抗兔IgG	CST	7074S	蛋白质印迹法
HTL 树脂	BMF 技术		模具制备
透明质酸（分子量 = 300 kDa）	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	微针的制备
浸油	尼康	MXA22168	荧光成像
离子清洗器	JEOL	EC-52000IC	外泌体的形态学表征
显微镜	Olympus	CKX53	观察微针尖端的溶解过程
小鼠卵巢上皮癌细胞 ID8	MeisenCTCC	CC90105	细胞培养
纳米颗粒跟踪分析	Particle Metrix	ZetaView	外泌体大小分析
太平洋蓝标记的抗小鼠 I-A/I-E 抗体	Biolegend	107619	抗体
苯甲基磺酰氟	Beyotime	ST507	蛋白酶抑制剂
等离子清洗机	合肥科晶材料技术	PDC-36G	微针的制备
聚二甲基硅氧烷	道康宁	9016-00-6	模具制备
聚乙烯吡咯烷酮（分子量 = 40 kDa）	Aladdin	9003-39-8	微针的制备
Prism	GraphPad	版本 9	统计分析
PVDF膜	Millipore	IPVH00010	蛋白质印迹法
快速离心机	贝克曼	344619	外泌体提取
RIPA裂解缓冲液	Applygen	C1053	裂解膜
罗斯威尔公园纪念研究所1640	美仑生物	MA0548	细胞培养
扫描电子显微镜	JEOL	JSM-IT800	微针的形态学表征
体视显微镜	奥林巴斯	SZX16	形态学表征
超敏ECL检测试剂	Applygen	P1030	蛋白质印迹法
拉力计	Instron	68SC-05	机械测试
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2100plus	外泌体的形态学表征
Tris缓冲盐水	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	蛋白质印迹法
Tween-20	Beyotime	ST825	蛋白质印迹法
超速离心机	贝克曼	Optima XPN-100	外泌体提取
超滤管	Millipore	UFC910096	外泌体浓度
真空干燥箱	上海易恒科技	DZF-6024	微针的制备
真空过滤系统	Biosharp	BS-500-XT	过滤