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微针贴片的制备与表征及其用于外泌体装载与递送

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DOI：

10.3791/67109

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2024年7月12日

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

外泌体具有重要的临床应用潜力，但其实际应用受限于易降解和难以稳定保存等问题 体内 清除率高且稳定性差。微针技术通过穿透生理屏障实现局部递送，并可在干燥状态下保存，从而克服了外泌体给药的局限性，拓展其临床应用价值。

摘要

外泌体作为一种新兴的"下一代"生物治疗剂和药物递送载体，在从药物递送、再生医学到疾病诊断和肿瘤免疫治疗等多个生物医学领域展现出巨大潜力。然而，传统推注给药方式导致外泌体迅速被清除，且其稳定性较差，限制了其临床应用。微针可作为一种解决方案，延长外泌体在给药部位的滞留时间，从而维持药物浓度，实现持续的治疗效果。此外，微针还具备维持生物活性物质稳定性的能力。因此，我们介绍一种用于负载和递送外泌体的微针贴片，并分享相关方法，包括外泌体的分离、载外泌体微针贴片的制备及其表征。该微针贴片采用海藻糖和透明质酸作为针尖材料，聚乙烯吡咯烷酮作为背衬材料，通过两步浇铸法制备而成。微针具有良好的机械强度，针尖可承受2 N的力。实验中使用猪皮模拟人体皮肤，微针刺入皮肤后，针尖在60秒内完全溶解。从微针中释放的外泌体在形态、粒径、标志蛋白及生物学功能方面均与新鲜外泌体相当，能够被树突状细胞摄取并促进其成熟。

引言

外泌体是由细胞释放到细胞外基质中的小囊泡，被认为在多种疾病和癌症的治疗中具有作为生物治疗剂和药物递送载体的潜力1在生物合成过程中，外泌体包裹了细胞内的多种生物活性分子，包括功能蛋白和核酸2因此，在运输过程中被受体细胞摄取后，外泌体能够调控靶细胞中的基因表达和细胞功能3作为一种天然的信息传递介质，外泌体已在组织再生、免疫调节以及作为递送载体方面得到充分应用4通过工程技术，可将特定配体富集于外泌体表面，从而诱导或抑制受体细胞中的信号事件，或靶向特定细胞类型5化疗药物也可被载入外泌体用于癌症治疗6此外，外泌体能够穿过血脑屏障以递送治疗性载荷，因此在脑部疾病治疗中具有广阔的应用前景7与脂质体相比，外泌体表现出更强的细胞摄取能力和更优的生物相容性8它们能够高效进入其他细胞，同时表现出更好的耐受性和更低的毒性9然而，外泌体的传统团注给药方式容易在血液中被肝脏、肾脏和脾脏截留并迅速清除10此外，外泌体的稳定性较差 体外 且易受储存条件影响，限制了其临床应用11.

微针是由微米级针尖组成的阵列，能够穿透生理屏障，用于递送小分子药物12、蛋白质13、核酸14和纳米药物15。微针经过精确设计，可靶向皮肤表面的病灶，其分散的针尖可确保在靶部位实现药物的均匀分布，从而增强治疗效果16。微针的结构设计和材料组成有利于 蛋白质和核酸等生物活性物质的干燥储存，提高其稳定性17。传统的注射方法作用时间相对较短，且可能引起疼痛，导致患者恐惧18。微针的微米级长度可最大限度减少组织损伤并避免刺激神经，从而消除疼痛，提高患者的依从性19。此外，微针使用简便，患者无需专业人员协助即可自行给药16。除皮肤外，微针还可应用于眼部20、口腔黏膜21、心脏22和血管23等组织。利用微针进行外泌体的临床递送，提供了一种具有前景的策略。

因此，我们介绍了一种载有外泌体的微针（exo@MN）贴片，并公开其制备方法。微针贴片采用两步浇铸法结合离心和真空干燥技术制备，该方法可促进外泌体在微针针尖部位的聚集，从而提高递送效率。微针的针尖和背衬均采用具有良好生物相容性和水溶性的材料构建。针尖部分添加了海藻糖和透明质酸（HA）以保护外泌体，背衬材料则选用溶于无水乙醇的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。采用显微镜和扫描电子显微镜 (SEM)对微针贴片的形貌进行表征。通过拉伸仪对微针进行力学性能测试，验证其穿透皮肤的能力，并在猪皮肤上测得释放时间为60秒。此外，采用透射电子显微镜 (TEM)、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹（WB）对外泌体在新鲜状态以及装载于exo@MN中时的形貌、粒径和蛋白含量进行表征。利用共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM)检测树突状细胞（DCs）对外泌体的内化作用，并通过流式细胞术评估DCs的成熟情况。两种来源外泌体的形态学特征和生物学功能基本一致。

方案

本研究无需伦理审批，因为第3节所述实验所用猪皮系从市场购买的可食用猪耳，而非来源于实验动物。

1. 外泌体的分离

  1. 细胞培养
    1. 在直径为15 cm的培养皿中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液（100×）（见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养小鼠卵巢上皮癌细胞ID8。
    2. 将ID8细胞置于CO2培养箱（见材料表）中，于37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞密度达到90%。
  2. 外泌体的分离
    1. 移除培养皿中的培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次。加入不含胎牛血清（见材料表）和青霉素-链霉素溶液（见材料表）的DMEM培养基20 mL。继续在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。
    2. 收集20个直径15 cm培养皿的细胞培养上清液。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，收集上清液以去除游离细胞。
    3. 在4 °C条件下以2000 × g离心10分钟，收集上清液以去除细胞碎片。
    4. 将0.22 µm一次性真空过滤系统（见材料表）连接至循环水式真空泵（见材料表）。启动真空，使上清液通过0.22 µm聚醚砜膜进入过滤系统的下腔，从而有效去除上清液中大于0.22 µm的囊泡或杂质。
      1. 连接真空泵时，先打开泵的开关，再将其连接至真空过滤系统的进气口。关闭时，应先断开与泵的连接，再关闭真空泵。此操作可防止真空泵回流，避免培养液污染。
    5. 取15 mL上清液加入100 kDa超滤管的内管中（见材料表）。在4 °C条件下以3500 × g离心10分钟，弃去外管中的液体。
      注：大于100 kDa的颗粒保留在内管膜上，而小于100 kDa的蛋白质则随溶液被离心至外管。外泌体粒径大于100 kDa，因此聚集在内管膜上。
    6. 重复上述步骤，直至液体总体积浓缩至5 mL以内。收集内管中的液体，加入1 mL DPBS。使用移液器在内管中反复吹打至少200次，确保附着的外泌体充分重悬于DPBS中，然后收集。
    7. 在4 °C条件下以10000 × g离心60分钟，将上清液转移至6 mL快封离心管（见材料表）中，并用热封仪密封管口。
    8. 使用超速离心机（见材料表）在4 °C条件下以100,000 × g离心2小时。剪开快封离心管，弃去上清液，将沉淀物重悬于100 µL DPBS中，即得外泌体溶液。
      注：重悬沉淀物时，需使用移液器反复吹打并震荡管壁至少200次。

2. 外泌体微针（exo@MN）的制备

  1. 主模具的制备
    1. 使用CAD软件构建一个10 × 10阵列的微针模型，针尖为圆锥形，参数如下：高度1200 µm，底面直径400 µm，间距（相邻微针之间的距离）900 µm。
    2. 以HTL树脂为材料，使用3D打印机打印微针的主模具（参见材料表）。
    3. 将主模具浸入无水乙醇中1小时，以去除表面附着的树脂。
    4. 将模具暴露于紫外光下5分钟进行固化。
    5. 再次将模具浸入无水乙醇中1小时，随后在60 °C的干燥烘箱中干燥1小时。主模具制备完成。
  2. 生产模具的制备
    1. 按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS，参见材料表）的A组分和B组分。充分搅拌后，将混合物倒入主模具中。
    2. 将PDMS模具置于1 psi压力下15分钟，以去除PDMS混合物中的气泡。
    3. 在60 °C下固化PDMS模具2小时，然后脱模，获得微针的生产模具。
    4. 使用前用超纯水清洗生产模具。
  3. 溶液的制备
    1. 使用BCA蛋白定量试剂盒（参见材料表）测定外泌体溶液的蛋白含量。加入适量DPBS，使外泌体溶液浓度达到10 µg/µL。
    2. 使用DPBS作为溶剂，配制200 mg/mL的海藻糖溶液（参见材料表）。搅拌20分钟，确保完全溶解。
    3. 使用DPBS作为溶剂，配制200 mg/mL的透明质酸（HA，参见材料表）溶液。搅拌过夜，确保完全溶解。
    4. 使用无水乙醇作为溶剂，配制150 mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮（PVP，参见材料表）溶液。搅拌过夜，确保完全溶解。
    5. 将外泌体溶液（10 µg/µL）与海藻糖溶液（200 mg/mL）按1:1体积比混合，然后加入等体积的HA溶液（200 mg/mL），充分混合，得到针尖溶液。
  4. 外泌体微针（exo@MN）的制备
    1. 使用等离子清洗机（参见材料表）对PDMS模具表面进行低档处理30秒，以增强其亲水性。
    2. 向PDMS模具中加入40 µL针尖溶液。在室温（RT）下以3000 × g离心3分钟，确保液体完全填充模具的针体层。
    3. 去除模具中多余的液体，并在室温下于真空干燥烘箱中（参见材料表）干燥1天。
    4. 向PDMS模具中加入200 µL PVP溶液。在室温下以3000 × g离心3分钟，确保液体完全填充模具的背衬层。
    5. 在室温下于干燥烘箱中干燥1天，然后脱模，获得exo@MN贴片。
      ​注：exo@MN贴片在使用前应保存在干燥烘箱中。

外泌体制备流程示意图；包括离心、真空干燥及添加聚合物以实现稳定化。
图1：exo@MN贴片的制备流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 外泌体@MN贴片的表征

  1. 形态学观察
    1. 将贴片的背衬粘贴至一个呈45°倾斜的表面，并将其置于体视显微镜下进行观察（参见材料表）。
    2. 打开照明光源，使用4倍物镜拍摄贴片的形态图像。
  2. 扫描电子显微镜（SEM）检测
    1. 使用导电胶将贴片固定在样品台上，并用自动精细镀膜仪（参见材料表）处理30秒。
    2. 采用加速电压为1 kV的扫描电子显微镜（参见材料表）拍摄exo@MN贴片的图像。
  3. 机械性能测试
    1. 从贴片上裁剪出一个3 × 3阵列，将针尖朝上放置在拉力仪的刚性平台上（参见材料表）。调节探针高度，使其接近针尖但不接触。
    2. 设置参数，当压力达到20 N时自动停止。以0.5 mm/min的速度垂直压缩针尖，并记录载荷-位移曲线。
  4. 溶解性测试
    1. 从市场购买新鲜猪耳，切成5 cm × 5 cm × 0.3 cm的片状。将猪皮平铺于桌面，并用纸巾吸干表面水分。
    2. 准备四个干燥的微针贴片，使针尖朝下贴附于猪皮表面，各贴片之间保持适当间距。用拇指和食指垂直按压每个微针贴片。每隔15秒取下其中一个贴片。
    3. 立即将取下的贴片放入干燥烘箱中，干燥5分钟。剪下一列微针针尖，水平放置于显微镜下（参见材料表），使用4倍物镜观察针尖的溶解情况。

4. exo@MN 贴片中外泌体的表征

注意：将 exo@MN 的微针尖端溶解于 100 µL DPBS 溶液中，以对释放的外泌体进行以下表征。

  1. 透射电子显微镜（TEM）
    1. 处理铜网（参见 材料表）并使用离子清洗仪进行亲水处理（参见 材料表5 分钟
    2. 将10 µL样品滴加到铜网的碳膜面上，静置1分钟，然后从边缘用滤纸吸去液体。
    3. 加入10 µL 3%醋酸铀（见 材料表向样品中加入）溶液，静置10秒，然后从边缘用滤纸吸去液体。
    4. 加入10 µL 3%醋酸铀酰溶液至样品中，静置1分钟，然后从边缘用滤纸吸去液体，室温下自然晾干。
    5. 使用透射电子显微镜（TEM）拍摄外泌体的图像（参见 材料表加速电压为80 kV。
  2. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    1. 用DPBS稀释外泌体溶液，使颗粒浓度达到1 × 107 颗粒/mL。使用1 mL注射器缓慢将1 mL外泌体溶液注入NTA样品室（参见 材料表).
    2. 将仪器的标准操作程序（SOP）类型设置为 EV-488，以检测外泌体的粒径分布。
  3. 蛋白质印迹法（WB）
    1. 通过混合放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液与苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）制备裂解缓冲液： 材料表以100:1的比例裂解外泌体，冰上孵育20分钟，每10分钟涡旋一次。
    2. 将溶液在 12,000 x g 4 °C下离心10分钟，收集上清液以测定蛋白浓度。
    3. 加入5倍SDS-PAGE上样缓冲液（参见 材料表将上清液按1:4的体积比加入，并充分混匀。在100 °C加热10分钟以使蛋白质变性。
    4. 加入5 µL的180 kDa预染蛋白质标记物（参见 材料表）以及10 µg变性样品加入4%-20%预制胶（见 材料表）。运行电泳系统（参见 材料表60 V 电泳 10 分钟，然后 140 V 电泳 50 分钟。
    5. 将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜（参见 材料表用甲醇预活化后，在冰上以290 mA电流进行电泳，持续90分钟。
    6. 将PVDF膜置于5%脱脂牛奶溶液中孵育1小时。用含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST，见 材料表每次5分钟。
    7. 根据蛋白质的位置切下目标条带。将条带与抗小鼠CD63抗体和抗小鼠Alix抗体孵育（参见 材料表根据制造商说明书稀释至适当浓度，并在4 °C下孵育过夜。
    8. 用 TBST 洗涤条带三次。加入 HRP 标记的抗兔 IgG 孵育（参见 材料表室温孵育1小时。然后用TBST再洗涤三次。
    9. 使用超敏ECL检测试剂（参见 材料表）以覆盖条带表面，并立即使用凝胶成像系统曝光并捕获条带图像（参见 材料表).
  4. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
    1. 培养 5 x 105 使用2 mL的罗斯韦尔帕克纪念研究所1640（RPMI 1640）培养基，在共聚焦培养皿中培养树突状细胞（DCs）（参见 材料表加入外泌体或 exo@MN，在 37 °C 下孵育 24 小时。
    2. 向每个共聚焦培养皿中加入一滴 Hoechst 33342，在 37 °C 避光孵育 20 分钟。
    3. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像（参见 材料表) 使用60倍物镜。滴加一滴浸油（参见 材料表将物镜上的镜头置于共聚焦培养皿上，并将培养皿放置于载物台上。调节x/y/z轴以定位细胞的合适焦平面。
    4. 使用DAPI/TRITC/TD通道开始成像，选择1024像素的分辨率，并将快速模式设置为1/8秒。
  5. 流式细胞术
    1. 在6孔板中培养DCs，每孔含有5 x 105 细胞和2 mL的1640培养基。分别加入等体积的DPBS溶液、外泌体、不含外泌体的微针以及exo@MN，于37 °C孵育24 h。
    2. 将每个孔中的培养基转移至离心管中。在300 x g 4 °C下离心3分钟，弃上清液。
    3. 加入0.5 µL FITC-CD11c抗体、2.5 µL APC-CD80抗体和0.5 µL Pacific Blue I-A/I-E抗体（参见 材料表) 加入 100 µL 的 5% BSA 溶液（参见 材料表充分混匀，重悬细胞，在冰上避光振荡孵育20分钟。
    4. 加入 1 mL DPBS，以 300 x g 4 °C 下离心 3 分钟，弃上清液。重复洗涤两次以去除未结合的抗体，随后通过流式细胞术分析相应的荧光通道（参见 材料表).
      1. 首先，在FSC-A/SSC-A散点图中，圈选主要细胞群为P1。在P1细胞群的SSC-A/SSC-H散点图中，沿对角线圈选方形区域P2，以去除聚集细胞。
      2. 使用 FITC、APC 和 Pacific Blue 通道对 P2 细胞群进行荧光分析。将停止条件设置为在 P2 门内收集 10,000 个细胞。

5. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准差（SD）表示定量数据。使用适当的数据分析软件，通过 t 检验分析评估统计学显著性。认为 p 值小于 0.05 具有统计学意义。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

结果

本文介绍了一种外泌体分离、exo@MN 贴片制备及其表征的实验方案。图1展示了exo@MN贴片的制备流程图。将外泌体与海藻糖和透明质酸（HA）混合后，加入微针模具并进行离心。该过程促使外泌体在针尖处聚集，从而实现快速释放。干燥后，加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液并再次离心，以完全填充模具。完全干燥后，脱模获得exo@MN贴片。采用显微镜和扫描电镜（SEM）对微针的形貌进行表征，结果如图2所示。exo@MN贴片的针尖呈圆锥形，排列为10 × 10阵列，针尖锐利且结构完整。微针针尖可承受2 N的力，足以穿透皮肤屏障。此外，采用猪皮作为人皮肤的替代模型，模拟exo@MN贴片的应用。将贴片按压至猪皮表面以观察释放时间，结果显示微针针尖在60秒内完全溶解。将exo@MN贴片溶解于DPBS中进行表征，结果如图3所示。透射电镜（TEM）图像显示囊泡具有典型的杯状结构，符合外泌体的形态特征。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定exo@MN溶液的粒径分布，结果显示颗粒主要集中在50–250 nm范围内。然而，也存在部分较大颗粒，这可归因于HA材料的黏附特性导致的外泌体聚集。对exo@MN溶液中CD63/Alix蛋白进行的WB分析表明，exo@MN能够部分保留外泌体中的蛋白质。exo@MN释放的外泌体的生物学功能在图4中得到验证，重点评估了细胞对外泌体的摄取能力以及树突状细胞（DCs）的活化情况，并与新鲜外泌体进行了比较。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像证实，DCs对外泌体的摄取效率较高，无论是新鲜外泌体还是exo@MN中的外泌体均能被有效摄取。流式细胞术的代表性图像及比例统计结果显示，exo@MN中的外泌体具有促进DCs活化的生物学功能，其效果与新鲜外泌体相似。

微针制备示意图、扫描电镜图像、压力-位移曲线、穿刺测试序列。
图 2：外泌体负载微针贴片（exo@MN patches）的表征。 （A）外泌体负载微针贴片的体视显微镜图像。比例尺 = 400 µm。（B）外泌体负载微针贴片的扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺 = 200 µm。（C）外泌体负载微针贴片的载荷-位移曲线。（D）外泌体负载微针贴片插入猪皮后在不同时间点的显微图像。比例尺 = 400 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

外泌体的电子显微镜图像；粒径分布图；外泌体蛋白标志物的Western blot结果。
图3：新鲜外泌体及exo@MN中外泌体的表征。（A）透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态。比例尺 = 100 nm。（B）纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测外泌体的粒径分布。（C）Western blot（WB）检测外泌体标志物CD63和Alix。请点击此处查看该图的放大版本。

外泌体显微镜与流式细胞术结果；细胞染色、流式分析、CD80 MHCII表达。
图4：新鲜外泌体及exo@MN中外泌体的生物学检测。 （A）树突状细胞（DCs）摄取外泌体的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。比例尺 = 10 µm。（B）流式细胞术检测DCs活化的代表性图谱。（C）CD11c+CD80+MHCII+ DCs百分比的定量分析。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前，分离外泌体的主要方法包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫亲和磁珠法以及微流控技术24。由于微针针尖空间较小，导致其载药能力有限，因此有必要提高外泌体的浓度以实现更高载量。为此，我们选择先采用超滤法浓缩细胞培养上清液，再通过超速离心法分离外泌体。通过少量液体重悬的方式提高了外泌体的浓度，使微针能够负载数十至数百微克的外泌体。然而，该方法所获得的外泌体溶液中仍含有大量蛋白质杂质，且在离心过程中会造成显著的外泌体损失。目前，外泌体在治疗应用中的局限性之一，正是缺乏能够高效、高纯度、大规模分离外泌体的有效方法。随着外泌体临床潜力的不断探索，未来亟需开发更先进的技术以应对提取过程中的各项挑战。

本研究的关键技术在于基于外泌体的微针设计。为了最大限度减少外泌体的浪费并实现更强的治疗效果，采用了一种两步浇铸法来制备exo@MN贴片。已有文献报道，海藻糖是适合用于外泌体冻干保存的材料25，而透明质酸（HA）具有优异的生物相容性、亲水性，并在抑制炎症和促进皮肤修复方面发挥功能26。使用这两种材料制备载有外泌体的针尖，有助于维持外泌体的生物活性，使其在皮肤内快速溶解并释放。此外，该方法还可降低感染风险，促进皮肤快速恢复。通过离心和真空干燥处理，使外泌体在微针针尖部位实现富集。考虑到乙醇与海藻糖之间的不相容性，选择将聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解于无水乙醇中作为背衬材料。这种分层制备方法显著提高了外泌体的递送效率。

外泌体稳定性差 体外在4 °C、37 °C或-80 °C保存时，均可能导致外泌体结构改变或降解11为了解决这一问题，多项研究探索了外泌体的储存方法，例如冻干法。微针技术则提供了另一种新颖的策略。通过在室温下干燥，微针技术可提高外泌体的稳定性，并可直接用于外泌体递送，无需其他处理步骤。此外，外泌体的提取过程复杂且易发生降解，导致其大规模应用面临挑战。采用微针技术储存已提取的外泌体虽不能简化提取步骤，但可减少所需提取次数。一次提取即可制备大量外泌体负载的微针贴片（exo@MN），并实现长期储存。每次治疗使用同一批次制备的外泌体微针，可最大限度降低不同批次间差异对治疗效果的潜在影响，从而提升外泌体纳米平台的可重复性与可靠性27这为外泌体的临床应用提供了更多可能性。

在未来的研究中，值得探索能够精确控制载药量并最大限度减少针尖间药物差异的方法。这可以通过工艺优化、实施质量控制措施以及采用先进技术来实现。解决这些问题将对开发可靠且一致的药物递送系统起到重要推动作用。

披露

H. C.、F.L.Q 和 S.J.M 是一项专利申请的发明人，该专利申请基于本文手稿中的数据。H.C. 是 Medcraft Biotech. Inc. 的科学创始人。

致谢

F.L.Q. 感谢先锋计划（Pioneer R）的支持&D 计划（2022C03031）、国家重点研发计划（2021YFA0910103）、国家自然科学基金（22274141，22074080）、山东省自然科学基金（ZR2022ZD28）和山东省泰山学者计划（tsqn201909106）。H.C. 感谢国家自然科学基金（82202329）提供的经费支持。作者感谢中国科学院杭州医学研究所（HIM）共享仪器平台所提供的仪器支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100倍青霉素-链霉素溶液杰润生物科学MA0110细胞培养
180 kDa 预染蛋白标记物赛默飞世尔科技26616蛋白质印迹法
3% 醋酸铀酰河南瑞鑫实验用品GZ02625外泌体的形态学表征
3D 打印机BMF 技术nanoArch S130模具制备
4%–20% 预制胶GenscriptExpressPlus PAGE 凝胶蛋白质印迹法
5× SDS-PAGE 上样缓冲液泰坦04048254蛋白质印迹法
抗小鼠Alix抗体Biolegend12422-1-AP蛋白质印迹法
抗小鼠CD63抗体Biolegendab217345蛋白质印迹法
APC 抗小鼠 CD80 抗体Biolegend104713抗体
自动匀胶机自主JBA5-100微针的形态学表征
BCA 法检测试剂盒BeyotimeP0012蛋白质浓度测定
离心赛默飞世尔科技Muitifuge X1R pro细胞离心机
循环水真空泵Yuhua InstrumentSHZ-D(III)过滤
CO2培养箱EppendorfCellXpert C170细胞培养
共聚焦激光扫描显微镜尼康A1HD25荧光成像
铜网北京中精科仪科技 JF-ZJKY/300外泌体的形态学表征
D-(+)-海藻糖二水合物Aladdin5138-23-4微针的制备 
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’s 培养基MeilunbioMA0212细胞培养
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液美仑生物MA0010细胞培养
电泳系统Bio-radPowerPac-basic蛋白质印迹法
胎牛血清杰润生物科学JR100细胞培养
FITC 标记的抗小鼠 CD11c 抗体Biolegend117305抗体
流式细胞术BDLSR Fortessa荧光检测
凝胶成像仪CytivaAmersham ImageQuant 800蛋白质印迹法
HRP标记的山羊抗兔IgGCST7074S蛋白质印迹法
HTL 树脂BMF 技术模具制备
透明质酸（分子量 = 300 kDa）Bloomage Biotechnology9004-61-9微针的制备 
浸油尼康MXA22168荧光成像
离子清洗器JEOLEC-52000IC外泌体的形态学表征
显微镜OlympusCKX53观察微针尖端的溶解过程
小鼠卵巢上皮癌细胞 ID8MeisenCTCC CC90105细胞培养
纳米颗粒跟踪分析Particle MetrixZetaView外泌体大小分析
太平洋蓝标记的抗小鼠 I-A/I-E 抗体Biolegend107619抗体
苯甲基磺酰氟BeyotimeST507蛋白酶抑制剂
等离子清洗机合肥科晶材料技术PDC-36G微针的制备 
聚二甲基硅氧烷道康宁9016-00-6模具制备
聚乙烯吡咯烷酮（分子量 = 40 kDa）Aladdin9003-39-8微针的制备 
Prism GraphPad版本 9统计分析
PVDF膜MilliporeIPVH00010蛋白质印迹法
快速离心机贝克曼344619外泌体提取
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