在全脑成像过程中分析母体行为反应

摘要

这里介绍的是一个视频分析管道，它克服了 MRI 环境中行为监测的挑战，允许检测对外部线索的未经指导的行为反应。这种分析将有助于更全面地了解诱发的内部状态变化和全脑活动。

摘要

全脑成像工具的最新进展使神经科学家能够研究协调的大脑活动如何处理外部线索，影响内部状态变化并引发行为反应。例如，功能性磁共振成像 （fMRI） 是一种无创技术，允许使用血氧水平依赖性 （BOLD） 反应测量清醒、行为小鼠的全脑活动。然而，为了充分理解外部刺激引起的 BOLD 反应，实验人员还必须评估扫描过程中的行为反应。MRI 环境对这一目标提出了挑战，使常用的行为监测方法不兼容。这些挑战包括 （1） 视野受限和 （2） 没有铁磁元件的设备可用性有限。这里介绍的是一个行为视频分析管道，它通过从这些环境限制下获取的视频中提取有价值的信息来克服这些限制，从而能够在采集全脑神经数据期间评估行为。采用光流估计和降维等方法，可以检测到对 fMRI 扫描期间呈现的刺激的行为反应的强烈差异。例如，代表性结果表明，小鼠幼崽的发声，而不是纯音调，在母鼠和处女雌性小鼠中引起明显不同的行为反应。展望未来，这个最初为克服 fMRI 实验中的挑战而量身定制的行为分析管道可以扩展到各种神经记录方法，在受限环境中提供多功能的行为监测。行为和神经反应的协调评估将提供更全面的理解，了解对刺激的感知如何导致复杂行为输出的协调。

引言

在神经记录期间监测行为反应对于理解刺激诱发的大脑协调活动至关重要。如果预测动物不会以特定和目标导向的方式对刺激做出反应，观察未经指导的行为可以深入了解外部线索如何影响其内部状态 ^1,2。神经影像学工具的最新进展，如宽视野钙成像和功能磁共振成像 （fMRI），使神经科学家能够将研究范围扩展到单个大脑区域之外。然而，为了更全面地理解这些高维神经数据，评估这些复杂模式的行为输出的能力也必须相应地提高。

表征任务指导行为的最先进方法广泛用于神经科学研究，包括用于检测嗅觉的温度和压力传感器 ^3,4、用于检测舔触的光束⁵ 和用于跟踪预定身体部位的无标记姿势估计⁶。然而，对无指导行为模式的数据驱动评估仍然是该领域的一个挑战⁷。虽然数据驱动的行为分析方法正在迅速发展，但现有方法通常需要强大的计算能力、专门的设备或对动物的特别清晰的观察 2,6,8,9。这里介绍的是一个行为视频分析管道，它很容易适应任何摄像数据，并允许从被动刺激期间获得的视频中提取有价值的行为测量。

该行为分析管道旨在与头部固定动物的神经和视频数据的协调采集兼容，这些动物暴露于广泛的外部刺激和多种录制环境，即使是那些具有相当限制的环境。例如，MRI 环境对行为监测提出了特定的挑战，包括视野受限和没有铁磁元件的设备可用性有限。这些限制使常用的方法不兼容，使头部运动（即大脑如何在体积采集之间移动）等测量成为扫描期间评估身体反应的最容易但最有限的方法之一¹⁰。通过克服这些限制，该协议促进了对 MR 兼容摄像数据的分析，表明具有不同母体经历的雌性小鼠对听觉刺激表现出不同的行为反应。在 fMRI 扫描期间，母亲和处女会受到听觉刺激，包括痛苦的幼崽发声（“幼崽叫声”）和纯净的音调。这些刺激是被动呈现的，因此没有任何指导性的行为输出。虽然预计与处女相比，母亲对幼崽的叫声表现出更高的反应，但关于雌性小鼠在头部固定环境中如何对婴儿线索做出反应的文献很少。因此，没有特定的行为输出可以先 验地跟踪，这使得该实验成为拟议的数据驱动行为分析的完美测试。采用光流估计和降维等方法，检测到行为反应的组别差异，包括幅度和空间表现。

展望未来，可以利用行为和神经反应的协调评估来更全面地了解外部刺激如何改变内部状态并为复杂的行为输出提供信息。这种理解应该扩展到在没有强加任务和指导行为的情况下呈现的刺激。这里介绍的分析管道可以扩展到各种神经记录技术，即使在受限的环境中也能提供多功能的行为监控。

方案

所有动物实验均根据哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的方案进行，所有方法均按照相关指南、法规和建议进行。材料 表中列出了所用设备和软件的详细信息。

1. 软件

1. 从 Mathworks 网站下载 MATLAB 。
   注意：组成此分析管道的代码只能通过 MATLAB 执行，并且是专门为与 MATLAB 2023a 兼容而编写的。
2. 此管道需要 MATLAB 中的 Computer Vision Toolbox 和 Image Processing Toolbox。通过点击 管理插件、获取插件，将工具箱添加到 MATLAB 插件中，然后搜索并添加它们。
   注意：提供了五个 MATLAB 脚本作为补充文件，标题如下：script1_videocoreg.m（补充编码文件 1）、script2_optflow_roiselect.m（补充编码文件 2）、script3_optflow_analysis.m（补充编码文件 3）、script4_optflow_pca.m（补充编码文件 4）和 script5_optflow_pca_analysis.m（补充编码文件 5）。此外，还提供了两个示例视频 （视频 1 和 视频 2） 及其相应的事件时序文件 （补充文件 1 和 补充文件 2）。建议首先使用示例数据运行管道。
   注意：请注意代码中包含感叹号的任何注释，因为这些区域在执行之前需要执行作。例如，有诸如 “edit the code block below！” 之类的注释，以突出显示必须进行编辑以适应文件结构、实验细节或分析需求的位置。默认情况下，这些选项设置为适合提供的两个示例视频，但在开始使用自己的数据运行管道后，需要进行调整。
3. 要运行每个脚本的每个部分，请单击 Editor 菜单上的 Run 和 Advance。

2. 视频合配

注意：此分析管道中第一个提供的脚本是 script1_videocoreg.m（补充编码文件 1），它 通过 共同配准将所有视频在空间上彼此对齐。此脚本的输入是原始视频，主要输出是转换后的视频。

1. 编辑脚本的 第 1、2、3、4、5 和 6 部分 ，以适应数据结构。
2. 运行 Section 1。
3. 在每个视频中选择三个点进行标记，如图 1A 所示。这三个点将用于将所有帧相互共注册。运行脚本的第 2 部分 以提取每个视频的第一帧，并使用鼠标单击 前两个点一次，然后双击 第三个点。选择最后一个视频的点数后，按 Enter。
4. 运行 Section 3 和 Section 4。
5. 将 标志 aligned 设置为 0 并运行 Section 5。然后，将 标志对齐 设置为 1 并再次运行 第 5 节 。
6. 运行 第 6 节 并将生成的并排图与 图 1B 进行比较。在左侧的非对齐平均图像中观察到的任何像差都应该在右侧的对齐平均图像中减少。

3. 光流估计：全 FOV

注意：为了评估通过扫描视频的移动，需要估计每个转换视频的光流。这可以使用提供的脚本 script2_optflow_roiselect.m（补充编码文件 2）对每个视频的完整视野 （FOV） 完成。此脚本的输入是转换后的视频，输出是 3D 矩阵，指示每个视频的每个像素在时间上的光流大小。 图 2A 显示了一个示例帧，其中光流矢量覆盖为蓝色，其中每个矢量的长度表示该像素的相对光流幅度。发现将输出保存为视频比将它们保存为 3D 矩阵更有效。

1. 在指示的位置编辑脚本的 第 1 部分 ，以适应数据结构。
2. 运行 Section 1。

4. ROI 选择

注意：通过在完整 FOV 中选择一个感兴趣区域 （ROI） 进行分析，以下分析步骤在计算负载和数据存储需求方面变得更加易于管理。可以根据感兴趣的实验和行为或通过更数据驱动的方法来选择 ROI。对于此处提供的代表性结果，使用脚本 script2_optflow_roiselect.m 第 2 节（补充编码文件 2）计算完整 FOV 中每个像素的光流幅度的标准差。这部分脚本的输入是第 1 节的输出，主要输出是所有视频中所有像素的光流幅度标准差的可视化。在呈现的代表性结果中，镜面 FOV 显示光流的标准偏差相对较高，这指导了 ROI 的演示选择。

1. 在指示的位置编辑脚本的第 2 部分 ，以适应数据结构。
2. 运行 第 2 部分 并使用生成的图像查看分析视频中光流波动最剧烈的位置。此图像的示例如图 2B 所示。

5. 光流量化：ROI

注意：脚本 script2_optflow_roiselect.m（补充编码文件 2）的第 3 节允许用户使用绘图工具选择 ROI 并保存边界坐标。脚本这部分的输入是第 1 节的输出，输出是 1D 向量，表示每个视频的 ROI 随时间变化的平均光流幅度。

1. 在指示的地方编辑脚本的 第 3 部分 ，以适应数据结构和分析需求。
   注意：关于如何继续进行 ROI 选择，有几个选项。选择一个选项：
   1. 选项 1：分析完整的视频 FOV。
      1. 将标志 selectROI 设置为 0，并将 provideROI 设置为 0。
   2. 选项 2：分析新的 ROI。
      1. 将标志 selectROI 设置为 1，并将 provideROI 设置为 0。然后编辑 newCoordsName。
   3. 选项 3：分析之前绘制的 ROI。
      注意：仅当之前运行过此代码并创建了 ROI 时，才选择此选项。
      1. 将标志 selectROI 设置为 0，并将 provideROI 设置为 1。然后，编辑 inputCoords 以提供一组预先确定的坐标。
2. 运行 第 3 部分。

6. 光流幅度比较

注意：提供的脚本 script3_optflow_analysis.m（补充编码文件 3）需要最专业化以适应用户的数据。主要输入是 1D 向量，表示每个视频的 ROI 随时间变化的平均光流幅度，当与事件开始和组/条件信息适当结合时，主要输出是可以根据分析兴趣定制的统计比较。

1. 编辑脚本的 第 1-3 部分 ，以满足数据结构和分析需求。
2. 在第 1 节中，根据需要将分析选项标志 zsc、blrm、blzsc、demeanPerTrial 和 applyLPfilter 设置为 0 或 1。在呈现的代表性结果中，zsc、blrm 和 applyLPfilter 设置为 1，所有其他选项都设置为 0。
3. 将 LPfilter 设置为一个数字，表示所需的低通滤波器，以赫兹 （Hz） 为单位。在呈现的代表性结果中，应用了 5 Hz 低通滤波器，因为预计行为响应不会以快于 5 Hz 的速率波动。
4. 运行 第 1-3 部分。第 3 部分应生成组平均光流时间序列、组平均累积光流和汇总累积光流的图，包括 图 3 中所示的图。Section 3 可以针对组/条件比较的任意组合运行。

7. 光流 PCA

注意：基于光流大小的估计，script2_optflow_roiselect.m（补充编码文件 2）的输出还包含有关每个视频逐帧光流空间分布的信息。为了降低此空间信息的维数，提供的脚本 script4_optflow_pca.m （Supplementary Coding File 4）  对估计的光流执行主成分分析 （PCA）。主要输入是 3D 光流矩阵，以前保存为每个行为视频的视频，主要输出是每个视频一个 .mat 文件，其中包含 PC 和解释的方差信息。

1. 编辑脚本的第 1 部分 以满足数据结构和分析需求。
2. 在第 1 节中根据需要设置分析选项标志 stimnum、dsfactor 和 fnfactor。在呈现的代表性结果中，分别分析了每种刺激类型，并且 dsfactor 和 fnfactor 保持默认值 1，因此没有空间或时间的下采样。
3. 运行 Section 1。

8. 光流 PCA 比较

注意：提供的脚本 script5_optflow_pca_analysis.m（补充编码文件 5）将对各组的 PCA 结果进行探索性比较。主要输入是从 script4_optflow_pca.m（补充编码文件 4）获得的刺激特定 PC 和解释方差信息，主要输出是统计阈值热图，描绘了第一台 PC 的负载，尽管也可以使用此脚本分析其他 PC。

1. 编辑脚本的第 1 部分 以适应数据结构和分析。
2. 运行 Section 1 和 Section 2。
3. 编辑 第 3 部分 输入，特别是 group 和 myTitle 变量，以反映所需的组分析以及 阈值。 threshT 表示 T 统计量阈值，超过该阈值的结果将被视为显著，可以根据公开可用的 T 统计量与 p 值表和自由度进行计算。
4. 为每组感兴趣的 Run Section 3 （第 3 部分 ）。该代码应生成一个组摘要统计图，如图 4 的左侧和中间面板所示。根据需要调整 caxis 的范围，从而调整颜色条限制，以实现可视化。
5. 编辑 第 4 部分 输入，特别是 mag 和 myTitle 变量，以反映所需的组比较，以及 threshT。 threshT 表示 T 统计量阈值，超过该阈值的结果将被视为显著，可以根据公开可用的 T 统计量与 p 值表和自由度进行计算。
6. 为感兴趣的每组比较运行 第 4 节 。该代码应生成一个组比较统计图，如图 4 的右侧面板所示。根据需要调整 caxis 的范围，从而调整颜色条限制，以实现可视化。

结果

为了证明该分析管道的潜力，在功能性磁共振成像 （fMRI） 扫描期间，当小鼠受到听觉刺激时，获取了头部固定雌性小鼠（特别是母亲和处女）的行为视频。刺激包括幼崽的叫声和被动呈现的纯音，因此没有任何指导性的行为输出。幼崽的叫声是暂时与巢穴隔离的 6 天大的老鼠幼崽发出的超声波发声的录音。这些幼崽的叫声通常会引发母性取回幼崽的行为，其中母亲定位、移动、调查，然后捡起幼崽并将其送回安全的巢穴——处女雌性通常不会表现出这种行为¹¹。以前的研究表明，幼崽的叫声在母亲而不是处女的初级听觉皮层中引起强烈的诱发活动，而纯音反应显示没有群体差异¹²。因此，假设将识别对幼犬呼叫的行为反应的群体差异，而不是纯音。然而，关于雌性小鼠在头部固定环境中响应幼崽线索的特定行为的文献很少。因此，预计没有特定的行为输出，使该实验成为拟议的数据驱动行为分析的完美测试。

在 8 天的过程中，所有动物逐渐习惯了实验者的处理、头部固定和 MRI 环境。对头部固定和实验环境的习惯对于评估对所呈现刺激的行为反应至关重要。如果没有正确地适应环境，动物可能只会表现出压力反应，洗掉任何 可以通过摄像 解析的刺激驱动效应。

虽然每个数据采集会话的行为装置设置通常是相同的，但每次将动物头部固定以进行 fMRI 扫描时，相机视野 （FOV） 可能会略有偏移（参见 图 1A 中的示例 FOV）。这可能是由于相机支架位置的细微变化，以及每只动物的头柱头骨附件的个体差异。因此，扫描视频需要通过线性配准相互对齐，以便比较它们包含在扫描和动物之间的空间信息。根据代表性数据定制了共同配准。例如，在标准扫描日，每只动物采集 3-4 次扫描，因此每只动物每天 3-4 个视频。在每次扫描之间，支架组件没有移动，包括摄像头和头部固定组件。因此，一旦确定了每天每只动物一个视频的共配准转换，就可以将其应用于该动物在同一天的其他 2-3 个视频。虽然这节省了此管道的共注册步骤的时间，但如有必要，还可以为每个视频单独计算空间变换。选择每个视频中存在的三个特征作为标记和计算空间变换的点。在所示的代表性数据中，这三个点是头柱的中心、动物右眼的正面视图和动物右眼的侧面视图（在以 45 度角放置的镜子中可见）。视频共配准的示例如图 1A、B 所示，显示了本实验期间拍摄的所有视频（共配准前后）计算的平均帧，以演示此步骤的效果。

该管道在很大程度上依赖于光流，这是一种计算机视觉方法，用于通过估计连续帧之间的视速度来估计视频中物体的运动¹³。选择光流是因为它允许量化运动——行为反应的代理——没有任何预先确定的身体部位或感兴趣的动作。此外，这种方法适用于代表性视频的有限图像质量，这些视频是使用实验时唯一可访问的 MR 兼容相机获得的。在这个管道中，使用了全局密集光流估计的 Horn-Schunck 算法;但是，其他算法，例如 Lucas-Kanade 算法，只需对提供的 MATLAB 脚本稍作更改即可轻松使用14,15,16。图 2A 描述了一个示例视频帧，其中每个像素都叠加了相对光流速度矢量。请注意，较大的向量出现在人们预期移动的区域，例如动物的鼻子和爪子。

虽然管道估计了整个 FOV 中所有视频的光流，但通过在 FOV 中选择感兴趣区域 （ROI），其余分析步骤在计算负载和数据存储需求方面变得更加易于管理。可以根据实验和预先确定的感兴趣行为来选择 ROI，也可以通过更加数据驱动的方法来选择。鉴于代表性数据不包括用于先 验跟踪的特定行为输出，因此采用了数据驱动的方法。计算每个像素上所有视频的光流幅度的标准偏差，如图 2B 所示。最高标准差的区域包括动物的轮廓，例如眼睛和鼻子周围，这让人相信观察到的光流波动是由动物运动引导的，而不是视频中的噪声。标准偏差较小的区域包括支架的轮廓，这可能是扫描过程中相机和支架发生小振动的结果。由于梯度的切换，MRI 环境在数据采集过程中不可避免地会受到振动的影响，这可能表现为在摇篮的反射组件中观察到的光流波动。幸运的是，这些振动在整个数据采集过程中是恒定的，因此与刺激条件无关，预计不会影响行为分析的结果。在镜子的像素中观察到特别高的光流标准差，对应于动物面部的轮廓视图，这指导了代表性数据的 ROI 选择。这也是一个区域，行为反应（如拂动和嗅探）可能被视为雌性小鼠寻找发出幼崽叫声的孤立幼崽的典型行为的一部分¹⁷。

在选择 ROI 并提取所有视频的平均帧级光流后，可以比较不同组和条件下感兴趣纪元期间的光流。请注意，每个视频的光流矢量的前 20 秒 （s） 都被屏蔽了以实现亮度稳定;但是，这可以根据实验需求进行调整。对于每个视频，所选 ROI 的帧级光流矢量是 Z 分数，然后，根据之前在面部表情分类方面的工作，它被以 5 赫兹 （Hz） 进行低通滤波，以解释摄像头的 30 Hz 帧速率比任何预期的行为波动都快²。最后，将 Z 评分和过滤的向量分块到刺激呈现时期中，以评估刺激呈现对光流的影响。对于每个时期，减去平均刺激前基线信号，以将光流标准化到刺激前周期。图 3A 显示了两个视频（一个母视频和一个原始视频）的示例光流时间序列，图 3B-E 中的摘要组数据。图 3B 和图 3D 显示了刺激呈现期间相对于基线随时间变化的累积光流，而图 3C 和图 3E 总结了刺激开始后 2.5 秒的累积光流。计算累积光流以捕获随时间变化的整体运动，而不假设自发行为反应会以时间锁定的方式发生。总体而言，这些代表性结果表明，正如预测的那样，幼崽的叫声（而不是纯音）与母鼠和处女雌性小鼠引起的行为反应明显不同（组间 Mann-Whitney U 检验：幼崽叫声：p = 0.026;纯音：p = 0.093）。然而，这种刺激效应没有在 2 向方差分析中幸存下来，而组效应却存活下来（刺激：F（1,10） = 0.19，p = 0.67;组：F（1,10） = 8.61，p = 0.015）。总体而言，这些结果表明，与处女相比，母亲表现出更高的刺激诱发运动，母亲对幼崽叫声的反应比对纯音的反应更一致。这可能反映了母亲的高度关注或压力，以及幼崽叫声的行为相关性，与纯音不同，这引起了母亲在自然主义环境中对幼崽取回的反应。综上所述，这些代表性结果表明，外部刺激呈现期间的光流估计可以提取有关细微的自发行为反应的信息。

最后，进行了更具探索性的分析，以揭示代表性数据中捕获的行为的空间特征。为了研究 ROI 中的哪些像素在刺激呈现期间以协调方式波动，对空间光流信息随时间的变化进行了主成分分析 （PCA）。该分析揭示了对第一台 PC 贡献最大的像素，以及显示每个刺激条件的组差异的像素，如图 4 所示。 图 4A、B 最右侧的面板表明，在这两种刺激类型的呈现过程中，与处女相比，母亲的鼻子运动更多。在两组和两个刺激条件下，第一个 PC 解释了光流分析中总方差的 5.41% ± 0.59%。虽然我们这部分分析保持了镜像 ROI，但未来的分析可以扩展到 FOV 的更广泛部分，以表征响应刺激而超出面部的协调运动。例如，比较爪子的运动可能会揭示更显着的群体差异，因为幼崽的叫声通常会在母亲而不是处女中启动幼崽回收，并且爪子可以比动物的头部更自由地移动。

虽然迄今为止的代表性结果表明，该管道可以在受限的摄像环境中评估对外部刺激的无指导行为反应，但仍然存在一个问题，即观察到的光流波动是否真正反映了有意义的动物行为。为了回答这个问题，使用相同的管道分析了一个单独的验证数据集。在另一项实验中，训练限水雄性小鼠将光提示与 6 μL（“高奖励”）或 1 μL（“低奖励”）水奖励的输送联系起来。值得注意的是，与听觉刺激实验不同，该实验有一个 先验 的行为读数：舔舐率。 通过 基于视频的舔舐检测建立了一个舔舐计，并通过分析靠近出水口的像素亮度来促进。因此，舔计提供的行为读数可用于比较该管道由光流估计提供的行为读数，支持其检测自发行为的有效性。在视频共配准、光流估计、ROI 选择（再次包含镜子 FOV）和光流量化之后，比较光流大小揭示了对高奖励和低奖励的行为反应之间存在显着差异。该分析的结果如图 5A、B 所示，其中 图 5A 显示了组平均时间序列， 图 5B 总结了刺激开始后 2.5 秒的累积光流（条件间配对 Wilcoxon 符号秩检验： p = 0.031）。请注意，与代表性数据中记录的自发行为相比，光流值更大，进一步强调了评估未经指导的、细微的行为反应的挑战。 图 5C 描述了舔舐计在两个奖励条件中分别记录的实际舔舐率，而图 5D 显示在奖励交付后 2.5 秒内，与低奖励条件相比，在高奖励条件下记录的舔舐更多（条件间配对 Wilcoxon 符号秩检验： p = 0.031）。总而言之，这两项分析都揭示了高回报响应与低回报响应的比较趋势相似，验证了所提出的视频分析管道在不同条件下捕捉动物行为的有意义差异。

综上所述，此处显示的代表性结果表明，幼崽叫声的呈现在母体和处女雌性小鼠中引起了显着不同的反应，而纯音则没有。对验证数据集的分析使人们确信，观察到的光流差异反映了对外部刺激的行为反应的有意义差异。

图 1：视频共配。 （A） 描绘预定特征（头柱中心、右眼正面视图、右眼侧面视图）的视频共配示例，用三帧标记，每帧取自不同动物的不同视频。请注意叠加层中的三个点是如何不一致的，展示了数据采集会话之间的行为设置如何略有变化。（B） 执行视频同步之前（左）和之后（右）每个视频最后 10 秒的平均帧。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：光流估计。（A） 相对光流矢量叠加为蓝色的示例帧。（B） 所有视频中光流的平均像素标准差。通过镜子在动物面部轮廓周围选择的 ROI 以洋红色勾勒。颜色条对应于标准差。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：跨组和条件的光流可视化和比较。 （A） 一个母亲视频和一个处女视频的光流示例 Z 评分和 5 Hz 低通滤波时间序列。（B） 和 （D） 在幼犬叫声 （B） 和纯音 （D） 的刺激期间测量的累积光流。阴影表示平均值的标准误差 （SEM）。（C） 和 （E） 幼犬叫声 （C） 和纯音 （E） 刺激呈现的前 2.5 秒内的累积光流。* 表示 p < 0.05，组间 Mann-Whitney U 检验（幼崽叫声： p = 0.026;纯音： p = 0.093），每组 N = 6。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：各组的 PC₁ 比较。（A，B） 描绘了跨组幼崽通话 （A） 和纯音 （B） 期间光流的第一主成分 （PC₁） 负载的地图，在 p < 0.05 处统计阈值，未进行多次比较的校正。热图表示相对于其他像素，每个像素的光流波动对 PC₁ 的影响程度。黑色小文本表示 PC₁ 解释的方差百分比（母亲幼崽的叫声：4.95% ± 0.72%;处女幼崽的叫声：4.44% ± 0.59%;母亲的纯音：4.95% ± 0.39%;处女的纯音：4.72% ± 1.24%（标准差±平均值））。请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：行为分析管道的验证。 （A） 在高奖励和低奖励交付期间光流的平均 Z 分数、减去刺激前基线和 5 Hz 低通滤波时间序列。阴影代表 SEM，白色垂直线表示奖励传递，红色星号表示由于光提示的开始和偏移而导致的临时光流伪影。（B） 奖励发放后前 2.5 秒的累积光流总结。* 表示 p < 0.05，条件间配对 Wilcoxon 符号秩检验 （p = 0.031）。（C） 在高奖励和低奖励交付期间通过 lickometer 获得的平均舔舐率。阴影表示 SEM，白色垂直线表示奖励交付。（D） 奖励发放后前 2.5 秒内记录的舔舐次数。* 表示 p < 0.05，条件间配对 Wilcoxon 符号秩检验 （p = 0.031），N = 6。 请单击此处查看此图的较大版本。

视频 1：示例视频 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi。 请点击此处下载此视频。

视频 2：示例视频 2。 PCR_Br014_20231015_1722_output.avi。 请点击此处下载此视频。

补充文件 1：视频 1 的事件计时文件。 PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat 的 请点击此处下载此文件。

补充文件 2：视频 2 的事件计时文件。 PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat 的 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 1：script1_videocoreg.m. 此脚本 通过 共同配准在空间上将所有视频彼此对齐。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 2：script2_optflow_roiselect.m. 此脚本估计每个转换视频的完整 FOV 的光流，并允许为管道的其余部分选择 ROI。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 3：script3_optflow_analysis.m. 此脚本比较所选 ROI 在不同组/条件下的光流大小。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 4：script4_optflow_pca.m. 此脚本对所选 ROI 的估计光流执行 PCA。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 5：script5_optflow_pca_analysis.m. 此脚本比较所选 ROI 的跨组/条件的 PCA 结果。 请点击此处下载此文件。

讨论

提出的行为分析管道允许从动物表现出未经指导的行为以响应被动呈现的刺激的视频中提取有价值的信息。这些具有代表性的行为视频是与全脑功能磁共振成像 （fMRI） 数据一起获取的，为此克服了多个限制以捕获 MRI 环境中的行为反应。采用光流估计方法，揭示了母亲和处女对幼崽叫声的反应差异——而不是纯音——支持了最初的假设 13,14,15,16。利用光流信息的降维，这一发现被扩展到对这些行为的空间分布的探索性分析。

该分析管道广泛适用于各种实验范式。它与获取的神经数据类型完全无关，不需要过多的计算能力或专用设备。主要实验要求是记录摄像数据以及刺激呈现开始的相关时间戳。此外，通过提供用于执行演示分析的 MATLAB 脚本，即使对于具有 MATLAB 经验的人来说，此管道的实现也应该相当简单。如协议中所述，一般步骤包括视频共配、光流估计、感兴趣区域 （ROI） 选择、ROI 特定光流量化、光流幅度比较、主成分分析 （PCA） 和 PCA 比较。在每个步骤中，都可以修改管道以适应实验和分析需求，如方案中所述，并在整个代码中用注释突出显示。

在使用呈现的视频分析管道时，需要牢记几个限制。首先，应仔细考虑行为装置的设计。如果不清楚可以预期哪些行为反应，那么尽可能多地了解动物的视角可能有利于未来的分析。因此，建议安装一个或多个镜子以同时捕捉动物的正面和侧面视图，如图 1A 中的示例视频帧所示。其次，建议为视频采集提供的照明足够亮，以便看到视场 （FOV） 的所有相关特征，但不要太亮以至于达到饱和。在图 1A 中，可以观察到小鼠鼻子的正面视图处于接近饱和的点，因此很难捕捉到任何表明运动的亮度波动。这可能是导致在这部分 FOV 中观察到的光流变化不足，如图 2B 所示。幸运的是，机头的轮廓视图没有遇到这个问题，允许分析镜子的 ROI。此外，如果实验中涉及视觉刺激，应考虑饱和的可能性。在验证数据集实验中，用于发出水奖励传递信号的光提示在采集的视频中引入了临时饱和，从而在光流估计中造成临时伪影。在图 5A 中可以观察到这种伪影，其中两种奖励条件的光流轨迹中的两个尖峰与光提示的打开和关闭时间完全一致。这种伪影使得这些短时间窗口难以用所呈现的管道进行分析，如果不存在，图 5B 中呈现的结果可能会更加重要。恒定的场景照明是大多数光流算法的必要假设^14,16。因此，不建议将此视频分析管道用于环境照明在试验期间和试验之间发生巨大变化的实验。第三也是最后一点，动物对记录环境的充分适应是任何利用此管道的实验的关键组成部分。如果没有正确适应，动物可能会表现出明显的压力反应，洗掉任何可以通过视频分析解析的细微刺激驱动效应。

展望未来，该行为分析管道可用于促进对同时记录的行为和神经反应的协调评估。如图所示，定量评估无指导行为可以评估复杂记录环境中刺激的显著性，以及测试实验组和条件下的不同行为反应。可以进行进一步分析以探索行为反应的个体差异或逐次试验趋势，以便检查相应的神经活动。此外，结合 PCA 来获取有关刺激诱发运动的空间信息可用于进一步研究在刺激呈现期间观察到的特定类型的行为序列是否因组和条件而异。该分析管道可以轻松扩展到各种神经记录方法，在受限环境中提供多功能的行为监控。通过研究外部刺激在大脑和行为中的表现方式，研究人员可以更全面地了解对刺激的感知如何影响内部状态及其外部表现。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MATLAB 计算机视觉工具箱	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB 图像处理工具箱	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
MATLAB 软件	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MR 兼容相机"12M-i"集成 LED 灯	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf