侵袭是癌症发生与进展过程中的一个重要生物学现象。该过程受到肿瘤微环境中非肿瘤性细胞及各种组分的影响。本研究旨在描述一种用于分析肿瘤细胞侵袭的替代方法 体外 使用三维（3D）培养。
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本文内容
摘要
摘要
类球体培养是一种三维模型，相较于传统的二维（2D）培养，能更真实地模拟体内微环境。侵袭是癌症生物学中备受关注的细胞行为表型。在本方案中，我们设计了一种评估癌细胞侵袭能力的替代策略 体外采用由口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞、癌相关成纤维细胞（CAF）和单核细胞组成的异质类球体。这些异质类球体旨在模拟肿瘤微环境（TME），其中包含两种重要的非肿瘤细胞类型与癌细胞共同存在。在类球体形成前，每种细胞均用发射不同波长荧光的活细胞荧光标记物进行标记。类球体形成后，将其接种于微孔膜上室中一层人源子宫平滑肌瘤来源的细胞外基质上。通过共聚焦显微镜在z轴方向评估细胞侵袭情况。在z轴90 µm深度范围内，以10 µm为间隔，在相应的荧光通道中获取数字图像。使用免费图像分析软件，对每张图像各荧光通道的总荧光强度进行定量分析。该方法可在多层结构背景下更动态地分析细胞侵袭模式，并可观察不同细胞类型在侵袭过程中的空间共定位情况。
引言
侵袭是指肿瘤细胞迁移穿过细胞外基质进入周围组织的过程1,2。随着肿瘤的进展，肿瘤细胞会暴露于日益复杂的微环境之中。肿瘤微环境包含细胞外基质的多种组分以及非肿瘤性细胞类型。基质细胞（包括成纤维细胞和常驻巨噬细胞）通过分泌细胞外基质成分、生长因子和细胞因子来重塑微环境，从而反过来影响肿瘤细胞的功能3。基质细胞和浸润的白细胞也在三维微环境中与肿瘤细胞直接相互作用，彼此之间以及与细胞外基质之间也存在相互作用。总体而言，肿瘤微环境（TME）的组成影响肿瘤细胞侵袭的效率和模式4。
肿瘤微环境的复杂性要求采用高效的方法来理解肿瘤组织内的细胞间相互作用。大多数 体外 用于评估侵袭性的检测方法主要是在传统的二维模型和/或单一细胞类型中进行的 培养物5,6,7,8，这 过度简化了侵袭的复杂过程，且存在多种局限性，例如缺乏组织结构、间质成分以及 体内 可重复性。球状体培养代表了一....
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方案
使用原代人细胞的研究已获得阿拉拉夸拉牙科学院 - 圣保罗州立大学（UNESP）机构人体研究伦理委员会批准（CAAE 57895822.0.0000.5416）。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 三维细胞培养用细胞的制备
注意：本节所有步骤均须在层流罩内进行。
- 获取将形成异质球体的细胞的单细胞悬液。
注意：在本实验中，我们生成了包含口腔鳞状细胞癌细胞系（SCC9）、成纤维细胞（来自舌癌活检组织的原代癌症相关成纤维细胞）和单核细胞（来自健康供体的原代单核细胞）的球体（参见步骤2）。请根据实验需求选择相应的细胞类型。 - 使用血细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞数量和活率。
注意：本方案中细胞比例为5:3:2（5,000个肿瘤细胞 : 3,000个成纤维细胞 : 2,000个单核细胞），每个球体总计10,000个细胞。可根据实验目的优化细胞比例和总数量。 - 将不同类型的细胞分别用适用于各自细胞类型的无添加培养基稀释至1.5 mL离心管中，使接种密度达到每孔5,000个肿瘤细胞、每孔3,000个成纤维细胞、每孔2,000个单核细胞，或总体浓度为每毫升500,000个细胞。
注意：为确保实验所需细胞数量充足，建议按总需求量多准备20%，以弥补染色和离心过程中....
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结果
本研究提出了一种评估细胞侵袭的替代方法 体外 使用由不同类型细胞构成的球状体。该方法能够分析在多层环境中细胞的侵袭模式，以及侵袭过程中细胞共定位动态的变化。图1).
明场图像显示了类球体/细胞的定位情况，表现为深色或黑色的聚集体（图2A）。膜平面由膜孔内最佳焦平面确定，如图像4所示（图2B）。不同细胞的图像（图3：肿瘤细胞，绿色；成纤维细胞，红色；单核细胞，蓝色）在z轴不同层面以及不同细胞类型之间表现出荧光值（强度和数量）的差异，表明不同细胞具有不同的增殖和侵袭模式。通过共聚焦显微镜，还可叠加不同通道，观察侵袭过程中的共定位模式（图4）。
由于本实验方案中使用了不同类型的细胞，需特别注意对侵袭结果的分析。在考察Ra.......
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讨论
三维球体培养是研究细胞生物学多个方面的有力方法。本研究中，我们报道了一种利用异质球体评估肿瘤细胞侵袭的实验方案，该方法通过多层次且更具动态性的方式模拟肿瘤微环境。此方法可在非肿瘤性间质细胞存在的条件下，评估共定位及侵袭模式。
有一些关键步骤需要特别注意。首先，选择能够形成球状体的细胞至关重要12。其次，细胞的侵袭速度各不相同，因此在实验方案中优化并确定合适的侵袭时间窗口十分关键。第三，必须优化荧光活体染料的浓度，并选择具有不同激发和发射光谱的染料，以避免光谱重叠。此外，还需考虑所用细胞的增殖速率，因为活体荧光染料发出的荧光会随着细胞分裂而减弱。本实验方案的一个局限性在于，需要使用能够分泌大量细胞外基质以形成致密球状体的细胞，因为较稀疏的球状体在操作过程中置于细胞外基质上时可能被破坏。此外，利用共聚焦显微镜获取多层细胞侵袭的延时成像数据是不可行的。
描述评估肿瘤细胞侵袭方法的文章数量众多，每种方法都有其自身的局限性和优势。一种类似的方法是分析穿过细胞外基质并黏附在微孔膜底面、经结晶.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP 20/10544-1 和 20/10664-7）资助。部分图像使用 BioRender.com 生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔生物打印试剂盒 | Greiner Bio-one | 655840 | 用于球形体的磁力驱动系统。固定驱动装置。96孔微孔板，具有抗细胞黏附表面 |
| CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| CellTracker Red CMTPX | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34552 | |
| CellTracker Violet BMQC 染料 | Invitrogen, Thermo Fisher | C10094 | |
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31600-034 | |
| DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12400-024 | |
| 含Myogel的细胞外基质 | doi: 10.1186/s12885-015-1944-z | 由Myogel（2.4 mg/mL）、胶原蛋白（0.8 mg/mL）和未添加补充物的肿瘤细胞培养基组成的混合物 | |
| FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12657-029 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H088 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 软件 | |
| Nanoshuttle-PL | Greiner Bio-one | 657841 | 磁性纳米颗粒 |
| 23 G 针头 | Medix | AHMD004 | 25 x 0.60 mm (23 G x 1) |
| PBS pH 7.2 (1x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 2012-027 | |
| 青霉素-链霉素（5,000 U/mL） | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| 移液器吸头 | Axygen, Corning Inc. | TF-200-L-R-S | 带屏障（滤芯）的移液器吸头，200 µL 低吸附滤芯吸头，短型，最大回收率 |
| RPMI | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31800-022 | |
| TransWell 24孔板 | Costar, Corning Inc. | 3422 | Transwell 可渗透支持插入物，6.5 mm，24孔板；0.8 µm 聚碳酸酯膜 |
| Zen 3.4 (蓝色版) | Zeiss Group | 软件 |
参考文献
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges. Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Friedl, P., A....
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重印与许可
