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定制组织培养插件中由重组功能化蜘蛛丝制成的纳米原纤维基底膜模拟物

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DOI：

10.3791/67116

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2024年11月1日

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1Spiber Technologies AB, 2Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 3Division of Protein Technology, KTH Royal Institute of Technology, 4Department of Health Technology, Technical University of Denmark

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

带有塑料膜的组织培养小室是细胞培养实验室中的金标准，可作为可渗透支持物用于构建细胞层和屏障组织模型。在此，我们介绍一种简单的方法，用重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的更具生物学相关性的膜替代塑料膜。

摘要

复制组织屏障 对于生成相关结果至关重要 体外 用于评估新型治疗手段的模型。目前，这通常使用带有塑料膜的组织培养小室来完成，该装置可形成顶侧和基底侧。除了为细胞提供支撑外，这些塑料膜在模拟其天然对应物——即基底膜（一种基于蛋白质的纳米纤维基质）方面仍存在显著不足。本研究展示了一种简便的方法，通过用纯重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的膜替代塑料膜，显著提高组织培养小室的生物学相关性。该丝蛋白膜通过自组装形成，并可自发黏附于无膜的组织培养小室上，从而为细胞提供支持。可根据本方案提供的说明，使用标准3D打印机打印定制的组织培养小室，也可直接购买商用产品替代使用。本方案详细说明了如何建立含丝蛋白膜的培养小室系统，并进一步展示如何沿用传统商用培养小室所使用的相同细胞培养技术。 关键词：组织培养小室，蜘蛛丝蛋白，基底膜，自组装，3D打印，细胞培养，重组蛋白，功能化材料

引言

体外模型因其在测试新型治疗方法和促进对基本疾病机制理解方面的适用性而受到越来越多的关注1,2。为了准确重建天然微环境，关键在于重现基底膜（BM）的功能，基底膜是一种高度特化的细胞外基质（ECM）复合物。基底膜存在于人体几乎所有的组织中，为内皮细胞和上皮细胞提供支持，并将其与下方组织分隔开来2,3。除了提供物理支持外，基底膜还调控并维持细胞与周围组织之间的生化信号。这些重要功能使得设计出在结构、力学特性及功能特性上均类似于天然基底膜的支架成为必要3。

模拟骨髓（BM）的最常见方法之一 体外 如今，通过使用市售的组织培养小室（TC-inserts）即可实现。这些小室本质上是带有可渗透膜的塑料圆筒，可将培养腔室分隔为顶侧和基底外侧4,5尽管使用方便，但商用插入式膜通常由聚碳酸酯（PC）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等聚合物制成，质地较硬，且为径迹蚀刻膜。3,4,6它们在直径、孔隙密度和尺寸方面具有灵活性，并可进行涂层处理以增强细胞黏附，但缺乏基底膜（BM）的其他所有相关特性，例如相似的厚度。6，相互连通的孔隙率、纤维结构和相关的弹性模量3.

TC插入物的标准化及其操作简便性已促使包括我们实验室在内的多个研究团队尝试用更优材料替代塑料膜 体内-样对应物（综述见于 表1）。所用材料包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）等聚合物7聚（丙交酯-共-己内酯）（PLCL）8和聚己内酯（PCL）4,9,10 转化为基于蛋白质的材料，例如明胶2,11,12胶原蛋白5,13，以及重组蜘蛛丝14,15,16,17这些材料的膜已通过多种方式被固定在商用插入式支架上，这些支架原有的膜已被移除4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21，以及通过3D打印定制的插入件1,11,15,17,20 或注塑成型9,22然而，这些仿制品在厚度方面仍远未达到天然基底膜（BM）的水平，其厚度范围从数百微米不等11,18 低至几微米5,10,14,21,22其中许多还需要复杂的形成过程和/或手动连接方法1,7,13,14,18,19,21，使得在其他实验室中进行扩增和重复实验具有挑战性。

本文介绍了一种简单的方法，用于在插入式培养装置上形成并固定丝素膜，并展示了如何在膜的两侧培养细胞。丝素膜通过FN-4RepCT（FN-silk）蛋白在静置溶液的液-气界面处自组装形成。16,17FN-silk 是一种重组表达的、来自主要壶腹腺丝蛋白1（Major Ampullate Spidroin 1）的短片段版本 Euprosthenops australis，通过源自纤连蛋白的RGD基序进行功能化修饰23已证明其可组装成促进细胞黏附、增殖和迁移的纤维状基质15,16,17,23,24,25膜与插入式培养器的连接方法依赖于自发性黏附，已被证实适用于市售的、已去除膜的插入式培养器。16，以及由聚乳酸（PLA）制成的3D打印插件17 和牙科LT15。本文详细介绍了该方法在 Dental LT 打印的插入物中的应用。在将 FN-丝蛋白膜固定到插入物上后，这些插入物在本质上可如同标准的商用组织培养插入物一样进行处理。简而言之，我们提出了一种简单的方法，以生成更具相关性的 体外 通过将塑料膜替换为基于蛋白质的FN-丝蛋白膜，构建组织屏障模型。

方案

1. 插件的3D打印

  1. 从补充文件1下载.STL设计文件（JoVe_Silk_Insert.stl）。
  2. 使用专用于将.STL文件转换为所用3D打印机打印文件的软件包打开文件，进行打印前准备。
  3. 使用专用软件添加支撑结构。支撑结构由软件自动设计，所需数量取决于所用打印机和软件。调整插入件的方向，确保打印平台或支撑结构不接触其底部。
  4. 使用适用于所用3D打印机的生物相容性树脂（如Dental LT或BioMed）或线材（如PLA）打印所需数量的插入件。
    注意：确保材料能够耐受适当的灭菌处理，例如高压蒸汽灭菌、辐照或乙醇浸泡。
  5. 将打印完成的插入件从打印平台取下，并移除成品上的支撑结构。
  6. 若使用树脂打印机，请按照制造商提供的标准流程对插入件进行后处理。
    注意：后处理步骤可能因所用树脂不同而有所差异。本文所用树脂的处理流程详见补充文件2。
  7. 采用适合所选材料的方法对插入件进行灭菌。
    注意：推荐方法包括高压蒸汽灭菌、辐照、70%乙醇浸泡，或上述方法的组合。若使用树脂打印机，可能需要进行充分的浸出处理以达到最佳生物相容性。具体建议请参见补充文件2中的流程。
  8. 确保插入件完全干燥，并在无菌条件下保存至使用。

2. FN-丝膜的形成

  1. 用干冰填满一个盒子，并将其带入 -80 °C 冰箱。
  2. 从 -80 °C 冰箱中取出 FN-蚕丝小瓶，放入干冰中进行运输。将 FN-蚕丝小瓶带至生物安全柜中，并在其中进行后续操作。将 FN-蚕丝小瓶放入微型离心管架中，使其自然解冻，避免频繁触碰。
  3. 在 FN-蚕丝解冻的同时，拆开 48 孔板的包装。一旦 FN-蚕丝完全解冻，应在 10 分钟内（最好尽快）进入下一步操作。
  4. 用预冷或室温的 PBS 将 FN-蚕丝溶液稀释至所需浓度（建议为 1.8 mg/mL）。用移液器将 550 µL FN-蚕丝溶液直接加入 48 孔板空孔的底部。继续移液，直至制备出所需数量的膜。
    注意：避免引入气泡，若出现气泡应立即用移液器去除。不要使用 A 行或 F 行、1 列或 8 列的孔，也不要使用相邻的孔（参见补充图 S1中的示意图）。
  5. 盖上 48 孔板的盖子，并将其放入一个更大的无菌盒中，以在孵育期间提供无菌环境。
  6. 小心地将盒子从生物安全柜中移出，置于无干扰、无明显气流的环境中静置过夜。

3. 将FN-丝素膜黏附到插入物上

  1. 第二天，将无菌插件移至生物安全柜中。
  2. 将装有FN-丝膜的48孔板的大型无菌盒重新移入生物安全柜，并在其中进行后续操作。小心地将48孔板从大型无菌盒中取出。
  3. 通过观察孔内是否呈现浑浊来肉眼确认膜的形成，并打开含有膜的48孔板盖子。使用无菌镊子夹取一个插件，将其缓缓下放至膜上，直至插件手柄接触孔口顶部，如图1所示。保持插件底部与孔板底部平行。
  4. 重复步骤3.3，直至所有已形成的膜上均放置了插件。盖上48孔板盖子，然后将板放回无菌盒中。在常温条件下静置2小时，使膜充分黏附于插件上。
  5. 将培养基或PBS预热至37 °C。
  6. 取出一个24孔板并打开包装。
  7. 2小时后，从盒中取出48孔板并打开盖子。用无菌镊子夹住插件的手柄，将其从48孔板中提起。
  8. 提起后立即向插件内加入预热的培养基或PBS。若进行基底侧接种，则加入100 µL培养基；若进行顶端侧接种，则加入200 µL。若膜需储存以备后续使用，则改用200 µL PBS。
    检查点：若液体能保留在膜上方，则表明提起成功；若液体滴落至实验台面，则表明膜存在泄漏，应弃用。
  9. 将插件放入24孔板的一个空孔中。
  10. 将所有插件从48孔板中取出，并转移至24孔板中。若准备进行细胞接种，则在各孔中加入1,000 µL生长培养基；若用于储存，则加入PBS，同时保持孔板略微倾斜。
    注意：必须确保膜边缘位于液面以下（图2）。
  11. 若需立即接种细胞，请根据细胞接种部位（膜的哪一侧）进入第4节或第5节操作。若暂不接种，则盖上24孔板盖子，将板置于冰箱（4 °C）或37 °C培养箱中。若置于培养箱中，需每隔两天补充PBS，以维持所需液体体积。

4. 在膜的顶端接种细胞

注意：如果膜已保存在 PBS 中，则按照第 6 节所述，将 PBS 替换为预热的培养基。

  1. 收集细胞。制备细胞悬液，使每片膜上含有目标数量的细胞，悬液体积为 20–50 µL。重悬细胞以达到所需的细胞浓度。
  2. 使用 P100 或 P200 移液器吸取 20–50 µL 细胞悬液。将移液器枪头对准膜的中心位置，枪头末端距离插入物内培养基液面 1–2 mm，缓慢按压移液器按钮，在枪头边缘形成液滴。将液滴与插入物内的培养基接触。
    注意：移液时保持移液器垂直于操作台面。
  3. 对剩余的膜重复步骤 4.2。每接种五片膜后，重新混匀细胞储备液以确保细胞分布均匀。以“8”字形方式移动培养板，以促进细胞在膜上的均匀分布。
  4. 在标准条件下（37 °C 和 5% CO2）培养，每隔两天更换一次培养基。

5. 在膜的基底侧接种细胞

注意：如果膜已保存在 PBS 中，请按照第 6 节所述，将 PBS 替换为 100 µL 预热的培养基，并在孔中加入 1 mL 预热的培养基。

  1. 收集细胞并制备细胞悬液，使每20 µL悬液中含有目标数量的细胞。重悬以达到所需的细胞浓度。
  2. 打开培养皿包装并掀开皿盖。确保培养皿的高度足以容纳插入式培养小室，且其底部不会触碰到皿盖。
  3. 使用镊子将插入式培养小室从24孔板中取出，保留孔内的培养基。双手各持一把镊子，将插入式培养小室倒置，使基底侧朝上，顶端侧朝向操作面。将倒置的插入式培养小室放入培养皿中，如图3C所示。对剩余的插入式培养小室重复此操作。
    注意：不要移除顶端侧的培养基，它将在孵育过程中保持膜的湿润。
  4. 在加样前重新混匀细胞储备液，以确保细胞在溶液中分布均匀。使用P100或P200移液器吸取20 µL细胞悬液。将移液器枪头对准膜的中心位置，枪头距离膜表面1–2 mm，缓慢按压移液器活塞，在枪头边缘形成液滴。保持移液器垂直于膜表面，让液滴自然滴落到膜上。对剩余的膜重复此操作。
    注意：每接种5个膜后，需重新混匀细胞储备液，以确保细胞分布均匀。
  5. 盖上培养皿盖，将培养皿和24孔板一同放入培养箱，在标准条件下（37 °C 和 5% CO2）孵育30分钟。
  6. 将含有培养基的24孔板和培养皿移入生物安全柜中。打开两个盖子，双手各持一把镊子，夹取一个插入式培养小室并将其倒置，使膜的顶端侧朝上，基底侧朝下。
  7. 使用P200移液器，在插入式培养小室内加入200 µL培养基。将该小室放回24孔板中已预加培养基的孔中，并对剩余的膜重复此步骤。
  8. 在标准条件下（37 °C 和 5% CO2）进行培养，每隔两天更换一次培养基。

6. 水下培养条件下培养基的更换

  1. 用新鲜培养基在新的24孔板中每孔加入1,000 µL。使用镊子将一个插入式培养小室从24孔板中取出，轻轻倾斜，并吸去顶端侧的培养基。
  2. 在插入式培养小室内加入200 µL新鲜培养基。将该小室放入已预先加满新鲜培养基的孔中。对所有膜重复此操作。

7. 气升式培养条件下培养物的培养基更换

  1. 使用镊子将插入物提起，并放入24孔板的一个空孔中。对另外四个膜重复此操作。
  2. 轻微倾斜24孔板，缓慢向每个孔内加入1,000 µL新鲜培养基。对剩余的膜重复此操作。

8. 测量跨上皮电阻（TEER）

  1. 在24孔板的每个孔中加入1,000 µL培养基或PBS，并将膜插入其中。确保膜上方保留200 µL相应的溶液。
  2. 使用镊子轻轻按压插入物的臂部，以在孔内固定插入物。在不移开镊子的情况下，将TEER电极插入孔中并记录测量值。
  3. 取出电极，然后提起镊子。
  4. 对剩余的膜重复步骤8.2–8.3。

结果

插入件的代表性照片
插入件在从打印平台释放前后的照片如 图3A、B所示。去除支撑材料后的成品插入件图像如图3C所示。最终获得一批可用于灭菌及后续使用的3D打印插入件。

FN-丝膜的提起与操作
FN-丝膜的形成及手动提起的总体示意图见图1。结果是获得若干带有附着FN-丝膜的插入物。为确保完整膜提起的成功率最高，应严格遵循本方案中所述的步骤。图4展示了膜在完整（A,D）和撕裂后（B,E,F）的照片。撕裂可通过明场显微镜观察（图4E,F）和/或通过液体穿过膜的现象（图4B）进行识别。在提起和放下插入物时，必须保持其与膜垂直，以确保膜均匀附着并在插入物下方充分延展。膜的附着情况可通过肉眼观察，如图4A所示。若按说明放下插入物，并将液面维持在图2所示位置，则膜在整个长期培养过程中均能牢固附着于插入物上。

本研究通过开展渗透实验15,16,17，验证了膜在插入物上的附着性，所用膜在标准细胞培养条件下保存了9天。简言之，当将荧光分子添加至膜的上表面，并检测下方溶液中的信号时，蚕丝膜的渗透曲线与市售组织培养插入物一致（图4C），在36小时的渗透过程中未出现泄漏现象，表明膜保持完整且牢固附着于插入物上。此前已有研究在蚕丝膜的一侧15或双侧17接种细胞开展过类似实验。膜的粘附强度此前已通过宏观压痕16和膨胀测试16,17得以证实。在宏观压痕实验中，使用探针拉伸膜，当施加1.4 mN的力时膜发生破裂，但仍保持附着于插入物上16。

需要注意的是，完整膜的剥离成功率与插入物的材料及其后处理方式有关。采用本方案时，使用特定树脂打印的插入物成功剥离并适用于细胞接种的膜比例为95%，而使用另一种类似树脂时该比例为74%。我们推测，这种黏附作用得益于疏水相互作用和范德华力，因此改变材料特性会影响黏附强度。这一点进一步得到以下事实的支持：膜在亲水性材料上无法良好黏附（数据未显示）。

FN-丝素膜上细胞培养的代表性结果
膜的顶端或基底侧培养的角质形成细胞（HaCaT）的免疫荧光图像如图所示 图5黏附的细胞 (图5D.i) 第1天观察到细胞均匀覆盖培养区域，并呈现典型的角质形成细胞铺路石样形态 (图 5A.i-B.i) 第3天，角质形成细胞已形成融合单层 (图5A.ii-B.ii) 并形成了紧密连接网络 (图 5D.ii) 表明它们正在执行生理性的上皮功能。在FN-丝素基质中实现的高细胞存活率15,17,23,24 也在本文所述的丝膜插入式培养体系中进行了培养。培养3天后，角质形成细胞仍保持高存活率（图5Ci-iv）。此外，在中心区域（图5Ci-ii）以及膜的周边区域（图 5C.iii-iv)，表明插入材料对HaCaT细胞活力无显著影响。总体而言，丝素蛋白插入物培养系统提供了相似的（图 5i-ii, v-vi若无改善（图5iii-四，七-八) 角质形成细胞活力与商用PET膜插件系统的比较。

使用 FN-4RepCT 和 PBS 通过移液管引导装置沉积丝膜的示意图。
图 1：单层 FN-丝膜形成及提起过程的详细示意图。（A）在48孔板中每隔一个孔（避开最外圈的行/列）加入FN-丝蛋白溶液，（B）使其在液-气界面处过夜自组装形成膜。（C）用镊子夹住插入件，并借助3D打印插入件上的（D,E）导向结构，缓慢将其垂直下放至膜表面。丝膜黏附情况的放大图显示插入件横截面位于（F）膜正上方，以及（G）接触丝膜时的状态。在2小时孵育期间，（H）丝膜自发附着到插入件上，随后（I）可用于将膜从界面提起。缩写：FN = fibronectin；PBS = phosphate-buffered saline。请点击此处查看该图的高清版本。

离心提取示意图；生物化学样品分离方法中的移液过程。
图2：从成膜板中取出FN-丝蛋白膜后操作步骤的详细示意图。（A）取出后带有膜（紫色）的插入物（灰色）。（B）在膜的顶端侧加入液体（蓝色），然后将插入物置于（C）24孔板中，插入物较长的臂挂在孔板壁上，较短的部分使插入物保持在孔板中央位置。（D）向孔中加入液体，确保液面水平且高于膜边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

微流控芯片制备过程；3D打印模具部件；制造方法比较。
图3：3D打印嵌件的照片。（A）从3D打印机取下后立即拍摄的嵌件，仍附着在构建板上。（B）从构建板上取下后的其中一个嵌件，尚未拆除支撑结构。（C）拆除支撑结构后的其中一个嵌件。请点击此处查看该图的放大版本。

渗透性研究：膜测试、扩散装置、渗透性曲线图、显微镜结果。
图4：断裂前后的纤连蛋白-丝素膜。 (A) 完整膜结构的显微照片 200 µL 染色（蓝色）PBS在顶端一侧。插入物周围包裹的膜边缘以白色箭头指示。（B）同一张膜撕裂后的照片。PBS 正从膜中渗出。C) 图示在标准细胞培养条件下培养9天后，3 kDa荧光分子在36小时内通过丝素膜或商用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的渗透情况。D膜撕裂前的明场图像。E同一膜撕裂后的明场图像，缺陷区域由蓝色虚线标出. (F) 所示裂口的放大视图 D 撕裂膜的边缘由蓝色箭头指示。比例尺 = 1 mm（D，E), 200 µm (F缩写：FN = 纤连蛋白；PBS = 磷酸盐缓冲液；PET = 聚对苯二甲酸乙二醇酯。 请点击此处以查看此图的放大版本。

细胞培养显微镜观察，第1、3天对FN-蚕丝与PET膜进行荧光分析；细胞黏附实验。
图5：在FN-蚕丝膜上培养的角质形成细胞（HaCaT）。 第1天，角质形成细胞已贴附并均匀覆盖在膜的顶端表面A.i）或基底侧（B.i）（鬼笔环肽，绿色）。第3天，在顶端形成融合的单层细胞A.ii）或基础的（B.ii）侧（鬼笔环肽，绿色）。(C) 丝膜上细胞活力的评估i-iv）与商用 PET 膜（v-viii) 在中央（i, ii, v, 六）和外周（iii, iv, 七, 八细胞层）的活细胞以绿色显示（i, iii, v, 七）以及红色标记的死细胞（i, iii, v, 七）或白色（ii, 四, 六, 八）。虚线标记了膜插入界面。D) 放大细节，(i）显示（白色箭头）细胞黏附于膜上（鬼笔环肽，白色）以及(ii) 培养3天后形成的紧密连接网络（ZO-1，白色）。标尺 = 1 mm（第一行： A,B), 100 µm （底行： A,B,C一、二、五、六), 500 µm (C iii, iv, vii, viii), 50 µm (D). 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：以往将膜材料整合到细胞培养插件中的研究工作概述。 缩写：PCL = 聚己内酯；PEGDA = 聚乙二醇二丙烯酸酯；PLGA = 聚（乳酸-共-羟基乙酸）；PDMS = 聚二甲基硅氧烷；PC = 聚碳酸酯；RSS = 重组蜘蛛丝蛋白；PLCL = 聚（乳酸-共-己内酯）；RHSIF = 重组盲鳗黏液中间丝蛋白 请点击此处下载该表格。

表2：在FN-丝蛋白膜上培养的不同细胞类型的既往研究概述。 FN-4repCT（FN-丝蛋白）是澳大利亚盗蛛（Euprosthenops australis）牵引丝的一种短序列版本，通过基因工程重组表达，并在基因水平上融合了来自纤连蛋白的RGD基序。本文所总结的所有案例均使用了该种蛋白。请点击此处下载该表格。

表3：故障排除。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1：用于 3D 打印插件的设计文件（.stl）。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：使用材料表中指定的打印机和树脂时，关于打印、后处理及灭菌的实验方案。 请点击此处下载该文件。

补充图 S1：在48孔板中放置FN-蚕丝溶液时建议采用的排布示意图。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方案概述了一种制备具有生物学意义的细胞培养插件的简便方法。该流程首先打印插件，随后形成并固定纤连蛋白-丝素膜，最后展示如何在膜的顶侧和底侧接种细胞。本方案中有一个至关重要的步骤，对确保细胞培养的长期成功至关重要，即插件在膜上的下降与提起操作。正确执行这些步骤后，可获得一种丝素膜-插件培养系统，其耐受细胞培养的能力可与市售的合成膜系统相媲美。为确保操作成功，定制插件的侧面设计有导向轨，以防止插件倾斜下放或在孔内发生侧向移动，否则会导致膜粘附不均，产生薄弱区域，进而引发渗漏。初次操作时，通常会出现一些轻微问题。为帮助新用户避免这些问题，若在执行上述方案过程中遇到困难，我们已在表3中列出了可能的问题及其解决方案。

已有研究表明，该膜本身适用于模拟不同的屏障组织（详见表2）；但需要指出的是，本文用于打印插入物的树脂尚未经过广泛测试以评估其对其他细胞类型活力的影响。尽管目前我们尚未遇到此类问题，但仍有可能该树脂会对某些敏感细胞的活力和生长产生不利影响。因此，建议进行类似于本文所述的细胞活力检测，以验证该树脂与所用每种细胞类型的相容性。若出现细胞毒性现象，应建立更彻底的固化和/或浸出处理方案，以防止未完全固化的单体随时间推移逐渐浸出并对细胞造成损害。针对本实验方案中所用树脂的此类处理方案示例，可参见补充文件2。该方案此前已被用于制备插入物，以在丝素膜上培养bEnd.3脑微血管内皮细胞长达8天15。

本方法的主要优势在于，它提供了一种简单的方式，用于替换现有组织培养小室中的塑料膜，从而改进静态组织培养模型。主要局限性在于，使用者需要能够使用3D打印设备，或在相关设施中购买打印时间以制作小室。然而，如有必要，也可通过移除商用组织培养小室的膜后加以利用，从而规避此限制。此外，尽管丝膜本质上可作为常规组织培养小室使用，但其更薄且成分为蛋白质，因此相比目前的合成商用膜更为敏感。因此，使用者需更加小心操作，并保持膜处于湿润状态以维持其弹性。需要注意的是，这些膜能够耐受拉伸和膨胀16,17，使其适用于模拟呼吸运动等应用。即便如此，新使用者在初期阶段仍可能损坏部分膜，但随着操作经验的积累，成功率有望提高。若问题持续存在，使用者应参考表3进行故障排查。

在过去的十年中，已提出多种商业塑料插件的替代方案（表1），并且每次比较细胞培养效果时，新的、生物学相关性更高的膜均优于其商用塑料对应物2,5,6,7,14,22这主要体现在屏障功能的增强2,5,6,7,14,22，还在形成更接近天然的细胞生长方面发挥作用14 并通过共培养系统中膜介导的相互作用增强7这一趋势此前已在FN-丝素膜中观察到 在构建血管壁模型时，本研究将人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）与平滑肌细胞（SMCs）分别培养于膜的两侧。结果表明，与商用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜相比，HDMEC与SMCs在纤连蛋白-丝素蛋白（FN-silk）膜上共培养时，SMCs分泌的细胞外基质（ECM）更厚。同样，HDMEC在FN-silk膜上形成的屏障也更为紧密17细胞培养效果的改善可能归因于细胞间通讯的增强以及更佳的 体内样 培养条件。与天然基底膜相比，FN-丝素膜在厚度、结构和机械性能方面更为接近。天然基底膜的厚度介于20 nm与3 µm之间。22 薄，PET膜为10 µm，而FN-丝素膜约为1 µm，均处于天然尺寸范围内。FN-丝素膜的结构也呈纳米纤维状16，就像天然骨髓一样22，而PET膜由带有径迹蚀刻孔的塑料制成，孔径通常在0.4 µm至8 µm之间7PET 膜也比基底膜（BM）刚性大得多，其杨氏模量约为 2 GPa，而基底膜的杨氏模量范围为 kPa 至 MPa，通常引用值在 250–500 kPa 左右。22FN-丝素膜的杨氏模量为115 kPa16，这处于天然条件下。还应注意，一旦细胞在膜上生长，起主导作用的是细胞自身的强度，而非膜本身17最后还应注意，FN-丝蛋白的整合功能化可确保细胞直接黏附于膜上，因此无需额外包被。对于PET膜而言，通常需要包被一种细胞外基质蛋白以确保细胞正常黏附7.

与用于替代聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的其他方法相比（见表1），本方法的主要优势在于使用了重组表达的功能化丝素蛋白。与胶原蛋白等其他基于蛋白质且来源于动物的材料相比，该方法可确保实验的可重复性以及明确的培养条件。需再次强调，由于蛋白本身已具备功能化特性，细胞可良好地贴附于膜上，因此无需额外的包被处理17。此外，本文所述的丝素基膜制备依赖于自组装过程，无需复杂的设备或强化学试剂，而许多其他技术（如静电纺丝）则需此类条件。该膜可自发贴附于插入式培养小室上，因而无需手动操作常见的双组分插入装置、粘合剂或硅胶固定环，从而简化了放大流程，并可在任何实验室中轻松实现可重复性。除了制备简便外，本方法还易于根据用户的实验需求进行调整，例如可使用不同材质的插入小室，并通过调节初始溶液中丝素蛋白的浓度来调控膜的厚度16。最后，据我们所知，该方案可制备迄今最薄的、可独立支撑并固定于组织培养插入装置上的膜，从而最接近天然基底膜的结构特征。

丝膜的制备与操作方案在此介绍，适用于任何在细胞培养实验室中熟悉使用组织培养小室的研究人员。该方法为从塑料膜转向更环保的材料提供了一种简便的过渡方式 体内-样对应物，可利用多种类型的细胞生成更相关的组织模型（表 2丝膜的顶面或底面均可支持细胞培养，也可用于不同细胞类型的双侧共培养。17以蚕丝膜为基础构建的屏障组织模型可应用于与组织培养小室相同范围的实验，包括药物筛选、通透性研究以及感染研究。在需要关注不同类型细胞间相互作用的研究中，此类模型已显示出优于组织培养小室的性能，因其更具优势的 体内类性质17.

披露

L.G. 就职于生产 FN-丝蛋白的公司 Spiber Technologies AB，M.H. 持有该公司的股份。

致谢

作者感谢Spiber Technologies AB提供重组功能化蜘蛛丝蛋白，以及Eline Freeze打印了大部分3D打印插件。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
Alexa Fluor 488Invitrogen; Thermo Fisher ScientificA-21121山羊抗小鼠，稀释比例 1:500
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogen; Thermo Fisher ScientificA12379稀释比例 1:400
anti-ZO-1 (1A12) 抗体Invitrogen; Thermo Fisher Scientific 33-9100小鼠抗人，单克隆抗体，稀释比例 1:200
葡聚糖，Alexa Fluor 680；分子量 3,000，阴离子型Invitrogen; Thermo Fisher ScientificD34681以 200 µL 培养基配制，浓度为 2.5% (w/v)
DMEM/F-12Gibco; Thermo Fisher Scientific31330095添加 5% v/v 胎牛血清和 1% v/v 青霉素-链霉素
乙醇 Solveco132670% (CAS号 64-17-5)
胎牛血清，经鉴定合格，热灭活，美国来源Gibco; Thermo Fisher Scientific16140071
FN-丝蛋白Spiber technologies AB储存于 -80 °C
异丙醇，EMPARTA ACS 分析纯试剂Supelco1096342511≥99.5% (CAS号 67-63-0)
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒Invitrogen; Thermo Fisher ScientificL3224
PBS 瑞典兽医局 / Statens veterinärmedicinska anstalt992420 不含钙和镁，已过滤
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)Gibco; Thermo Fisher Scientific11548876
材料
Dental LT Clear 树脂Denthouse #DLCL-01
HaCaT 细胞CLS300493
Nunc 细胞培养处理多孔板，24 孔Fisher Scientific10604903
Nunc 细胞培养处理多孔板，48 孔Fisher Scientific10644901
TC 插件，用于 24 孔板，PET 材质，透明Sarstedt83.3932.041孔径：0.4 µm
ThinCert 细胞培养插件，半透明膜 (PET)Greiner662640孔径：0.4 µm
设备
EVOM 电压计配筷子式电极 World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH
Form 3BFormLabs
Form WashFormLabs
Form CureFormLabs
Isotemp 通用型精密水浴锅Fisherbrand
倒置荧光显微镜 Eclipse TiNikon
倒置荧光显微镜 DMI6000 BLeica
层流罩 Ninosafe，II 级Labolutions
Midi CO2 培养箱，40 LThermo Scientific

参考文献

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