通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

摘要

蛋白相关新生DNA富集与测序技术（eSPAN）旨在检测染色质相关蛋白在两条复制DNA链上的相对丰度，从而揭示染色质复制及其偶联过程的分子机制。本实验方案描述了在酵母和小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行eSPAN的操作步骤。

摘要

基因组复制由复制体蛋白协调完成，其中包括解旋酶，后者将双链DNA解旋为两条反向平行的单链，每条单链需要不同的复制模式：连续复制（前导链）和不连续复制（后随链）。理解染色质相关蛋白与正在复制的DNA链之间的相互作用 体内 对于阐明染色质组装机制以及与DNA复制相偶联的DNA修复过程至关重要。本方案介绍了蛋白结合新生DNA富集与测序（eSPAN）方法，旨在定量复制叉处前导链和后随链上新生DNA的相对蛋白水平。eSPAN实验流程起始于染色质免疫沉淀（ChIP，用于酵母）或靶点切割与标签化（CUT&Tag；在哺乳动物细胞中）标记目的蛋白，随后通过溴脱氧尿苷（BrdU）免疫沉淀富集与该蛋白结合的新生DNA。对分离得到的单链DNA（ssDNA）进行链特异性的高通量测序。该技术可用于确定某蛋白是否在前导链或后随链复制叉处富集。eSPAN技术可提供复制叉处染色质相关蛋白（包括组蛋白）在全基因组范围内的链偏好性信息。

引言

在真核生物中，基因组复制起始于多个称为复制起始位点的位点，在这些位点上，起始识别复合物（ORC）结合并启动包括CMG解旋酶在内的蛋白机器的招募，从而启动DNA复制¹。每个复制起始位点处的复制体机器形成两个双向移动的复制叉^2,3。这两个复制叉通过前导链的连续合成和后随链的不连续合成来复制两条亲本DNA链。由于每个复制叉具有这种不对称性，因此作用于前导链和后随链的复制组分（包括DNA聚合酶）也有所不同。基于突变型DNA聚合酶的前期遗传学分析表明，DNA聚合酶ε（Pol ε）和DNA聚合酶δ（Pol δ）分别是负责前导链和后随链复制的主要聚合酶^4,5。目前已开发出多种方法用于检测DNA聚合酶的链偏好性，包括Pu-seq^6,7、HydEn-seq⁸以及emRiboSeq或RiboSeq^9,10。这些用于解析链特异性的遗传学方法仅限于DNA聚合酶，并且需要对每种蛋白引入突变^4,5,11,12。追踪任何目标蛋白与DNA复制叉上前导链和后随链的关联，将为理解DNA复制过程提供重要见解。为此，我们首先在酵母细胞中建立了eSPAN技术（与蛋白结合的新生DNA富集与测序，图1）。作为原理验证研究，我们首次证明Pol δ和Pol ε分别在后随链和前导链上富集。我们还揭示了其他关键DNA复制组分的链偏好性，包括复制性DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白（复制蛋白A）、增殖细胞核抗原（PCNA）环及其装载复合物复制因子C（RFC）¹³。更重要的是，我们及其他研究团队已利用该方法揭示了亲本组蛋白传递的机制，这一过程在超过40年的时间里一直难以解析^14,15,16,17。

eSPAN 方法包含两个连续步骤：首先通过 ChIP¹⁸ 或 CUT&Tag¹⁹ 富集目标蛋白，再通过 BrdU 免疫沉淀富集与该蛋白相关的新生 DNA。在标准的酵母菌株（W303 或 S288C）中，细胞外的 BrdU 或 EdU 无法进入细胞并掺入染色体。这些菌株缺乏适当的核苷转运蛋白以摄取胸苷，也缺乏将胸苷磷酸化为一磷酸胸苷（TMP）所需的胸苷激酶，而该步骤可将 BrdU（或 EdU）转化为 BrdUMP（EdUMP）。表达人源平衡型核苷转运蛋白 1（hENT1）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）可增强胸苷的摄取，并促进 BrdU（或 EdU）转化为 BrdUMP（EdUMP）²⁰。因此，为了在酵母中进行 eSPAN 实验，菌株必须整合 BrdU 掺入结构（BrdU-Inc）（即 HSV-TK 和 hENT1）^13,21。

此前，我们已提供了用于酵母中DNA复制蛋白的eSPAN实验方案²²。最近，我们将CUT&Tag方法整合到哺乳动物细胞的eSPAN流程中，以解决技术上具有挑战性的步骤，例如交联、染色质剪切，并尽量减少起始细胞数量^17,23。在此，我们提供了利用酵母细胞进行可视化分析的组蛋白eSPAN方法（图2）。该方法主要用于分析复制DNA链上组蛋白修饰形式的分布情况。尽管我们测试了多种组蛋白标记，但本文以H3K4me3为例进行说明，该标记存在于亲本组蛋白H3上。为了分析复制叉处的复制体组分及参与DNA修复的相关因子，我们建议采用超声处理将染色质剪切为较小片段，具体操作如我们在第一篇文献中所述²²。对于哺乳动物细胞，我们采用了改良的Cut&Tag流程，以替代酵母中所描述的ChIP步骤²³。这一改进显著减少了起始材料（细胞）的需求量，更重要的是，能够在无需单链DNA制备试剂盒的情况下构建用于测序的eSPAN文库。在酵母实验方案中，我们选择不使用Cut&Tag方法，原因是起始材料的量已足够。更为关键的是，我们发现Cut&Tag流程在我们的实验条件下对酵母细胞的效果并不稳定。

方案

注意：缓冲液和试剂的配制指南，请参见缓冲液和试剂配制指南（补充文件1）。

1. 酿酒酵母中的组蛋白eSPAN

注意：大多数酵母菌株缺乏用于胸苷摄取的功能性核苷转运蛋白。为了利用 BrdU 或 EdU 对 DNA 进行高效标记以用于 eSPAN 实验，需要使用胸苷激酶阳性（TK+）菌株²¹。此外，只有交配型为 'A' 的酵母菌株才能使用 α 因子进行细胞周期阻滞。

1. 酵母细胞同步化与BrdU标记（8小时）
   1. 将适当酵母菌株（TK+）的单菌落接种于10 mL YPD培养基中，在30 °C、220 rpm条件下于摇床培养箱中过夜培养。
   2. 使用分光光度计测定光密度（OD600 nm），并将菌液稀释至新鲜的200 mL YPD培养基中，使OD600约为0.2–0.3。
   3. 在30 °C、220 rpm的摇床培养箱中培养，使菌液浓度达到OD600 ~0.4-0.5（通常需要3-4小时）。
   4. 加入300 µL α-因子（5 mg/mL），于25 °C、220 rpm条件下培养1.5小时。
   5. 加入另一剂300 µL的α-factor（5 mg/mL），于25 °C、220 rpm条件下继续培养1.5小时。
   6. 在细胞同步化期间，配制37.5%多聚甲醛固定液，并将培养基（200 mL YPD + HU（羟基脲）+ BrdU）预热至30°C。
      注意：操作 BrdU 时需谨慎，因其具有潜在的致突变性和致畸性。在化学通风橱中配制 37.5% 多聚甲醛溶液，以避免接触有害气体，因为多聚甲醛具有潜在致癌性。
   7. 在3小时G1期阻滞前15分钟，使用光学显微镜检查细胞形态（杆状），以确保至少90%的酵母细胞处于G1期。或者，可进行荧光激活细胞分选（FACS）分析以确认G1期阻滞。²⁴.
      注意：在此步骤中检查细胞形态，并确认G1期阻滞（90%细胞呈杆状）。
   8. 通过在1600 × g下离心收集细胞（沉淀） g 4 °C下离心5分钟，并用20 mL预冷的双蒸水重悬细胞沉淀，洗涤两次。
   9. 将细胞重悬于预热（30 °C）的 200 mL YPD + HU + BrdU 中。
      注意：使用羟基脲（HU）释放的目的是确保大多数酵母细胞处于早期复制S期，从而提高实验结果的一致性并保证可重复性。若实验需要使用对数生长期细胞，则可省略羟基脲处理。
   10. 将细胞置于摇床培养箱中，在30 °C、220 rpm条件下培养45分钟。
       注意：可通过流式细胞术（FACS）分析以确认早期S期。进行FACS分析时，必须包含一个对数生长期的样本作为对照，以准确界定G1期细胞群体。为实现高效的BrdU掺入，建议使用快速生长的细胞起始实验。某些生长缓慢的突变体通常表现出较低的BrdU标记效率。BrdU掺入效率及BrdU免疫沉淀（BrdU-IP）实验效果可通过定量PCR比较复制区域与未复制区域进行评估²² 使用步骤 1.6.7 中分离的 DNA
2. 样品固定与收集（1 小时）
   1. 加入新配制的6 mL 37%多聚甲醛，使终浓度为1%，充分混匀，于25 °C、90 rpm轻柔振荡孵育20分钟。
   2. 加入12 mL 2.5 M甘氨酸终止固定，充分混匀，于25 °C、90 rpm轻柔振荡孵育5 min。
   3. 1600 × g 离心收集细胞 g 室温（RT）孵育5分钟。随后，加入20 mL冷水分两次洗涤细胞，每次在1600 × g离心 g 5 分钟。
   4. 将细胞收集至2 mL螺口管中（每管50 mL细胞），并于-80 °C保存。
      ​注意：细胞可储存长达一年（暂停点）。
3. 酵母细胞裂解与染色质片段化（5 小时）
   1. 解冻细胞沉淀，轻轻涡旋重悬，并用含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物（防止污染细菌生长）的 0.4 mL ChIP 裂解缓冲液洗涤，然后在 5 000 × g 离心 g 1 分钟。
   2. 加入含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 ChIP 裂解缓冲液 0.1 mL，随后加入约 100 µL 玻璃珠（0.5 mm）。
   3. 在4 °C冷藏室中，通过珠击破碎法裂解样品，共进行3个循环（开启30秒/关闭30秒，间隔1分钟）。
   4. 用16号热针在管底打孔。
      注意：为保持针头高温，应将试管尽量靠近火焰。
   5. 将离心管嵌套入一个1.5 mL空的DNA低吸附离心管中，收集裂解液，并在1600 × g下离心 g 室温下，2 分钟
   6. 小心吸走上清液，避免扰动沉淀物（染色质将位于细胞碎片部分）。
      注意：使用真空泵时，小心勿误吸细胞沉淀。
   7. 用移液器将细胞沉淀重悬于0.35 mL MNase消化缓冲液中，该缓冲液中添加有0.5 mM亚精胺和0.1 mM 2-巯基乙醇。
   8. 加入10单位MNase至反应体系中，立即轻轻颠倒混匀4–6次，于37 °C水浴中孵育20分钟。
      注意：应针对每批 MNase 酶优化消化条件，以富集单核小体、二核小体或三核小体组分。
   9. 通过加入5 µL 0.5 M EDTA使EDTA终浓度达到10 mM，以终止MNase消化反应。轻轻颠倒混匀，立即将离心管置于冰上，至少放置30分钟。
      注意：此步骤中样品可在 4 °C 下过夜保存。应优化 MNase 消化条件，以获得主要为单、双或三核小体组分（140–450 bp）的片段
   10. 使用Bioruptor微管（1.5 mL）对反应混合物进行超声处理3分钟（高功率，开启30秒/关闭30秒）。在10,000 × g下离心 g 4 °C下离心5分钟。
       注意：短暂超声处理有助于将染色质释放到缓冲液中。
   11. 将上清液转移至新管中，再于10,000 ×g离心10分钟 g 在 4 °C 下。
   12. 收集上清液（约 400 µL），保留其中 30 µL 样品作为输入 DNA，于 -20 °C 冻存。将剩余的（约 370 µL）细胞裂解液用于后续染色质免疫沉淀实验（步骤 1.4.1）。
4. 组蛋白染色质免疫沉淀（过夜）
   1. 向裂解液中加入0.5 µg H3K4me3抗体，于4 °C、10 rpm条件下在旋转仪上旋转孵育过夜。
      注意：此处以 H3K4me3 为例，抗体用量应通过实验进行优化。
   2. 15,800 × g 离心  g 4 °C下离心10分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。
   3. 加入20 µL预清洗的蛋白G Sepharose珠（用ChIP裂解缓冲液洗涤3次，每次在旋转仪上轻柔旋转孵育3分钟，350 × g，4 °C）并在 4 °C 下孵育 2 小时。
   4. 350 × g 离心 g 在室温下孵育，并按以下顺序洗涤珠子。
      1. 用1 mL预冷的裂解缓冲液在室温下以10 rpm转速于旋转仪上旋转洗涤两次，每次3分钟。
      2. 用 1 mL 含 0.5 M NaCl 的预冷裂解缓冲液洗涤一次 在室温下，以10 rpm的转速在旋转仪上旋转3分钟。
      3. 在室温下，将样品在旋转仪上以10 rpm转速旋转，用1 mL预冷的Tris/LiCl洗涤缓冲液洗涤一次，每次3分钟。
      4. 用1 mL室温Tris/EDTA洗涤缓冲液（非TE缓冲液）洗涤一次， 补充文件 1 （配方详见实验方案）。使用16号半针头将沉淀中的所有可能液体彻底吸出。
5. DNA 提取（2 小时）
   1. 向洗涤后的磁珠（步骤 1.4.4.4）、输入样本（步骤 1.3.12）中加入 0.1 mL 充分混匀的 10% DNA 提取螯合树脂，涡旋混匀。
   2. 在100 °C金属浴中煮沸10分钟，然后冷却至室温以逆转交联。
      注意：强烈建议使用离心管防弹开锁定夹以保持管盖密封。
   3. 向珠中加入5 µL 20 mg/mL蛋白酶K，55 °C孵育30分钟，同时以400 rpm振荡。
   4. 将珠子置于100 °C金属浴中加热10分钟，以灭活蛋白酶K活性。
      注意：强烈建议使用离心管止动弹扣夹以保持封闭密封。
   5. 6000 转离心珠子 g 室温下孵育2分钟，保留上清液。
   6. 向沉淀中加入100 µL 2XTE缓冲液，涡旋混匀后在6000转下离心 g 室温下持续 2 分钟。
   7. 混合并保存上述步骤（1.5.5 和 1.5.6）中收集的上清液（约 180 µL）。
   8. 使用ssDNA文库制备的DNA纯化柱（以步骤1.3.12的产物为输入，步骤1.5.7的H3K4me3 ChIP-seq样品为输入），将30 µL样品纯化至18 µL洗脱缓冲液（EB，随PCR纯化试剂盒提供）中。
      注意：DNA 样本可在 -20 °C 保存长达一个月（暂停点）。
6. BrdU 免疫沉淀（5 小时）
   1. 将样品（约150 µL输入量，以及步骤1.5.7中获得的H3K4me3 ChIP样品）在100 °C金属浴中煮沸5分钟，随后立即置于冰上冷却5分钟。加入15 µL 10×PBS、1.35 mL BrdU免疫沉淀缓冲液、0.5 µL抗BrdU抗体和1 µL E.coli tRNA（10 mg/mL）
      注意：此步骤至关重要。请使用低DNA吸附离心管，以避免非特异性DNA结合。
   2. 在4 °C、10 rpm条件下，于旋转仪上孵育2小时。
   3. 将混合物转移至含有20 µL蛋白G Sepharose珠（用1 mL BrdU免疫沉淀缓冲液洗涤三次，每次洗涤在室温下以10 rpm转速旋转孵育3分钟）的1.5 mL离心管中，于4 °C在10 rpm转速下旋转孵育1小时。
   4. 800 × 离心 g 室温孵育1分钟，随后按以下步骤洗涤：用1 mL冷BrdU免疫沉淀缓冲液洗涤3次，每次在旋转仪上孵育3分钟，再用1 mL TE缓冲液洗涤1次，孵育3分钟。
   5. 800 × g 离心 g 室温下孵育1分钟，吸除上清液。
   6. 向剩余的珠子中加入 100 × µL TE + 1% SDS 缓冲液。 在 65 °C 孵育 5 分钟。以 800 × g 室温下孵育1分钟。
   7. 使用DNA纯化柱将上清液纯化至18 µL EB缓冲液中（BrdU IP和H3K4me3 eSPAN样品）。
      注意：使用低吸附离心管以避免非特异性DNA结合。DNA样本可在-20 °C保存长达一个月（暂停点）。
7. 单链DNA文库制备与测序（3小时）
   1. 使用纯化的输入DNA、BrdU免疫沉淀（IP）、H3K4me3染色质免疫沉淀（ChIP）和eSPAN样品（步骤1.5.8和1.6.7）各15 µL，按照单链DNA（ssDNA）及低输入量DNA文库构建试剂盒说明书进行单链DNA文库制备（包括接头连接酶、延伸和连接步骤），并将所得连接产物纯化至20 µL低EDTA洗脱缓冲液（由DNA文库构建试剂盒提供）。
      注意：该试剂盒包含两个连接纯化步骤。本方案遵循200 bp的纯化标准， <1 ng 操作步骤。
   2. 使用总体积为 50 µL 的反应体系（试剂来自 ssDNA 文库制备试剂盒）扩增 DNA 文库：20 µL 纯化后的 DNA 文库，4 µL 试剂 W2，10 µL 试剂 W3，1 µL 酶 W4，1.5 µL Indexes I7 引物（10 µM，参见补充寡核苷酸序列），1.5 µL Indexes I5 引物（10 µM，参见补充寡核苷酸序列），16 µL 无 DNase 的 ddH₂O₂O. 将PCR反应体系在98 °C加热30 s，随后进行18个循环：98 °C 10 s、60 °C 30 s、68 °C 1 min，最后在68 °C延伸10 min。
      注意：每个文库应使用独特的i7和i5引物组合。扩增循环数应根据文库的量进行调整，以避免过度扩增，过度扩增可能导致PCR副产物。鉴于eSPAN样本中DNA量通常较低，扩增循环数最多使用18个循环。
   3. 通过加入60 µL（1.0倍体积）预热至30 °C的磁珠（见 材料表).
   4. 充分混匀PCR产物与磁珠。
      1. 室温静置5分钟。将磁珠置于磁力架上结合3分钟，用新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠两次（每次200 µL）。
      2. 将磁珠风干2分钟，然后用20 µL低EDTA缓冲液（DNA文库构建试剂盒中提供）洗脱。
   5. 使用高分辨率电泳系统测定文库浓度和片段大小分布（参见 材料表).
   6. 将等量的各个文库（包括input、H3K4me3 ChIP、BrdU IP和eSPAN样本）混合，使用Illumina测序平台进行平行双端测序。数据分析步骤参见第3节。
      注意：质量控制结果的评估标准为：（i）未检测到接头/引物二聚体峰（低于180 bp）；（ii）所有待混合的文库具有相似且狭窄的片段分布（宽度约300 bp）。磁珠过度干燥可能导致得率降低；建议使用DNA工作站以避免污染。文库可在-20˚C长期保存（暂停点）。

2. 小鼠胚胎干细胞中的组蛋白eSPAN技术

注意：使用小鼠胚胎干细胞的组蛋白eSPAN方法与先前发表的方案基本相同²³。

1. 小鼠胚胎干细胞的BrdU标记与样品采集（3小时）
   1. 在37 °C、湿润且含5% CO₂的培养箱中，使用小鼠ES细胞培养基培养小鼠ES细胞₂ 在培养箱中培养至细胞融合度达到70%–80%。通常情况下，组蛋白eSPAN实验需要约100万个细胞。实验前1天接种细胞，以确保细胞处于指数生长期。
   2. 更换培养基，加入 BrdU 至终浓度为 50 µM，于 37 °C、湿润、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育细胞 30 分钟₂ 大气
      注意：BrdU标记效率可通过定量PCR分析进行监测。此外，也可使用免疫荧光或流式细胞术（FACS）分析来评估BrdU的掺入效率。未标记的细胞可作为阴性对照。上述为小鼠胚胎干细胞的标准标记条件。建议根据增殖速率和S期持续时间不同的细胞类型，相应调整标记条件。
   3. 用预冷的 PBS 轻柔冲洗细胞两次。
   4. 用胰蛋白酶消化并以200 × g离心收集细胞 g 5 分钟。
   5. 轻轻吹打将细胞重悬于培养基中，随后进行细胞计数。将所需数量的细胞在500 × g条件下离心 g 室温下孵育5分钟。
   6. 将细胞沉淀用 4 mL 洗涤缓冲液通过移液重悬，弃去上清液。在 500 × g 室温下孵育5分钟。
   7. 再次用4 mL洗涤缓冲液重悬沉淀，于500 × g离心 g 室温下孵育5分钟。
   8. 弃去上清液，并将细胞重悬于洗涤缓冲液中。
   9. 将ConA包被的磁珠（每250,000个细胞使用10 µL磁珠；细胞数量增加时按比例放大）重悬于1 mL结合缓冲液中。经多次倒置混匀后，将试管置于磁力架上，使磁珠沉降。
   10. 使用移液器或低速真空装置弃去上清液。重复洗涤步骤两次，将磁珠重悬于结合缓冲液中。
   11. 将预洗的ConA包被磁珠加入样品中。充分混匀，室温下旋转孵育10–20分钟。
   12. 将试管置于磁力架上，弃去所有上清液。
2. 标签化片段化¹⁹ 小鼠ES细胞培养（2天）
   1. 将珠粒（步骤2.1.10中与细胞结合的刀豆球蛋白A包被磁珠）重悬于200 µL预冷的抗体缓冲液中。加入IgG作为阴性对照，或加入针对目标蛋白的适当浓度的一抗。
   2. 充分混匀，4 °C 条件下振荡孵育过夜。
   3. 将2 µg二抗与适量pA-Tn5按1:2摩尔比混合，用50%（v/v）甘油将总体积补至每样本8 µL。轻轻吹打数次以充分混匀，室温孵育1小时。
   4. 放置 CUT&将样本置于磁力架上标记，静置30秒，弃去全部上清液。向磁珠沉淀中加入1 mL Dig-wash缓冲液，颠倒混匀数次。
      注意：从本步骤至后续洗涤步骤（2.2.5–2.2.6），建议在倒置操作后将磁珠在缓冲液中孵育3–5分钟，以避免非特异性结合。
   5. 将离心管置于磁力架上，彻底去除上清液。每管中加入200 µL Dig-300缓冲液重悬磁珠，并加入8 µL二抗与pA-Tn5的混合物。用移液器反复吹打混匀后，室温孵育1小时。
   6. 将离心管置于磁力架上，彻底去除上清液。加入1 mL Dig-300缓冲液重悬磁珠，反复倒置数次。
   7. 将试管置于磁力架上，彻底移除上清液。重复洗涤步骤3次。
   8. 完全去除上清液，加入250 µL片段化缓冲液重悬磁珠，37 °C孵育1小时。
      注意：建议在恒温混匀仪中进行反应步骤时使用轻柔振荡，因为磁珠可能会沉降到管底。
   9. 将离心管置于磁力架上，吸除全部上清液。加入1 mL TAPS洗涤缓冲液重悬磁珠，反复倒置混匀数次。
   10. 将试管置于磁力架上，弃去所有上清液。
   11. 向剩余的珠子中加入250 µL含有15 mM EDTA、0.1%（w/v）SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K的Dig-300缓冲液。涡旋混匀，于37 °C轻轻振荡孵育过夜。
3. 基因组DNA纯化与 体外 小鼠胚胎干细胞中的标签化反应（过夜）
   注意：用于 eSPAN 的同批细胞的基因组 DNA 已被提取并准备就绪 体外 片段化（tagmentation），用于BrdU-IP-ssSeq。基因组DNA的片段化及其后续的BrdU-IP-ssSeq步骤用于eSPAN标准化。
   1. 将细胞重悬于300 µL基因组DNA裂解缓冲液中，涡旋振荡至肉眼不可见沉淀。
   2. 每个样本中加入终浓度为 100 µg/mL 的 RNase A。混匀后，于 37 °C 孵育 10 分钟。
   3. 向每个样品中加入 100 µL 蛋白质沉淀溶液。充分涡旋混匀，于 15,000 离心 g 室温下孵育3分钟。
   4. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中保存。向样品中加入等体积的异丙醇，并充分混匀。
   5. 室温下以最大速度离心3分钟，使基因组DNA沉淀。小心倾倒上清液。
   6. 向每个样品中加入1 mL新配制的70%（v/v）乙醇，颠倒混匀数次。室温下以最大速度离心3 min。
   7. 在15,000下离心 g 室温孵育1分钟，用P20移液器除去残留乙醇，静置晾干5-10分钟。
   8. 加入 50 µL ddH₂O₂O并短暂涡旋以重悬基因组DNA。65 °C下溶解30分钟。
   9. 短暂离心，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。使用分光光度计测定DNA浓度。
   10. 设置 体外 如所列的片段化反应 表1.
   11. 充分混匀，37 °C 轻柔振荡孵育 30 分钟。
   12. 向每个样品中加入 10 mM EDTA、0.1% (w/v) SDS 和 0.1 mg/mL Proteinase K。涡旋充分混匀，于 37 °C 摇床孵育过夜。
4. DNA 提取与寡核苷酸替换（3 小时）
   ​注意：苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）法和柱纯化法均可用于DNA提取。此处提供使用柱纯化法的详细操作步骤。
   1. 向样品（步骤 2.2.11 和 2.3.12）中加入 1.25 mL（5 倍体积）结合缓冲液（随 PCR 纯化试剂盒提供），通过反复倒置充分混匀。
   2. 将混合物加入DNA纯化柱（置于2 mL收集管中），在10,000 × g条件下离心30秒 g 室温下弃去穿流液。
   3. 向柱中加入 600 µL 洗脱缓冲液（试剂盒中提供），在 10,000 × g 条件下离心 1 分钟 g 室温下弃去穿流液。
   4. 以最大速度离心2分钟，彻底去除残留缓冲液。将柱子放入新的1.5 mL离心管中（管盖打开），室温晾干1分钟。
   5. 加入 32 µL 无 DNase 的 ddH₂O₂O（或10 mM Tris·HCl，pH = 8.0）加入膜的中部，静置1分钟。以最大转速离心2分钟，然后进行CUT&标签DNA现在处于溶液中。
   6. 加入32 µL的CUT&将DNA样本转移至新的PCR管，然后加入2 µL dNTP混合液（每种2.5 mM）、4 µL 10x Ampligase缓冲液和2 µL rep-B（10 µM）。轻轻敲击管壁，并用移液器吹打混匀。
   7. 短暂离心后，进行以下寡核苷酸替换程序²³.
      50 °C，1 分钟
      45 °C，10 分钟
      以 0.1 °C/s 的速率升至 37 °C
      ​37 °C，保持
   8. 在PCR仪中，向每管加入1 µL T4 DNA聚合酶和1 µL Ampligase（每样本终体积为40 µL）。轻轻吹打混匀。
   9. 在37 °C下继续在热循环仪中反应30-60分钟。
      注意：如果在此步骤后不立即进行BrdU免疫沉淀，DNA可在-20 °C保存（安全暂停点）。
5. BrdU 免疫沉淀（基本与酵母实验方案相同）（2 小时）
   1. 将样品转移至1.5 mL DNA低吸附离心管中。在100 °C金属浴中煮沸样品5分钟，立即置于冰上冷却5分钟。加入15 µL 10x PBS、+ 1.35 mL BrdU免疫沉淀缓冲液 + 0.5 µL 抗BrdU抗体 + 1 µL E.coli tRNA（10 mg/mL）
   2. 4 °C下在旋转摇床上孵育2小时。
   3. 将混合物转移至含有20 µL蛋白G Sepharose珠（用1 mL BrdU免疫沉淀缓冲液洗涤三次，每次3分钟）的离心管中。
   4. 4 °C 下孵育 1 小时。
   5. 800 × 离心 g 1分钟，随后按以下步骤洗涤：用1 mL冷BrdU免疫沉淀缓冲液洗涤3次，每次在旋转仪上孵育3分钟；再用1 mL TE缓冲液洗涤1次，孵育3分钟。
   6. 800 × g 离心 g 1 分钟后吸除上清液。
   7. 加入100 µL TE + 1% SDS缓冲液至剩余的珠子中，65 °C孵育15分钟，800 × g 1 分钟。
   8. 使用DNA纯化柱（BrdU IP和H3K4me3 eSPAN样品），将上清液纯化至18 µL洗脱缓冲液（随试剂盒提供）中。
6. PCR 扩增与测序（1.5 小时）
   1. 使用不同的index组合扩增并标记单链DNA文库样本。通过添加以下组分配制PCR反应体系（纯化的DNA [ChIP或ESPAN]、I5-index引物 [1 µL]、I7-index引物 [1 µL]、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 µL]、ddH₂O）₂最多20 µL），用移液器吹打混匀样品，并短暂离心。
   2. 将PCR混合物在98 °C加热30 s，随后进行12-14个循环（98 °C 10 s，63 °C 20 s），最后72 °C延伸1个循环，持续2 min。
   3. 使用18 µL磁性微珠（0.8倍体积）纯化PCR产物，并将产物洗脱至20 µL低EDTA缓冲液中。
   4. 使用高分辨率电泳系统测定文库浓度和片段大小分布。
   5. 将等量的各个文库（包括input、H3K4me3 ChIP、BrdU IP和eSPAN样本）混合，使用Illumina测序平台进行平行双端测序。

3. 酵母细胞的eSPAN数据分析（1天）

注意：此数据分析流程仅适用于酵母数据；胚胎干细胞（ES细胞）的eSPAN数据分析可参照近期发表的一项研究²³中的方法进行。

1. 提取原始测序文件，使用 Trim Galore 工具去除接头序列，并移除长度小于 10 bp 的读段，以减小输出文件大小并避免比对程序崩溃。确保成对末端测序文件的命名格式为 file1_1.fq、file1_2.fq：
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq -o trim --length 10 --paired
2. 为参考基因组生成 bowtie 索引文件：
   bowtie2-build genome.fa
3. 使用 Bowtie2 将读段比对至相应的参考基因组（酵母数据使用酿酒酵母基因组 sacCer3）：
   bowtie2 -x genome -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --local --no-dovetail --no-discordant --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
4. 使用 SAMtools 去除多重比对读段，并使用 Sambamba 工具去除重复读段：
   samtools view -bhs -q 40 input.bam -o output.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
5. 使用 deeptools 从清洗后的 bam 文件分别为每一样本在 Watson 链和 Crick 链上生成读段覆盖度的 bigwig 文件：
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 --extendReads
   bamCoverage -b filtered.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 --extendReads
6. 根据以下公式计算每个样本在每个核小体位置的平均偏差²⁵：在参考核小体定位区域分离后，计算正向（Watson 链）与反向（Crick 链）读段数的 log2 比值²⁵。相关计算的 R 脚本可在 https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias 获取。标准计算请使用以下命令： 
   注意：此步骤仅适用于酵母数据；胚胎干细胞（ES 细胞）的偏差计算可参照近期发表的文献方法²³。
   Rscript cal_bias.R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
7. 如有必要，通过 BrdU 偏差对链偏好性进行校正：
   Rscript normalize_bias.R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --target target_list --control control_list
   注意："matrix_files" 是由 cal_bias.R 脚本生成的文件列表，以逗号分隔，例如 'file1','file2','file3'。"classes_list" 是与每个文件对应的样本类别列表，以逗号分隔（例如 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'）。"condition_list" 是与每个文件对应的实验条件列表，以逗号分隔。每个文件将根据类别和条件配对进行偏差校正。"target_list" 是从 classes_list 中选取的类别列表，用于定义需要被对照校正的数据类别（例如 'H3K4me3_eSPAN','H3K56ac_eSPAN'）。"control_list" 是从 classes_list 中选取的类别列表，用于定义作为校正基准的对照类别。请确保该列表长度与 target_list 一致（例如 'brdu'）
8. 完成计算与校正后，对样本进行分组并生成数据可视化图表。
   Rscript draw_bias.R -s 'bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g group1,group2 --interval=T
   -s 参数需提供上述脚本生成的偏差文件列表
   -o 为输出文件名
   -g 定义实验分组，用于计算组内平均偏差（例如生物学重复）
   --interval T 或 F，用于在图中显示实验组内的标准误差
   注意：复制起始位点信息由 BrdU IP 数据定义。单核小体位置信息来自先前发表的文章²⁵。对于小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）数据的分析，复制起始位点信息来自 OK-seq 数据集²⁶，平均偏差的计算应遵循先前研究中描述的方案²³。

结果

eSPAN可用于获取关于靶蛋白（如组蛋白及其修饰）的链特异性信息。在此代表性结果中，样本收集和eSPAN操作按照图2所示的流程，利用芽殖酵母系统进行。样本处理与收集遵循本方案中经羟基脲处理的早期S期条件。实验使用了两种酵母菌株：野生型（WT）和mcm2-3A突变体。DNA解旋酶亚基MCM2作为亲代组蛋白H3-H4的分子伴侣，而mcm2-3A突变体（含有3个氨基酸突变）则丧失了结合亲代组蛋白H3-H4的能力^14,27。图3A显示了具有恒定长度倍数的DNA片段，呈现出通过生物分析仪分析测序文库所观察到的染色质核小体梯状模式。通常，按照本方案制备的eSPAN文库浓度范围为2 nM至20 nM。在标准eSPAN流程中，我们还制备了输入样本（input）和BrdU免疫沉淀（BrdU-IP）的单链DNA文库，可分别作为ChIP和eSPAN文库的对照或偏差归一化依据。

讨论

与前导链和后随链复制相关的蛋白质检测对于理解染色质复制机制及其相关过程具有重要意义，这些过程直接关系到人类癌症研究以及药物耐药机制。多种方法可用于此类研究，例如二维凝胶电泳、天然染色质免疫沉淀（nChIP）、iPOND 和新生染色质捕获^29,30,31，已被用于研究DNA复制及相关过程，如DNA修复。此外，一些方法可用于 在体内 新生染色质的绘图，例如 MINCE-Seq（染色质新生元件测序） 在体 EdU标记新生染色质并测序³² 以及 CHOR-seq（复制后染色质占据分析）³³，已开发用于研究DNA复制过程中组蛋白及其他染色质结合蛋白的动态变化。尽管这些方法显著推动了我们对染色质复制的理解，但均无法检测复制叉不同链上的蛋白质。eSPAN方法可提供靶蛋白在复制叉处的高分辨率、全基因组范围及链特异性的分析谱图。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	赛默飞世尔科技	15575020
1.5 mL DNA低吸附管	Eppendorf	22431021
10x Ampligase 缓冲液	Lucigen	A1905B
10x PBS	康宁	21-040-CV
10x TBS	伯乐（BioRad）	1706435
16 G × 1-1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头	BD 生物科学	305198
ACCEL-NGS 1S PLUS DNA文库构建试剂盒	Integrated DNA Technologies	10009817	单链DNA与低起始量DNA文库制备试剂盒
安捷伦 2100 生物分析仪	安捷伦	2100 生物分析仪
Agilent DNA 1000试剂盒	安捷伦	5607-1504
Ampligase	Lucigen	A0110K	操作多聚甲醛时需谨慎，其为易燃固体危险品。
AMPure XP	贝克曼	A63881
AMPure XP SPRI 试剂	贝克曼库尔特	A63882
抗BrdU抗体	BD 生物科学	555627
抗H3K4me3抗体	abcam	ab8580
自动细胞计数仪 ，型号 TC10	伯乐（BioRad）	145-0001
杆菌肽	Sigma	11702
Bacto蛋白胨	赛默飞世尔科技	211830
盐酸苯甲脒	Sigma	B2417	可燃固体
BrdU	Sigma	B5002	小心操作 BrdU，因其具有潜在的致突变性和致畸性。
BSA	New England Biolabs	B9000S
CaCl2	Sigma	C4901
细胞培养箱	赛默飞世尔科技  Forma系列II水套式CO₂培养箱	3140
细胞培养基
细胞系 ES-E14
Chelex-100	伯乐（BioRad）	1422842	200–400目干筛粒径
氯仿	Sigma	366919
刀豆蛋白A（ConA）包被的磁珠	Polysciences	86057-10
Digitonin	Millipore	300410-5MG
DMSO	Sigma	D8418
E. coli tRNA	Sigma	10109541001
乙醇	赛默飞世尔科技	BP2818100	小心操作乙醇，其具有易燃性
葡萄糖	Sigma	G7021
甘油	Sigma	G5516
HCl	Sigma	H1758
HEPES	Sigma	H3375
异丙醇	赛默飞世尔科技	BP26324	操作异丙醇时需小心，其具有易燃性
KAPA HiFi HotStart Ready Mix	罗氏	7958889001
KCl	Sigma	P9541
KOH	sigma	221473	操作氢氧化钾时需小心，具有腐蚀性
低速真空
磁力架	Millipore	LSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR 温度循环仪	Eppendorf	5331
MgCl2	Sigma	M8266
微球菌核酸酶  （MNase）	沃辛顿	LS004798
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28006
微型珠磨机	Mini BeadBeater 24 细胞破碎仪	607
微型离心机	Eppendorf	5424R
MnCl₂	Sigma	244589
多平台摇床	Fisherbrand	02-217-765
多平台摇床培养箱	基准测试	INCU-SHAKER 10L
多温控加热模块	Eppendorf	Thermomixer C
N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸 (靶向甲基化测序，TAPS)	Sigma	T5130	200–400目干筛粒径
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Sigma	S8045	小心操作 NaOH，具有腐蚀性
NEBNext HiFi 2× PCR预混液	New England Biolabs	M0541
NP-40 Igepal CA-630	赛默飞世尔科技	J61055.AP
多聚甲醛	sigma	158127	操作多聚甲醛时需谨慎，其为易燃固体，具有危险性。
pA-Tn5 酶	Addgene	121137
Pefabloc	Sigma	11429868001
苯酚-氯仿-异戊醇	Invitrogen	15593049
P1000、P200、P20 和 P2 移液器	Eppendorf	2231300004
PMSF	Sigma	10837091001
蛋白酶抑制剂混合物片剂	Sigma	S8830
蛋白酶抑制剂混合物片剂	Sigma	S8830
Protein G-sepharose珠子	GE Healthcare	17-0618-02
蛋白沉淀溶液	Qiagen	848023
蛋白质沉淀溶液	Qiagen	848023	操作氢氧化钾时需小心，具有腐蚀性
蛋白质沉淀溶液	Qiagen	848023
蛋白酶K	Sigma	311584401
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
RNase A	Sigma	10109169001
SDS	Sigma	L3771
分光光度计	赛默飞世尔科技	2000/2000c
亚精胺	Sigma	S2626
T4 DNA聚合酶	新英格兰生物实验室	M0203
台式离心机	贝克曼库尔特	Allegra X-5
Tris	Sigma	11814273001
Triton X-100	Sigma	T8787
酵母提取物	赛默飞世尔科技	212730