通过富集和蛋白质相关新生DNA测序法对复制DNA链进行的特异性分析

摘要

蛋白质相关新生DNA富集与测序（eSPAN）旨在检测染色质相关蛋白在两条复制DNA链上的相对丰度，从而揭示了染色质复制及其耦合过程的分子层面洞见。本协议描述了酵母和小鼠胚胎干细胞（ES）中的eSPAN程序。

摘要

基因组复制由包括解旋酶在内的复制蛋白协调，它们将双链DNA解开成独立的反平行单链，每种复制都需要不同的复制方式：连续的（主导）和不连续的（滞后）。理解染色质相关蛋白与复制DNA链在 体内 的相互作用，对于阐明染色质组装和DNA修复与DNA复制相关的机制至关重要。该方案介绍了蛋白质相关新生DNA富集与测序（eSPAN）方法，旨在定量复制叉处新生主链和滞后DNA链上的相对蛋白水平。eSPAN程序始于染色质免疫沉淀（ChIP，酵母中）或在目标和标记（哺乳动物细胞中）下切割，随后通过溴脱氧尿苷（BrdU）免疫沉淀富集蛋白质相关的新生DNA。链特异性次代测序应用于分离的ssDNA。该技术可用于确定蛋白质在领先或滞后复制叉处是否富集。eSPAN提供染色质相关蛋白的全基因组链偏好，包括复制叉处组蛋白。

引言

在真核生物中，基因组复制从多个称为复制起点的位点发起，起源识别复合体（ORC）结合并启动包括CMG解旋酶在内的招募蛋白机制，启动DNA复制¹。每个复制起点的再生机制形成两个双向移动的复制叉 ^2,3。双重复制叉通过连续合成主链和不连续合成滞后链来复制DNA的两条母链。鉴于每个复制叉的不对称性，复制组分，包括领先链和滞后链上的DNA聚合酶，是不同的。基于突变DNA聚合酶的先前遗传分析表明，DNA波尔ε和DNA波尔δ分别负责主导和滞后链复制的主要聚合酶，^4,5。已开发多种方法用于检测DNA聚合酶的链偏好，包括Pu-seq ^6,7、HydEn-seq⁸，以及emRiboSeq或RiboSeq ^9,10。这些用于解剖链特异性的遗传方法仅限于DNA聚合酶，并且需要在每个蛋白质^{4、5、11、12}上引入突变。追踪任何目标蛋白与DNA复制叉的领先和滞后链的关联，将为DNA复制提供宝贵的见解。在此过程中，我们首先开发了eSPAN技术（富集并测序与蛋白质相关的新生DNA，见图1）在酵母细胞中。作为主要证明研究，我们首先证明了Pol δ和Pol δ分别富集于领先和滞后的丝。我们还揭示了关键DNA复制组分的链偏好，包括复制DNA解旋酶、单股DNA结合蛋白（复制蛋白A）、增殖细胞核抗原（PCNA）灯及其载入剂复制因子C（RFC）¹³。重要的是，我们和其他人利用这种方法揭示了亲代组蛋白转移的机制，这一过程在四十多年里一直难以^解决。

eSPAN方法包含两个连续步骤：通过ChIP¹⁸或CUT&Tag¹⁹富集目标蛋白，以及通过BrdU免疫沉淀富集与该蛋白相关的新生DNA。在标准酵母菌株（W303或S288C）中，细胞外BrdU或EdU无法进入细胞并整合到染色体中。这些菌株缺乏适合胸腺嘧啶摄取的核苷转运蛋白，以及将胸苷磷酸化为TMP所需的胸腺嘧啶激酶，TMP将BrdU（或称EdU）转化为BrdUMP（EdUMP）。表达人类平衡核苷转运蛋白1（hENT1）和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-TK）促进胸腺嘧啶的摄取及BrdU（或EdU）向BrdUMP（EdUMP^）的转化。因此，在酵母中进行eSPAN实验时，必须插入BrdU-Incorporating （BrdU-Inc）结构（HSV-TK和hENT1）^13,21。

此前，我们提供了酵母²²中DNA复制蛋白的eSPAN协议。最近，我们将CUT&Tag方法集成到哺乳动物细胞中的eSPAN协议中，以解决需要优化的技术难点步骤，如交联、染色质剪切，并最小化起始细胞数量^17,23。这里，我们提供了组蛋白eSPAN，用于使用酵母细胞进行可视化（见图2）。该方法主要用于分析改造组蛋白在复制DNA链上的分布。在测试多个组蛋白标记时，我们以H3K4me3作为例子，这是父本组蛋白H3上的标记。为了分析复制叉DNA修复相关的复制物组分和因素，我们建议如我们首篇出版物²²中所述，使用超声波将染色质剪切成小片段。对于哺乳动物细胞，我们采用了修改后的Cut&Tag程序，以取代酵母²³中描述的ChIP步骤。该修饰减少了起始材料（细胞）的数量，最重要的是，使得无需单链DNA制备试剂盒即可生成用于测序的eSPAN文库。对于酵母方案，我们选择不使用Cut&Tag方法，因为起始物的量足够。更重要的是，我们发现Cut&Tag程序对我们手中的酵母细胞效果并不一致。

方案

注意：有关缓冲液和试剂制备指南，请参见缓冲液和试剂制备指南（补充文件1）。

1. 出芽酵母中的组蛋白eSPAN

注意：大多数酵母菌株缺乏功能性核苷转运蛋白以吸收胸腺嘧啶。为了高效地用BrdU或EdU标记eSPAN的DNA，需要一种胸苷激酶阳性（TK+）菌株²¹ 。此外，只有交配型“A”酵母菌株可用于利用α因子进行细胞周期停滞。

1. 酵母细胞同步与BrdU标记（8小时）
   1. 将一个适合的酵母菌株（TK+）单菌落接种到10毫升YPD培养基中，并在摇晃培养箱中以220转/分钟在30°C下过夜生长。
   2. 用分光光度计测量光学密度OD600 nm，并将培养物稀释到新鲜的200毫升YPD培养基中，用OD600 ~0.2-0.3。
   3. 在30°C、220转/分钟的摇晃培养箱中培养培养至OD600~0.4-0.5（通常需3-4小时）。
   4. 加入300微升α因子（5 mg/mL），在25°C、220 rpm下培养1.5小时。
   5. 再加300微升α因子（5 mg/mL），在25°C、220 rpm下生长1.5小时。
   6. 在细胞同步过程中，准备37.5%对甲醛固定溶液，并将培养基（200毫升YPD +胡（羟基）+BrdU）预热至30°C。
      注意：使用BrdU时要小心，因为它可能成为诱变和致畸剂。在化学排气柜中准备37.5%的对甲醛溶液，以避免暴露于有害气体，因为对甲醛是潜在致癌物。
   7. 用光学显微镜检查细胞形态（条状），确保至少90%的酵母细胞在3小时G1停滞前15分钟处于G1期。或者，进行荧光激活细胞分选（FACS）分析以确认G1停止²⁴。
      注意：在此步骤中检查细胞形态并确认G1停滞率（90%为条形）。
   8. 在1600 克 离心法下收集细胞（沉淀），在4°C下5分钟，并用20毫升冰冷的双蒸馏水清洗细胞沉淀两次。
   9. 将细胞重新悬浮在预热（30°C）的200毫升YPD +胡+BrdU中。
      注意：氢胡释放的目的是确保大多数酵母细胞处于早期复制S期，从而提高一致性并确保结果的可重复性。如果需要使用对数相单元，省略氢胡是可以接受的。
   10. 在摇晃培养箱中，30°C，220转/分钟，培养45分钟。
       注意：可以通过FACS分析确认早期S期。对于FACS分析，包含对数相样本作为对照非常重要，以准确定义G1细胞群体。为了高效地掺入BrdU，从快速生长的细胞开始是有利的。一些生长迟缓缺陷的突变体通常表现出较差的BrdU标记效率。通过定量PCR比较复制和未复制区域²² ，使用步骤1.6.7分离的DNA评估BrdU合成的效率和BrdU-IP的表现。
2. 样本固定与采集（1小时）
   1. 将新鲜制备的6毫升37%对甲醛加入最终浓度1%，充分混合后，在25°C下培养20分钟，轻轻摇晃，90转/分钟。
   2. 通过加入12毫升2.5 M甘氨酸来淬火固定，充分混合后，在25°C下培养5分钟，轻轻摇晃，90转/分钟。
   3. 在室温下，1600 克 沉淀5分钟。然后用20毫升冷水在1600 克 水下旋转5分钟，洗净细胞两次。
   4. 将细胞收集在2毫升螺旋盖管中（每管50毫升细胞），并储存在-80°C下。
      注意：细胞可以保存最长一年（暂停时间）。
3. 酵母细胞裂解与染色质断裂（5小时）
   1. 解冻细胞沉淀，通过轻柔漩涡重新悬浮，然后用0.4毫升ChIP溶解缓冲液和蛋白酶抑制剂和抗生素混合物清洗（防止污染细菌生长），在5,000 克 下旋转1分钟。
   2. 加入0.1毫升含蛋白酶抑制剂的ChIP溶解缓冲液和抗生素混合物，随后加入约100微升玻璃珠（0.5毫米）。
   3. 通过在4°C冷室中用珠子打打3个周期（30秒断停，1分钟）进行溶解。
   4. 用16克热针在管底打孔。
      注意：为了保持热针，尽量让管子靠近火源。
   5. 将管子放入1.5毫升空DNA低结合管中，并在1600 克 离心2分钟，RT。
   6. 小心抽取上清液，不要扰动沉淀（染色质会在细胞碎片分组中）。
      注意：使用真空时要小心不要误吸细胞颗粒。
   7. 通过移液0.35毫升MNase消化缓冲液，补充0.5 mM的精明和0.1 mM的2-巰基乙醇，将细胞沉淀重新悬浮。
   8. 加入10单位MNase，立即倒置4-6次，轻柔混合，并在37°C水浴中培养20分钟。
      注意：每批MN酶的消化条件应优化，以富集单核、二核或三核小体组分。
   9. 通过添加5微升0.5 M EDTA来淬灭MNase消化，最终浓度为10 mM EDTA。用倒置方式轻轻混合，并立即将管子放入冰中至少30分钟。
      注意：此时样品可在4°C下过夜保存。MNase的消化条件应优化以获得大多数单核体、二核体或三核小体组分（140-450碱基对）
   10. 用生物破坏机微管（1.5毫升）对反应混合物进行超声处理，浸泡3分钟（高功率，30秒开关）。在10,000 克 下，4°C下旋转5分钟。
       注意：这种短暂的超声处理有助于释放染色质进入缓冲液。
   11. 将上清液转移到新管子中，再以10,000 克 、4°C旋转10分钟。
   12. 收集上清液（约400微升），保留30微升样本作为输入DNA，并在-20°C冷冻。将剩余（~370微升）细胞裂解液用于下一次染色质免疫沉淀（步骤1.4.1）。
4. 组蛋白染色质免疫沉淀（过夜）
   1. 向裂解液中加入0.5微克H3K4me3抗体，并在转子上以每分钟10转/分钟、4°C过夜运行。
      注意：这里以H3K4me3为例。抗体含量应通过实验检测。
   2. 在15,800 × g 下，4°C旋转10分钟，然后将上清液转移到新的1.5 mL管上。
   3. 加入20微升预洗蛋白G塞法罗糖珠（用ChIP溶解缓冲液洗涤3次，在转子上每颗发泡3分钟，以350×克，4摄氏度离心收集珠子），并在4摄氏度4°C下孵育2小时。
   4. 在RT下以350克 ×旋转，并按照以下顺序洗珠。
      1. 用1毫升冰冷溶解缓冲液在RT旋转10转/分钟的旋转中洗涤两次，每次3分钟。
      2. 用1毫升冰冷溶解液和0.5 M NaCl缓冲液在RT上旋转，以10转/分钟旋转洗涤一次。
      3. 用1毫升冰冷的Tris/LiCl洗涤缓冲液在RT旋转10转/分钟的旋转中洗涤一次，洗涤3分钟。
      4. 用1毫升RT Tris/EDTA洗涤缓冲液（不是TE缓冲液，食谱 补充文件1） 清洗一个。用16克半针将所有可能的液体从颗粒中吸出。
5. DNA提取（2小时）
   1. 在洗净的珠子（步骤1.4.4.4）、输入样品（步骤1.3.12）中加入0.1毫升充分混合的10%螯合树脂用于DNA提取，并加入漩涡。
   2. 在100°C的热块上煮10分钟，然后冷却至RT进行反联交联。
      注意：强烈建议使用离心管的止爆锁夹以保持密封。
   3. 将5微升20 mg/mL蛋白酶K加入珠子，并在55°C下培养30分钟，同时以400转/分钟摇晃。
   4. 将珠子在100°C的热块上再煮10分钟，以使蛋白酶K活性失活。
      注意：强烈建议使用离心管的止爆锁夹以保持密封。
   5. 在6000 克 下用RT旋转2分钟，保留上清液。
   6. 向沉积物中加入100微升2XTE。涡旋，旋转下降，6000 克 ，持续2分钟，在RT下。
   7. 混合并保存上述步骤1.5.5和1.5.6的上清液（约180微升）。
   8. 使用DNA纯化柱将30微升样本纯化至18微升洗脱缓冲液（EB，PCR纯化套件附赠）中，用于ssDNA文库制备（步骤1.3.12为输入，步骤1.5.7为H3K4me3 ChIP-seq样本）。
      注意：DNA样本可在-20°C下保存最长一个月（暂停时间）。
6. BrdU免疫沉淀（5小时）
   1. 将样品（约150微升输入量和步骤1.5.7的H3K4me3 ChIP）在100°C的热块上煮沸5分钟，然后立即放入冰块冷却5分钟。加入15微升10x PBS，+ 1.35毫升BrdU IP缓冲液+0.5微升抗BrdU抗体+1微升大 肠杆菌 tRNA（10 mg/mL）。
      注意：这是一个关键步骤。使用低DNA结合离心管以避免非特异性DNA结合。
   2. 在转子上以4°C、10转/分钟的速度振动2小时。
   3. 将混合物转移到一个1.5毫升的管子中，内含20微升蛋白G塞法罗糖珠（用1毫升BrdU IP缓冲液洗涤三次，每次在RT洗涤时以10转/分钟旋转3分钟），在转子上以4°C、转子转速10转/分钟旋转1小时。
   4. 在800 ×克 下逆流洗1分钟，然后按以下方式清洗：用1毫升冷BrdU IP缓冲液洗三次，在转子上洗3分钟，用1毫升TE缓冲液洗3分钟。
   5. 在800×克 下旋转1分钟，吸取上清液。
   6. 在剩余珠子中加入100×微升TE+1%SDS缓冲液。在65°C下培养5分钟。在800×克 下旋转1分钟，用RT速度。
   7. 利用DNA纯化柱（BrdU IP和H3K4me3 eSPAN样本）将上清液纯化为18微升的电子代谢液。
      注意：使用低结合离心管以避免非特异性DNA结合。DNA样本可在-20°C下保存长达一个月（暂停点）。
7. SSDNA文库制备与测序（3小时）
   1. 根据ssDNA和低输入DNA文库制备套件提供的手册，用15微升纯化输入、BrdU IP、H3K4me3 ChIP和eSPAN样本（步骤1.5.8和1.6.7）（包括适配酶、延伸和连接步骤）制备单链DNA文库，并将获得的连接产物纯化成20微升低EDTA洗脱缓冲液（由DNA文库准备套件提供）。
      注意：该试剂盒包含两个连接纯化步骤。该方案遵循200碱基对<1纳克的程序。
   2. 使用总共50微升的反应混合物（由ssDNA文库制备套件提供的试剂）扩增DNA文库：20微升纯化DNA文库，4微升试剂W2,10微升试剂W3,1微升W4酶，1.5微升指标I7引物（10微米，参见补充寡核序列）和1.5微升指标I5引物（10微米， 参见补充寡核苷酸序列），16微升无DNase的ddH₂O。将PCR混合物加热至98°C30秒，随后在98°C加热18个10秒，60°C加热30秒，68°C1分钟，68°C10分钟。
      注意：每个库应使用独特的i7和i5引子组合。扩增周期的次数应根据文库数量调整，以避免过度扩增，避免产生PCR伪影。鉴于eSPAN样本中通常DNA含量较低，最多可使用18个循环。
   3. 通过混合60微升（1.0倍体积）的珠子（预热至30°C）来纯化PCR产物（见 材料表）。
   4. 彻底混合PCR产物和珠子。
      1. 让它在RT状态停留5分钟。将珠子绑在磁性支架上3分钟，然后用新鲜制备的80%乙醇（每次200微升）洗涤两次。
      2. 将珠子自然风干2分钟，洗脱到20微升低EDTA缓冲液中（DNA文库制备套件中提供）。
   5. 使用高分辨率电泳系统测量文库的浓度和片段尺寸分布（见 材料表）。
   6. 将等量的独立库汇集，包括输入、H3K4me3 ChIP、BrdU IP 和 eSPAN 采样，并用 Illumina 测序平台进行并行对端测序。关于数据分析过程，请参见第3节。
      注意：质量控制结果的评估标准为：（i）未检测到接头/引子-二聚体峰（低于180碱基对）。（ii） 所有待合并的库大小分布相似且狭窄（~300 bp 宽度）。珠子过干可能导致产量低;使用DNA工作站以避免污染。库可以在-20°C（暂停点）无限存储。

2. 带鼠标ES单元的直组eSPAN。

注意：小鼠ES细胞的组蛋白eSPAN基本与之前发表的协议²³相同。

1. 小鼠ES细胞的BrdU标记与样本采集（3小时）
   1. 在37°C的ES细胞培养基中培养小鼠ES细胞，湿度为5%_CO2 ，达到70%-80%的汇聚度。一般来说，组蛋白eSPAN需要约100万个细胞。实验前一天播种细胞，以确保细胞以指数级生长。
   2. 更换培养基，并以BrdU在37°C湿度加湿、_CO2 浓度5%的情况下，以BrdU培养30分钟。
      注意：BrdU的标记效率可以通过定量PCR分析监测。另外，也可以使用免疫荧光或FACS分析来监测BrdU的掺入效率。未标记细胞可作为阴性对照。这些是小鼠ES细胞的标准标记条件。建议根据增殖速率和S期持续时间不同的细胞调整标记条件。
   3. 用冰镇PBS轻轻冲洗细胞两遍。
   4. 用胰蛋白酶化并收集细胞，200 g的×沉淀5分钟 。
   5. 轻轻移液将细胞移液至培养基中重新休眠，然后计数。在500 × g 下离心所需数量的细胞，持续5分钟。
   6. 通过移液将细胞沉淀重新悬浮于4毫升洗涤液中，并丢弃上清液。离心机在500×克 下用RT离心5分钟。
   7. 再次用4毫升洗涤液悬挂颗粒，并在500×克 下离心5分钟。
   8. 丢弃上清液，将细胞重新悬浮在洗涤缓冲液中。
   9. 放入ConA涂层磁珠（25万个细胞使用10微升珠;使用更多细胞时放大），并重新封入1毫升结合缓冲液中。多次倒转后，将管子放在磁性支架上，让珠子沉降。
   10. 使用移液器或低速真空，将上清液丢弃。重复洗涤步骤两次，然后将珠子重新悬浮在结合缓冲液中。
   11. 在样品中加入预洗的ConA涂层磁珠。搅拌均匀，在RT上旋转10-20分钟。
   12. 将管子放在磁力架上，将所有上清液排除掉。
2. 小鼠ES细胞标记¹⁹ （2天）
   1. 将珠子（与步骤2.1.10中细胞结合的ConA涂层磁珠）重新悬浮于200微升冰冷抗体缓冲液中。将IgG作为阴性对照或针对目标蛋白的适当浓度的一级抗体添加。
   2. 充分混合后，在4°C的夜间进行豆粒化。
   3. 将2微克二级抗体和适量pA-Tn5混合，比例为1：2摩尔。将总体积提升至8微升/样品，使用50%（v/v）甘油。移液管多次搅拌均匀，并在RT培养1小时。
   4. 将CUT&Tag样品放在磁铁台上30秒，然后丢弃所有上清液。向珠子沉淀中加入1毫升挖掘洗涤液，并多次倒置。
      注意：从此步骤到以下清洗步骤（步骤2.2.5-2.2.6），建议在倒置步骤后将珠子在缓冲液中孵育3-5分钟，以避免非特异性结合。
   5. 将管子放在磁石架上，去除所有上清液。加入200微升Dig-300缓冲液以重新悬浮珠子，并将8微升的二级抗体和pA-Tn5混合物加入每个样品。经过多次移液充分混合后，在RT下孵育1小时。
   6. 将管子放在磁石架上，去除所有上清液。加入1毫升Dig-300缓冲液，重新悬浮珠子并多次倒置。
   7. 将管子放在磁石架上，去除所有上清液。再重复洗涤步骤三次。
   8. 完全去除上清液，加入250微升标记缓冲液以重新浮出微珠，并在37°C下孵育1小时。
      注意：热混合器反应步骤建议轻轻摇晃，因为珠子可能会沉积到管底。
   9. 将管子放在磁石架上，去除所有上清液。使用1毫升TAPS洗涤缓冲液重新浮起珠子并反转多次。
   10. 将管子放在磁石架上，丢弃所有上清液。
   11. 在剩余的珠子中加入250微升Dig-300缓冲液，含15 mM EDTA、0.1%（w/v）SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K。用漩涡搅拌均匀，在37°C下过夜并轻轻摇晃。
3. 小鼠ES细胞的基因组DNA纯化和 体外 标记（隔夜研究）
   注：从eSPAN的同一细胞提取基因组DNA并用于体 外 标记，用于BrdU-IP-ssSeq。基因组DNA标记及其后续的BrdU-IP-ssSeq用于eSPAN规范化。
   1. 将细胞重新悬浮在300微升基因组DNA裂解缓冲液中，并以最大速度旋转，直到看到任何沉淀。
   2. 每个样本都加入RNase A，浓度为100 μg/mL。混合后，在37°C下孵育10分钟。
   3. 向每个样品加入100微升蛋白质沉淀液。通过漩涡和离心机在15,000 克 的RT下充分混合3分钟。
   4. 通过转移至新的1.5毫升管来保存上清液。向样品中加入1倍体积的异丙醇，充分混合。
   5. 在RT下以最大速度旋转3分钟，沉淀基因组DNA。小心地倒掉上清液。
   6. 向每个样品加入1毫升新鲜制备的70%乙醇（v/v），并多次倒置。以最大速度离心3分钟。
   7. 在15,000 克 离心机下离心1分钟，用P20移液器去除剩余乙醇。让风干5-10分钟。
   8. 加入50微升ddH₂O，短暂旋转以重新休眠基因组DNA。在65°C下溶解30分钟。
   9. 短暂离心后将上清液转移到新的1.5毫升管中。用分光光度计定量DNA浓度。
   10. 按照表1列出的体外标记反应进行。
   11. 搅拌均匀，在37°C下轻轻摇匀，孵育30分钟。
   12. 在每个样品中加入10 mM EDTA、0.1%（w/v）SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K。通过漩涡搅拌均匀，并在37°C下摇匀孵育。
4. DNA提取与寡核苷酸置换（3小时）
   注意：苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）和柱式纯化均可用于DNA提取。这里提供了使用柱净化的详细步骤。
   1. 向样品中加入1.25毫升（5倍体积）结合缓冲液（PCR纯化套件附带）（步骤2.2.11和2.3.12），并通过多次倒置均匀混合。
   2. 将混合物装入DNA纯化塔（2毫升收集管），并在10,000 × g 的RT离心机下进行30秒。将流动液丢弃。
   3. 向柱中加入600微升洗脱缓冲液（试剂盒中含），并在10,000 × g 下离心1分钟，离心后弃置流通缓冲液。
   4. 以最大速度离心2分钟，完全清除剩余缓冲液。将柱子放入新的1.5毫升管子中，打开盖子，自然风干1分钟。
   5. 在膜中间加入32微升无DNase的ddH₂O（或10 mM Tris·HCl，pH = 8.0），并让膜静置1分钟。以最大速度离心2分钟，CUT&Tag DNA现已溶解。
   6. 将32微升CUT&Tag DNA样本加入新的PCR管，然后加入2微升dNTP混合物（每个2.5 mM）、4微升10x扩增酶缓冲液和2微升rep-B（10微米）。轻轻敲击，用移液器搅拌。
   7. 简要旋转下转，并运行以下程序以获得寡果替代²³。
      50°C，1分钟
      45°C，10分钟
      爬升至37°C，0.1°C/s
      37°C，保持
   8. 在热循环器中，向每个管子加入1微升T4 DNA聚合酶和1微升扩增酶（最终体积，40微升/样品）。用轻柔移液法搅拌。
   9. 在热循环器中以37°C继续反应30-60分钟。
      注意：如果此步骤后未进入BrdU IP（安全暂停点），DNA可在-20°C存储。
5. BrdU免疫沉淀（本质上与酵母方案相同）（2小时）
   1. 将样本转移到1.5毫升DNA低结合管中。在100°C的热块上煮5分钟，然后立即放入冰块冷却5分钟。加入15微升10x PBS，+ 1.35毫升BrdU IP缓冲液+0.5微升抗BrdU抗体+1微升大 肠杆菌 tRNA（10 mg/mL）。
   2. 在4°C的转子上摆动2小时。
   3. 将混合物转移到装有20微升蛋白G塞法罗糖珠的管子中（用1毫升BrdU IP缓冲液洗涤三次，每次3分钟）。
   4. 在4°C下孵育1小时。
   5. 在800 ×克 下旋转1分钟，并按以下方式清洗：用1毫升冷的BrdU IP缓冲液洗三次，在转子上洗3分钟;一次用1毫升TE缓冲液浸泡3分钟。
   6. 以800×克 旋转1分钟，抽取上清液。
   7. 在剩余珠子中加入100微升TE + 1% SDS缓冲液。在65°C下孵育15分钟。以800×g 旋转1分钟。
   8. 利用DNA纯化柱（BrdU IP和H3K4me3 eSPAN样本）将上清液纯化为18微升洗脱缓冲液（随试剂盒附带）。
6. PCR扩增与测序（1.5小时）
   1. 利用不同的索引组合扩增并标记单股DNA文库样本。准备PCR反应时，加入以下组分（纯化DNA[ChIP或ESPAN]，I5-指标引物[1 μL]，I7-指标引物[1 μL]，NEBNext高保真2倍PCR主混合液（2x）[10 μL]，ddH₂O至20 μL），通过移液混合样品，并短暂旋转。
   2. 将PCR混合物加热至98°C30秒，随后进行12-14个循环，每圈10秒在98°C，20秒在63°C，最后一个2分钟在72°C加热。
   3. 用18微升顺磁珠（体积0.8倍）将PCR产物纯化到20微升低EDTA缓冲液中。
   4. 利用高分辨率电泳系统测量文库浓度和片段尺寸分布。
   5. 将等量的独立库汇集，包括输入、H3K4me3 ChIP、BrdU IP 和 eSPAN 采样，并用 Illumina 测序平台进行并行对端测序。

3. eSPAN：酵母细胞数据分析（1天）

注意：此数据分析流程仅适用于酵母数据;ES单元的eSPAN数据分析可依据近期出版物²³进行。

1. 提取原始序列文件，使用Trim Galore工具修剪适配器序列，并移除小于10 bp的读段，以减少输出文件大小并避免比对程序崩溃。确保文件格式为 file1_1.fq，file1_2.fq 以实现配对读取：
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --长度 10 - 配对
2. 生成参考基因组的蝴蝶结索引文件：
   bowtie2-build genome.fa
3. 使用Bowtie 2将读段映射到对应的参考基因组（酵母的Saccharomyces基因组（sacCer3）：
   蝴蝶结2 -x 基因组 -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --局部 --无鸽尾涧 --无不和谐 --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S，1,0.50
4. 用SAMtools去除多图读取，用Sambamba 工具移除重复读取：
   Samtools 视图 -BHS - Q 40 输入.bam -o 输出.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup 输出.bam filtered.bam -r
5. 使用deeptools分别生成Watson和Crick链中每个干净bam文件中读取覆盖的主要文件：
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. 根据公式计算每个样本²⁵ 号核小体位置的平均偏置：log2，参考核小体定位后正向（Watson链）/反向（Crick链）读数分离为²⁵。用于这些计算的R脚本可在 https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias 获取。对于标准计算，请使用以下命令。
   注意：此步骤仅适用于酵母数据;ES细胞的偏置计算方法可依据近期出版物²³进行。
   脚本cal_bias。R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
7. 如有必要，通过BrdU偏置调整链偏置：
   脚本normalize_bias。R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --目标target_list --控制control_list
   注意：“matrix_files”是cal_bias生成的文件列表。用逗号分隔的R字体。例如，'file1'，'file2'，'file3'。“classes_list”是对应每个文件的示例类列表，并用逗号分隔（例如，'brdu'、'H3K4me3_eSPAN'、'H3K56ac_eSPAN'）。“condition_list”是对应每个文件的示例条件列表，并用逗号分隔。每个文件将按类别和条件配对，以调整偏见。“target_list”是从classes_list选修的课程列表。它将定义哪些类别作为需要由控件调整的数据（例如，“H3K4me3_eSPAN”、“H3K56ac_eSPAN”）。“control_list”是从课程列表中选出的课程列表。它会定义哪些类别将作为需要被控制项调整的数据。确保列表长度与target_list相同（例如，'brdu'）
8. 计算和调整后，将样本分组并制作数据可视化。
   脚本draw_bias。R -s' bias_matrix/file1.txt， bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g 群 1，群 2 --区间=T
   -s 需要由上述脚本生成的偏置文件列表
   -o 是输出文件
   -g 定义了计算的实验组，即生物复制以绘制平均偏置。
   ——区间 T 或 F，用于显示实验组内图的标准误。
   注意：关于复制起点的信息由BrdU IP数据定义。单核小体位置的信息来自之前发表的^第25篇文章。对于小鼠ES细胞数据的分析，来源信息来自OK-seq数据集²⁶，平均偏置计算应遵循前述研究²³的方案。

结果

eSPAN可用于获取关于目标蛋白的链特异性信息，如组蛋白和组蛋白修饰。在这一代表性结果中，采样和eSPAN过程按照图2所示的示意图使用出芽酵母系统进行。样本处理和采集遵循羟基脲处理的早期S期条件，遵循此方案。采用了两种酵母菌株，野生型（WT）和mcm2-3A突变株。DNA解旋酶亚基MCM2作为亲本组蛋白H3-H4的伴护者，而mcm2-3A突变体（包含3个氨基酸突变）缺乏结合亲本组蛋白H3-H4的能力^14,27。图3A展示了长度为恒定倍数的DNA片段，揭示了使用生物分析仪分析的染色质核小体阶梯图样，用于制备测序文库。通常，eSPAN文库在该协议下可产生2 nM至20 nM的浓度。在标准的eSPAN工艺中，我们还制备了带有输入和BrdU-IP的单链DNA文库，分别可作为ChIP和eSPAN文库的控制或偏置归一化。图3B

讨论

检测与领先和滞后复制链相关的蛋白质对于理解染色质复制及其相关过程非常重要，这些都直接关联到人类癌症研究和耐药机制。多种方法如二维凝胶、天然染色质免疫沉淀（nChIP）、iPOND和新生染色质捕获29,30,31，已被用于研究DNA复制及相关过程如DNA修复。此外，已开发出用于新生染色质体内定位的方法，如MINCE-Seq（带EdU和测序的体内新生染色质定位）³²和CHOR-seq（复制后染色质占有）³³，用于研究DNA复制过程中组蛋白及其他染色质结合蛋白的动态。尽管这些方法极大地推动了我们对染色质复制的理解，但没有一种能够检测到不同复制叉链上的蛋白质。eSPAN方法在复制叉处提供高分辨率、全基因组且链特异性的目标蛋白谱。

由于eSPAN本质上是连续免疫沉淀（目标蛋白C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	赛莫飞世尔科学	15575020
1.5 mL DNA 低结合管及nbsp;	埃彭多夫	22431021
10倍扩增酶缓冲液	卢西根	A1905B
10倍PBS	科宁	21-040-CV
10倍TBS	BioRad	1706435
16克 x 1又1/2英寸。BD PrecisionGlid 针头	BD生物科学	305198
ACCEL-NGS 1S加DNA库套件	集成DNA技术	10009817	ssDNA与低输入DNA文库制备套件
安捷伦2100生物分析仪及nbsp;	安捷伦	2100生物分析
安捷伦DNA 1000试剂盒及nbsp;	安捷伦	5607-1504
扩增酶	卢西根	A0110K	对甲醛处理要小心，它是易燃固体且危险的。
AMPure XP	贝克曼	A63881
AMPure XP SPRI试剂	贝克曼·库尔特	A63882
抗BrdU抗体	BD生物科学	555627
抗H3K4me3抗体	ABCAM	AB8580
自动单元计数器，型号TC10	BioRad	145-0001
巴西曲辛	西格玛	11702
巴克托·佩普托尼	赛莫飞世尔科学	211830
盐酸苯并胺	西格玛	B2417	可燃固体
BrdU	西格玛	B5002	要小心使用BrdU，因为它可能是变异剂和致畸剂。
BSA	新英格兰生物实验室	B9000S
CaCl2	西格玛	C4901
细胞培养箱及nbsp;	赛莫飞世尔科学公司;Forma II 系列水套二氧化碳培养箱模型	3140
细胞培养基及nbsp;
细胞系 ES-E14
Chelex-100	BioRad	1422842	200–400 干网尺寸
氯仿	西格玛	366919
康卡那瓦林A（ConA）涂层磁珠及nbsp;	理科	86057-10
去码托宁	米利波尔	300410-5MG
DMSO	西格玛	D8418
大肠杆菌 tRNA	西格玛	10109541001
乙醇及nbsp;	赛莫飞世尔科学	BP2818100	要小心处理乙醇，它是易燃的
葡萄糖	西格玛	G7021
甘油	西格玛	G5516
HCl	西格玛	H1758
HEPES	西格玛	H3375
异丙醇	赛莫飞世尔科学	BP26324	小心使用异丙醇，它是易燃的
KAPA HiFi HotStart 即发混音	罗什	7958889001
KCl	西格玛	P9541
KOH	西格玛	221473	小心处理 KOH，它具有腐蚀性
低速真空
磁石支架	米利波尔	LSKMAGS08
主循环梯度PCR热循环仪	埃彭多夫	5331
MgCl2	西格玛	M8266
微球菌核酸酶 （MNase）	沃辛顿	LS004798
MinElute PCR纯化试剂盒	奇根	28006
迷你珠打棒器	迷你珠击者24型破坏器	607
微型离心机及nbsp;	埃彭多夫	5424R
MnCl2	西格玛	244589
多平台震荡器	费舍尔布兰德	02-217-765
多平台摇篮孵化器	基准测试	INCU-SHAKER 10L
多热加热块及nbsp;	埃彭多夫	热混合器C
N-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸 （敲击声）	西格玛	T5130	200–400 干网尺寸
NaCl	西格玛	S9888
NaOH	西格玛	S8045	小心处理氧化钠，它具有腐蚀性
NEBNext HiFi 2×PCR主混音	新英格兰生物实验室	M0541
NP-40 伊格帕尔 CA-630	热力科学	J61055。美联社
对甲苯甲壳醛	西格玛	158127	对甲醛处理要小心，它是易燃固体且危险的。
pA-Tn5酶	阿德基因	121137
Pefabloc	西格玛	11429868001
苯-氯仿-异戊醇	Invitrogen	15593049
移液器P1000、P200、P20和P2	埃彭多夫	2231300004
PMSF	西格玛	10837091001
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片	西格玛	S8830
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片片	西格玛	S8830
蛋白质：G-塞法罗糖珠子及nbsp;	通用电气医疗	17-0618-02
蛋白质沉淀溶液	奇根	848023
蛋白质沉淀溶液	奇根	848023	小心处理 KOH，它具有腐蚀性
蛋白质沉淀溶液及nbsp;	奇根	848023
蛋白酶 K	西格玛	311584401
QIAquickPCR纯化试剂盒	奇根	28106
RNase A	西格玛	10109169001
SDS	西格玛	L3771
分光光度计	热力科学。	2000/2000c
Spermidine	西格玛	S2626
T4 DNA Pol	新英格兰生物实验室，nbsp;	M0203
桌面离心机	贝克曼·库尔特	阿莱格拉X-5
Tris	西格玛	11814273001
特里顿 X-100	西格玛	T8787
酵母提取物	赛莫飞世尔科学	212730