本文介绍了使用无创实时全身体积描记法（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本采集的标准操作流程，并概述了一些评估气道炎症的方法。
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本文内容
摘要
摘要
慢性咳嗽是指持续超过8周的咳嗽，是最常见的需就医的临床主诉之一，患者承受着巨大的社会经济负担，并伴有明显的生活质量下降。动物模型能够模拟咳嗽复杂的病理生理过程，是咳嗽研究的重要工具。检测咳嗽敏感性及气道炎症对于研究咳嗽的复杂病理机制具有重要意义。本文介绍了利用无创、实时的全身体积描记（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本（包括血液、肺、脾脏和气管）采集的规范操作流程。同时，本文还介绍了一些评估气道炎症的方法，包括苏木精-伊红（HE）染色肺和气管切片的病理学改变、支气管肺泡灌洗液（BALF）上清中总蛋白浓度、尿酸浓度和乳酸脱氢酶（LDH）活性，以及BALF中白细胞总数及分类计数。这些方法具有良好的可重复性，是研究咳嗽复杂病理生理机制的有力工具。
引言
咳嗽是一种重要的防御行为，可维持气道通畅并保护肺部免受潜在有害物质的侵害。然而，当咳嗽调节失常时，便会成为一种病理状态1。慢性咳嗽通常定义为持续八周或更长时间，是最常需要就医的症状之一2。由于慢性咳嗽常持续数年，患者承受着巨大的社会经济负担，并且生活质量显著下降3,4,5。慢性咳嗽被广泛认为是一种咳嗽高敏感性综合征，其特征是频繁由低强度的热、机械或化学刺激诱发令人困扰的咳嗽6。咳嗽高敏感性的发生与气道炎症密切相关7。然而，调控咳嗽敏感性的病理生理机制仍有待进一步阐明。
动物模型能够模拟咳嗽的复杂病理生理过程，是咳嗽研究的重要工具8,9。既往研究发现，病毒感染、肺内灌注干扰素-γ（IFN-γ）、食管内灌注盐酸、污染物暴露、香烟烟雾以及柠檬酸等均可在动物中诱导咳嗽反应10,
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方案
所有实验程序均经广州医科大学动物护理与使用委员会批准（编号：20240248），并严格遵循批准的指南进行。本研究使用雄性SPF级C57BL/6小鼠，体重为20–25 g。所有小鼠均饲养在实底笼具中，环境温度控制在（22 ± 2）°C，湿度为（50% ± 20%），光照时间为上午6:30至下午6:30，自由摄食和饮水。实验流程的时间线见图1。
1. 咳嗽小鼠模型的建立
- 使用甲型流感病毒 A/California/7/2009 (H1N1)。确定 H1N1 病毒在小鼠中的致死剂量。
- 简言之，用 2.5% 异氟烷麻醉小鼠（每组 n = 10），然后通过鼻内途径接种 10 倍系列稀释的病毒。
- 在 15 天内监测小鼠死亡情况。每日记录小鼠的存活率和体重。采用 Reed-Muench 法计算半数致死剂量（LD50）26。
注：当小鼠体重减轻达到或超过 30% 时，使用过量戊巴比妥钠实施无痛安乐死。
- 用 H1N1 病毒感染小鼠。
- 将 0.8 × LD50 的 H1N1 病毒溶解于 50 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 用 2.5....
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结果
图6展示了经HE染色的小鼠肺（图6A、B）、气管（图6C、D）和脾脏（图6E、F）中病理变化的代表性图像。H1N1病毒感染导致小鼠肺部出现炎症性改变，包括水肿以及大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。H1N1病毒感染还引起小鼠气管的炎症性改变，表现为纤毛脱落及炎性细胞浸润（大量淋巴细胞和少量中性粒细胞）。此外，感染还显著增加了小鼠脾脏中白髓区域面积与整个脾脏面积的比值。淋巴细胞在脾脏白髓中聚集。这一标准化的组织样本采集流程可更有效地评估气道炎症。
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讨论
一些慢性难治性咳嗽和感染后咳嗽是与呼吸道病毒感染相关的常见病症27。为了更好地评估咳嗽敏感性和气道炎症，本研究建立了H1N1病毒感染的小鼠咳嗽模型。其他研究应根据研究目的选择合适的小鼠咳嗽模型。以往大多数研究在咳嗽的机制研究或新药试验中采用豚鼠作为动物模型28,29,30。近期研究表明，尽管小鼠的咳嗽行为仍存在争议，但由于其繁殖周期较短、可用试剂较多且易于进行遗传操作，可能适用于咳嗽病理生理学的评估16,31。本研究使用柠檬酸作为致咳剂以诱导咳嗽。柠檬酸诱发咳嗽反射的机制可能与激活颈静脉C纤维和结状神经节Aδ纤维有关32。此外，全身体积描记（WBP）系统能够以非侵入性方式测量小鼠咳嗽反射的变化，并最大限度地减少心理应激的影响。在检测咳嗽敏感性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由广州市科技计划项目（202002030151）、广州国家实验室重大项目（GZNL2024A02001）以及呼吸疾病国家重点实验室资助（SKLRD-Z-202202）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| Buxco 小型动物全身体积描记系统 | DSI | — | |
| 无钙无镁 Hank’s 平衡盐溶液 | 碧云天 | C0219 | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| 苏木精-伊红 | 宝盛生物 | BA-4098 | |
| 肝素钠 | Alfa Aesar | A16198 | |
| 甲型流感病毒 A/California/7/2009 (H1N1) | ATCC | VR-1894 | |
| 异氟烷 | RWD | R510-22 | |
| 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A020-2-2 | |
| 生理盐水 | 广州中博生物技术 | 1234-1 | |
| 巴斯德吸管 | NEST | 318415 | |
| 戊巴比妥钠 | Merck | P3761 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 迈伦生物 | MA0015 | |
| 总蛋白检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A045-3 | |
| 尿酸检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A22181 |
参考文献
- Brooks, S. M. Perspective on the human cough reflex. Cough. 7, 10(2011).
- Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in china. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
- Zeiger, R. S., et al.
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