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检测小鼠咳嗽和气道炎症的方法

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DOI：

10.3791/67122

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2024年8月2日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Health, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory

本文内容

摘要

本文介绍了使用无创实时全身体积描记法（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本采集的标准操作流程，并概述了一些评估气道炎症的方法。

摘要

慢性咳嗽是指持续超过8周的咳嗽，是最常见的需就医的临床主诉之一，患者承受着巨大的社会经济负担，并伴有明显的生活质量下降。动物模型能够模拟咳嗽复杂的病理生理过程，是咳嗽研究的重要工具。检测咳嗽敏感性及气道炎症对于研究咳嗽的复杂病理机制具有重要意义。本文介绍了利用无创、实时的全身体积描记（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本（包括血液、肺、脾脏和气管）采集的规范操作流程。同时，本文还介绍了一些评估气道炎症的方法，包括苏木精-伊红（HE）染色肺和气管切片的病理学改变、支气管肺泡灌洗液（BALF）上清中总蛋白浓度、尿酸浓度和乳酸脱氢酶（LDH）活性，以及BALF中白细胞总数及分类计数。这些方法具有良好的可重复性，是研究咳嗽复杂病理生理机制的有力工具。

引言

咳嗽是一种重要的防御行为，可维持气道通畅并保护肺部免受潜在有害物质的侵害。然而，当咳嗽调节失常时，便会成为一种病理状态1。慢性咳嗽通常定义为持续八周或更长时间，是最常需要就医的症状之一2。由于慢性咳嗽常持续数年，患者承受着巨大的社会经济负担，并且生活质量显著下降3,4,5。慢性咳嗽被广泛认为是一种咳嗽高敏感性综合征，其特征是频繁由低强度的热、机械或化学刺激诱发令人困扰的咳嗽6。咳嗽高敏感性的发生与气道炎症密切相关7。然而，调控咳嗽敏感性的病理生理机制仍有待进一步阐明。

动物模型能够模拟咳嗽的复杂病理生理过程，是咳嗽研究的重要工具8,9。既往研究发现，病毒感染、肺内灌注干扰素-γ（IFN-γ）、食管内灌注盐酸、污染物暴露、香烟烟雾以及柠檬酸等均可在动物中诱导咳嗽反应10,11,12,13,14,15,16,17。为了更好地评估咳嗽和气道炎症，本研究采用非致死剂量的H1N1病毒建立了小鼠咳嗽模型。在咳嗽检测方面，临床上已建立了一些咳嗽测量工具，包括主观和客观方法18。用于评估咳嗽严重程度的主观评价工具主要包括视觉模拟评分、咳嗽评分以及生活质量问卷等19,20。然而，这些方法难以应用于动物咳嗽的评估。此外，咳嗽还可通过咳嗽激发试验和咳嗽频率监测进行客观评估。利用全身体积描记（WBP）系统进行的咳嗽激发试验是一种在动物研究中广泛应用的客观方法，可用于测量咳嗽敏感性并揭示咳嗽的潜在机制13,16。基于咳嗽反射的神经解剖学特征，柠檬酸、辣椒素、腺苷5'-三磷酸（ATP）、烯丙基异硫氰酸酯（AITC）以及炎症介质缓激肽等常被用作致咳剂以诱导咳嗽21,22。其中，柠檬酸是最早且应用最广泛的致咳剂之一，已被验证可用于测量咳嗽敏感性。此外，柠檬酸激发试验具有良好的安全性、可行性和耐受性，被推荐用于评估咳嗽治疗对咳嗽反射敏感性的影响23。因此，本文将描述利用非侵入性、实时的WBP系统在小鼠中测定对柠檬酸咳嗽敏感性的方法。

咳嗽病理生理学的研究需要检测样本，包括血液、支气管肺泡灌洗液（BALF）以及肺和气管组织样本，以验证关键因子水平的变化24。目前尚缺乏获取小鼠组织样本的规范化操作流程，相关研究采用的不同方法使得气道炎症的评估变得复杂。支气管肺泡灌洗是评估呼吸系统疾病中气道炎症的重要方法25。不同的支气管肺泡灌洗方法将导致相关研究之间缺乏可比性。此外，不同的支气管肺泡灌洗方法会影响BALF中的炎性细胞和炎性细胞因子。因此，本文将介绍采用非致死剂量H1N1病毒建立小鼠咳嗽模型、利用WBP系统测量咳嗽反应，以及一种可靠、安全且成功率高的小鼠支气管肺泡灌洗方法。

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方案

所有实验程序均经广州医科大学动物护理与使用委员会批准（编号：20240248），并严格遵循批准的指南进行。本研究使用雄性SPF级C57BL/6小鼠，体重为20–25 g。所有小鼠均饲养在实底笼具中，环境温度控制在（22 ± 2）°C，湿度为（50% ± 20%），光照时间为上午6:30至下午6:30，自由摄食和饮水。实验流程的时间线见图1。

1. 咳嗽小鼠模型的建立

  1. 使用甲型流感病毒 A/California/7/2009 (H1N1)。确定 H1N1 病毒在小鼠中的致死剂量。
    1. 简言之，用 2.5% 异氟烷麻醉小鼠（每组 n = 10），然后通过鼻内途径接种 10 倍系列稀释的病毒。
    2. 在 15 天内监测小鼠死亡情况。每日记录小鼠的存活率和体重。采用 Reed-Muench 法计算半数致死剂量（LD50）26。
      注：当小鼠体重减轻达到或超过 30% 时，使用过量戊巴比妥钠实施无痛安乐死。
  2. 用 H1N1 病毒感染小鼠。
    1. 将 0.8 × LD50 的 H1N1 病毒溶解于 50 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 用 2.5% 异氟烷麻醉小鼠。
    3. 当小鼠深度麻醉后，将其置于仰卧位，鼻孔朝上。
    4. 使用移液器将 5–10 µL 的 H1N1 病毒溶液或 PBS 溶液（作为对照）滴入小鼠一侧鼻腔内（图 2A）。
    5. 然后用拇指捏住小鼠的嘴部使其闭合，促使小鼠用力吸气，从而使鼻腔内的 H1N1 病毒溶液完全吸入肺部（图 2B）。
    6. 在小鼠另一侧鼻腔重复步骤 1.2.4 和 1.2.5。
    7. 当步骤 1.2.1 中配制的所有 H1N1 病毒均已被滴入小鼠肺部后，将小鼠置于仰卧位静置休息（图 2C）。
  3. 在模型建立后，使用 Buxco 小动物全身体积描记系统检测小鼠咳嗽敏感性。第 21 天时，腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg·kg-1）麻醉小鼠。采集并处理血液、脾脏、支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织和气管组织（图 1）。

2. 咳嗽敏感性测量

  1. 配制柠檬酸（0.4 M）：将 0.1537 mg 柠檬酸置于 5 mL 离心管中，加入生理盐水至终体积为 2 mL。
  2. 仪器检查
    1. 检查通道：根据制造商说明连接全身体积描记室，并点击校准按钮——校准按钮由橙色变为绿色，表示校准成功（图 3A）。
    2. 校准雾化器：
      1. 连接雾化器后，向雾化器中加入 500 µL 生理盐水，点击雾化按钮。
      2. 当雾化器中的液体完全雾化后，再次点击雾化按钮以查看雾化器功率，通常约为 0.3 mL/min。再次点击雾化按钮以确认当前雾化功率。
    3. 完成通道检查后，确保误差值小于 0.5%。
  3. 设置参数
    1. 点击 创建新研究，选择 咳嗽 选项，在“物种”中选择 小鼠，然后点击 下一步。
    2. 选择 咳嗽次数（CCnt） 参数：设定适应期持续时间为 1 分钟，反应时间为 10 分钟，雾化体积为 1 mL，给药持续时间为 10 分钟。
    3. 将清醒且未束缚的小鼠放入独立的塑料透明全身体积描记室中。输入小鼠的 体重 和 受试者编号，然后点击 下一步。
      注意：小鼠具有触壁行为，无需适应狭小空间，因此实验前无需进行适应性训练。
    4. 向雾化器中加入 1 mL 柠檬酸（0.4 M）溶液，并观察咳嗽次数（CCnt）的实时变化（图 3B）。
    5. 柠檬酸完全使用完毕后，点击 文件 和 结束会话 以完成实验。

3. 小鼠血液、脾脏、支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺和气管组织的采集（图4）

  1. 采集血液。
    1. 检测到咳嗽后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg·kg-1）对小鼠进行麻醉。从小鼠眼眶采集血液。将1 mL血液与0.1 mL抗凝缓冲液（含9.9 mg/mL肝素钠的PBS溶液）在4 °C下混合（图4A）。
      注：眼眶后采血法操作简便，可获得较大量的血液。
    2. 轻轻振荡采血管，充分混匀血液与抗凝剂，防止血液凝固。
    3. 将采集的血液在4 °C下以800 × g 离心5分钟。收集上清液，于-80 °C保存（用于细胞因子测定），并将沉淀重悬于1 mL D-Hank's溶液中。取10 µL血细胞悬液涂布于载玻片上，用于细胞形态分析。
  2. 取脾脏。
    1. 打开小鼠胸腔，采集血液，并通过动脉放血（图4B）。
    2. 剪除左心耳，随后用5 mL生理盐水灌注肺循环和体循环系统（图4C、D）。使用手术镊完整取出小鼠脾脏（图4E）。
    3. 测量脾脏重量后，将其切成两半。将其中一半在室温下用4%多聚甲醛固定，用于组织病理学分析；另一半保存于-80 °C，用于细胞因子测定。
  3. 支气管肺泡灌洗
    1. 使用巴斯德吸管制作支气管肺泡灌洗管。用酒精灯加热巴斯德吸管，待其软化后拉长形成细管。将无螺纹接头导管的导管部分粘接到细管上。支气管肺泡灌洗管长度为5 cm，上端直径为5 mm，下端直径为1 mm（图5）。
      注：该支气管肺泡灌洗管是收集BALF的有效工具。
    2. 进行BALF采集时，结扎右主支气管以分离右肺。用0.5 mL预冷的PBS对左肺进行三次灌洗，收集灌洗液。BALF回收率超过80%（图4F）。
    3. 将收集的BALF在4 °C下以800 × g 离心5分钟。收集上清液，测定总蛋白浓度、尿酸浓度、乳酸脱氢酶（LDH）活性及细胞因子浓度。
      注：BALF上清液中的炎症标志物，包括总蛋白浓度、尿酸浓度和LDH活性，均按照试剂盒说明书使用检测试剂盒进行检测24。
    4. 将沉淀重悬于200 µL PBS中，借助细胞计数板对BALF中的白细胞进行计数。
    5. 为通过分类计数确定细胞组成，取50 µL细胞悬液涂片于载玻片上，自然干燥。
    6. 用4%多聚甲醛固定载玻片过夜，然后进行苏木精-伊红（HE）染色。每张切片至少分类计数400个细胞，分为中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或嗜酸性粒细胞。
  4. 采集肺和气管组织用于组织病理学分析
    1. 完成BALF采集后，取出右肺的一半（图4G）和气管（图4H），在室温下用4%多聚甲醛固定，用于组织病理学分析。另一半组织保存于-80 °C，用于Western blot、实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。

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结果

图6展示了经HE染色的小鼠肺（图6A、B）、气管（图6C、D）和脾脏（图6E、F）中病理变化的代表性图像。H1N1病毒感染导致小鼠肺部出现炎症性改变，包括水肿以及大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。H1N1病毒感染还引起小鼠气管的炎症性改变，表现为纤毛脱落及炎性细胞浸润（大量淋巴细胞和少量中性粒细胞）。此外，感染还显著增加了小鼠脾脏中白髓区域面积与整个脾脏面积的比值。淋巴细胞在脾脏白髓中聚集。这一标准化的组织样本采集流程可更有效地评估气道炎症。

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讨论

一些慢性难治性咳嗽和感染后咳嗽是与呼吸道病毒感染相关的常见病症27。为了更好地评估咳嗽敏感性和气道炎症，本研究建立了H1N1病毒感染的小鼠咳嗽模型。其他研究应根据研究目的选择合适的小鼠咳嗽模型。以往大多数研究在咳嗽的机制研究或新药试验中采用豚鼠作为动物模型28,29,30。近期研究表明，尽管小鼠的咳嗽行为仍存在争议，但由于其繁殖周期较短、可用试剂较多且易于进行遗传操作，可能适用于咳嗽病理生理学的评估16,31。本研究使用柠檬酸作为致咳剂以诱导咳嗽。柠檬酸诱发咳嗽反射的机制可能与激活颈静脉C纤维和结状神经节Aδ纤维有关32。此外，全身体积描记（WBP）系统能够以非侵入性方式测量小鼠咳嗽反射的变化，并最大限度地减少心理应激的影响。在检测咳嗽敏感性...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由广州市科技计划项目（202002030151）、广州国家实验室重大项目（GZNL2024A02001）以及呼吸疾病国家重点实验室资助（SKLRD-Z-202202）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛 BiosharpBL539A
Buxco 小型动物全身体积描记系统 DSI—
无钙无镁 Hank’s 平衡盐溶液碧云天C0219
柠檬酸Sigma-AldrichC2404
苏木精-伊红宝盛生物BA-4098
肝素钠 Alfa AesarA16198
甲型流感病毒 A/California/7/2009 (H1N1)ATCCVR-1894
异氟烷RWDR510-22
乳酸脱氢酶检测试剂盒南京建成生物工程研究所A020-2-2
生理盐水广州中博生物技术1234-1
巴斯德吸管NEST318415
戊巴比妥钠MerckP3761
磷酸盐缓冲液 迈伦生物MA0015
总蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所A045-3
尿酸检测试剂盒赛默飞世尔科技A22181

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