微生物样品的伯格迈尔葡萄糖定量法

摘要

Bergmeyer葡萄糖定量法是一种分光光度酶法技术，主要用于临床检测，可准确且灵敏地测定葡萄糖含量。本文中，我们介绍了一种将该方法用于微生物样品的实验方案。

摘要

葡萄糖浓度是细胞代谢的关键指标，可反映总体代谢速率、葡萄糖代谢的异常情况，在某些情况下还可揭示细胞如何将葡萄糖代谢与能量代谢相偶联。此外，细胞内和细胞外的葡萄糖水平也能指示细胞的代谢状态。与微生物学中常用的二硝基水杨酸法或荧光法等技术相比，酶学方法（如Bergmeyer葡萄糖定量法）具有更高的准确性和灵敏度。尽管Bergmeyer葡萄糖定量法主要应用于临床领域，但它同样适用于任何类型的细胞，然而目前尚未见针对细菌、真菌、酵母或其他微生物的详细报道。

本文介绍了一种利用酶法Bergmeyer葡萄糖定量方法测定细菌和酵母样品中葡萄糖含量的技术。该方法包括使用葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和o-二氨基联苯胺二盐酸盐，在37 °C下孵育20分钟，随后加入硫酸。然后在545 nm波长处测定吸光度。需要特别指出的是，尽管该技术在测定高浓度葡萄糖（高于60 g/L）时存在困难，但通过稀释倍数仍可准确测定低于50 g/L的葡萄糖浓度。这种酶学方法在微生物学及其他科学研究领域具有重要的分析价值。该方法的精确性和高灵敏度使其能够有效检测微生物样品中极低浓度的葡萄糖。

引言

葡萄糖是多种微生物（包括细菌、酵母和真菌）的主要能量和碳源。这些微生物通过细胞外膜上的转运蛋白摄取葡萄糖，随后在糖酵解代谢途径中经历一系列生化反应，最终转化为丙酮酸¹。目前有多种用于定量还原糖（如葡萄糖）的技术，例如本尼迪克特试剂²、3,5-二硝基水杨酸（DNS）法^3,4、蒽酮法⁵或苯酚-硫酸法⁶。然而，这些方法会检测样品中所有存在的还原糖（如果糖和麦芽糖），这些糖可能产生信号干扰，从而影响特定糖类精确定量的准确性。

此外，这些方法需要严格的温度控制并涉及危险物质的处理，这可能会使操作过程复杂化并影响检测准确性。这些方法还可能受到样品中其他化合物的干扰，导致葡萄糖准确定量困难。相比之下，高效液相色谱法（HPLC）提供了一种更精确的替代方案，能够区分葡萄糖与其他还原糖，但其运行成本较高。这些不同的方法凸显了开发准确且经济高效的葡萄糖定量技术的持续需求⁷。

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-硫酸（GOX-H₂SO₄）法使用两种酶：葡萄糖氧....

方案

1. 溶液配制

1. 配制 100 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液。称取 1.28 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄) 和 0.1304 g 磷酸氢二钾（K₂HPO₄）并将其加入玻璃烧杯中。然后加入70 mL去离子水（H₂Odi），并使用 1 M 盐酸（HCl）或氢氧化钾（KOH）将 pH 调至 5.5。将溶液转移至容量瓶中，定容至 100 mL。随后将溶液转移至棕色容器中，并于 4-8 °C 长达3个月。
   警告：在整个制备过程中需佩戴腈类手套，以防止皮肤接触和潜在污染，因为邻联二茴香胺二盐酸盐具有潜在致癌性。
2. 制备1% w/v的溶液 o-联苯胺二盐酸盐。称取0.01 g o-联苯胺二盐酸盐，置于2.0 mL离心管中。使用1,000 μL移液器，加入1.0 mL H₂用Odi溶解该化合物，然后通过上下吹打缓慢混匀。用铝箔包裹容器以避光，并于-20 °C 以保持稳定性。
   注意：为便于在分析天平上称量时对试管进行支撑，可使用一个10 mL烧杯作为辅助支撑。这有助于稳定试管，减少因位移或倾斜而影响天平测量结果的风险，从而确保称量的准确性。
3. 在100 mL容量瓶中，先加入10 mL磷酸盐缓冲液，然后加入1 mL 1% v/v o-联茴香胺二....

结果

GOX-H₂SO₄ 的分光光度分析显示在 529 nm（λmax）处有一个单一的最大吸收峰（图 2A），并在 545 nm 处观察到额外的吸收值。通过分析不同葡萄糖浓度下的吸光度值，我们得到在 λ529 nm 处的线性相关系数（R²）为 0.9977，在 λ545 nm 处的 R² 为 0.9967（图 2B）。线性是指在特定范围内，检测结果与样品中葡萄糖浓度呈直接正比关系的能力。本研究采用决定系数来评估该线性关系，以反映在吸光度范围 0 至 1.0 内回归模型的准确性（图 2A）。

讨论

定量测定培养基中的葡萄糖对于理解微生物生长和代谢活性至关重要，因为葡萄糖是许多微生物的主要能量来源。在本研究中，我们采用GOX-H₂SO₄法准确测定培养基中的葡萄糖含量，旨在优化细菌或酵母发酵中的微生物过程。我们的研究结果与Yuen和McNeill¹¹的结果一致；然而，与他们不同的是，我们的结果表明在较高葡萄糖浓度下读数仍保持准确。实验中的一个关键步骤是在向试管中加入POD溶液后的时间控制。该步骤必须精确：若在37 °C下反应时间超过25分钟且未加入H₂SO₄，可能导致读数不准确，正如Bergmeyer⁹所指出的。因此，建议在达到所需反应时间（20分钟）后立即加入50% H₂SO₄，以确保GOX-H₂SO₄法测定结果的准确性。

采用GOX-H₂SO₄法对葡萄糖进行定量，结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	-	-
2.0 mL 微量离心管	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	碳酸钙
D-葡萄糖	Meyer	50-99-7	D-Glucose
干浴器	FisherScientific	11-718-4	型号 911NO251，模块尺寸 W×D×H mm/in：124 × 76 × 39 / 4.9 × 3.0 × 1.5
葡萄糖氧化酶	Sigma Aldrich	G6125-50KU	酶粉
H2O	-	-	去离子水
H2SO4	Meyer	7664-93-9	硫酸
HCl	Meyer	7647-01-0	盐酸
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	磷酸氢二钾
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	磷酸二氢钾
KOH	Meyer	1310-58-3	氢氧化钾
Lambda 35	PerkinElmer	-	分光光度计
微量离心管离心机	-	-	-
邻联甲苯胺二盐酸盐	Sigma Aldrich	D3252	显色剂
过氧化物酶	Sigma Aldrich	P8125-50KU	酶粉
pH 计	Hanna	1131	Hanna 1170
乙酸钠	Meyer	127-09-3	Meyer
药匙	-	-	-