微生物样品的 Bergmeyer 葡萄糖定量

Summary

Bergmeyer 葡萄糖定量是一种分光光度酶技术，主要用于准确、灵敏地测量葡萄糖量的临床测试。在此，我们提出了一种将这种方法用于微生物样品的方案。

Abstract

葡萄糖浓度是细胞代谢的关键指标，可以指示总代谢率、葡萄糖代谢的异常，以及在某些情况下，细胞如何将葡萄糖代谢与能量代谢相结合。此外，细胞内和细胞外葡萄糖水平指示细胞代谢状态。酶技术（如 Bergmeyer 葡萄糖定量）比微生物学中常用的其他技术（如二硝基水杨酸或荧光方法）更准确、更灵敏。虽然主要用于临床领域，但 Bergmeyer 葡萄糖定量也可以应用于任何细胞，但尚未详细报道细菌、真菌、酵母菌或其他微生物。

在此，我们提出了一种使用酶 Bergmeyer 葡萄糖定量方法定量细菌和酵母样品中葡萄糖的方法。该程序涉及葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和 邻联茴香胺二盐酸盐在 37 °C 下孵育 20 分钟，然后加入硫酸。然后在 545 nm 处测量吸光度。需要强调的是，尽管该技术在测量高浓度葡萄糖（高于 60 g/L）方面存在困难，但可以使用稀释因子测量低于 50 g/L 的浓度。这种酶法方法对于微生物学和其他科学领域的研究和分析很有价值。该方法的精度和灵敏度使其有助于检测微生物样品中低浓度的葡萄糖。

Introduction

葡萄糖是许多微生物（包括细菌、酵母菌和真菌）的主要能量和碳源。这些微生物通过位于细胞外膜上的转运蛋白吸收葡萄糖，葡萄糖在糖酵解代谢途径中经历一系列生化反应，转化为丙酮酸¹。有多种技术可用于定量还原糖，例如葡萄糖。例如，本尼迪克特试剂²、使用 3,5-二硝基水杨酸 （DNS）^3,4、安斯罗纳法⁵ 或苯酚硫酸⁶ 方法可以采用。然而，这些方法可以检测样品中存在的任何还原糖，例如果糖和麦芽糖，这些都会增加信号并使特定糖的准确定量复杂化。

此外，它们需要严格的温度控制和有害物质的处理，这可能会使过程复杂化并影响准确性。这些方法还会受到样品中存在的其他化合物的干扰，从而难以准确定量葡萄糖。相反，高效液相色谱 （HPLC） 提供了一种更精确的替代方案，可以区分葡萄糖和其他还原糖，尽管运营成本更高。这些对比鲜明的方法突出了开发准确且具有成本效益的葡萄糖定量技术的持续需求⁷。

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-硫酸 （GOX-H₂SO₄） 方法采用两种酶，葡萄糖氧化酶 （GOD） 和过氧化物酶 （POD）。GOD 是一种氧化还原酶，对 β-D-葡萄糖⁸ 的氧化具有很强的选择性。当葡萄糖处于氧气存在下时，该复合物在反应过程中充当催化剂，产生葡萄糖酸和过氧化氢 （H₂O₂）。H₂O₂ 通过显色氧受体 o-联茴香胺检测，在与 POD 相互作用时，导致其氧化和 H₂O₂ 释放，从而阻止葡萄糖酸转化回葡萄糖（见 图 1）。通过添加硫酸 （H₂SO₄） 来稳定获得的颜色，硫酸也会停止酶促反应，从而避免了反应继续时可能发生的干扰⁹.

图 1:使用葡萄糖氧化酶的葡萄糖定量方法概述。 它与葡萄糖反应生成过氧化氢 （H₂O₂） 和葡萄糖酸。随后，过氧化物酶在 O-联茴香胺二盐酸盐存在下与 H₂O₂ 反应。在最后一步中，加入硫酸 （H₂SO₄） 以终止酶促反应，在 529 nm 处测得粉红色。缩写: POD = 过氧化物酶;GOD = 葡萄糖氧化酶。 请单击此处查看此图的较大版本。

GOX-H₂SO₄ 酶法是一种广泛用于测量生物样品中葡萄糖浓度的技术，其中大多数生物样品具有临床意义。然而，很少有研究调查一种允许量化生长培养基中葡萄糖量以评估其消耗的技术。因此，在本方案中，提出了通过葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、 邻联茴香胺二盐酸盐和 H₂SO₄ 在微生物液体样品中进行酶促反应来定量葡萄糖的方法，这是对 Bergmeyer⁹ 所做的工作的修改，通过使用 50% （v/v） H₂SO₄ 和更少量的试剂。

Protocol

1. 溶液制备

1. 准备 100 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液。称取 1.28 克磷酸二氢钾 （KH₂PO₄） 和 0.1304 克磷酸氢二钾 （K₂HPO₄） 并将它们加入玻璃烧杯中。现在，加入 70 mL 去离子水 （H₂Odi），并使用 1 M 盐酸 （HCl） 或氢氧化钾 （KOH） 将 pH 值调节至 5.5。将溶液转移至容量瓶中，并将最终体积调节至 100 mL。然后，将溶液转移到琥珀色容器中，并将溶液在 4-8 °C 下储存长达 3 个月。
   注意:在整个制备过程中佩戴丁腈手套，以防止皮肤接触和潜在污染，因为邻联茴香胺二盐酸盐具有潜在致癌性。
2. 制备 1% w/v 的 邻联茴香胺二盐酸盐溶液。称取 0.01 g 邻联茴香胺二盐酸盐，并将其放入 2.0 mL 离心管中。使用 1,000 mL 微量移液器，加入 1.0 mL H₂Odi 以溶解化合物，然后通过上下移液缓慢混合。将容器包裹在铝箔中，并将其储存在 -20 °C 以保持稳定性，从而使溶液避光。
   注:为了在分析天平上测量时便于支撑试管，可使用 10 mL 烧杯作为额外支撑。这有助于稳定管子，通过最大限度地降低位移或倾斜的风险来确保准确测量，因为位移或倾斜可能会改变天平上获得的结果。
3. 在 100 mL 容量瓶中，加入 10 mL 磷酸盐缓冲溶液，然后加入 1 mL 1% v/v 邻联茴香胺二盐酸盐溶液。然后，用磷酸盐缓冲液将最终体积调节至 100 mL，以获得终浓度为 0.01% 邻联茴香胺-缓冲液混合物。将溶液转移到琥珀色烧瓶中，并用铝箔包裹以避光。将溶液在 4-8 °C 下储存长达 3-4 个月。
   注意:冷藏对于防止分解至关重要，因为分解可能会损害实验测量的完整性。为避免邻联苯胺-缓冲液混合物降解，可将一小部分 13 mL（足够 12 个样品）放入冰上的 14 mL 塑料管中直至使用。
4. 制备 50% H₂SO₄ 溶液。将装有 30 mL H₂Odi 的 100 mL 容量瓶放入冰浴中，冷却 10 分钟。然后，将 51 mL 的 H₂SO₄ （98% v/v） 缓慢倒入培养瓶壁，小心摇动以使溶液均质化。等待混合物冷却，因为反应是放热的（产生热量）。用 H₂Odi 将最终体积调节至 100 mL，并将溶液转移到琥珀色玻璃瓶中。
   注意: 使用通风橱并遵守所有安全规程，请务必穿戴适当的防护装备。准备 50 mL 的 40% 碳酸钙溶液，以中和可能发生的任何可能的溢出。
5. 将 0.04 g 乙酸钠溶解在烧杯中的 5 mL H₂Odi 中，制备 50 mM 乙酸钠溶液。使用冰醋酸将 pH 值调节至 5.1。最后，用 H₂Odi 将体积调节至 10 mL。

2. 酶的制备

1. 在 2.0 mL 无菌微管中，称取 0.01 g 葡萄糖氧化酶，并与 1 mL 50 mM 乙酸钠（pH 值为 5.0）混合，得到 10 mg/mL 的最终浓度。用铝箔盖住管子并储存在 -20 °C。
   注意:该溶液可在 -20 °C 下储存长达 2 个月。
2. 使用方程 （1） 计算在每个塑料比色皿（总体积为 1.5 mL）中达到所需酶活性所需的酶溶液 V₂ 体积:V₁C₁ = V₂C₂，其中 V₁ 为 1,500 μL，C₁ 为 28.5 U 酶活性，C₂（酶溶液的浓度）为 12,970 U/mL（1 mL 中 10 mg 酶 [129,000 单位/g]）H₂Odi）。
   V₂ = （1,500 μL × 28.5 U）/12,970 U = 3.29 μL （1）
   注:为了获得更准确的移液，该值可以四舍五入为 3.3 μL。
3. 在新的 2 mL 微管中，称取 0.0031 g 过氧化物酶，并加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（pH 值为 5.5），以达到 3.1 mg/mL 的最终浓度。用铝箔覆盖微管并储存在 -20 °C。
4. 使用 Eq （1） 计算每个比色皿达到所需酶活性所需的过氧化物酶溶液体积。从总比色皿体积为 1,500 μL 和靶标酶活性 1.25 U 开始。然后，鉴于其浓度为 1,551 U，确定酶溶液的必要体积。
   V₂ = （1,500 μL × 1.25 U）/1,551 U = 1.208 μL
   注:为了更准确地移液，该值四舍五入为 1.20 μL。

3. 葡萄糖标准

1. 通过在容量瓶中向 10 mL H₂Odi 中加入 0.01 g D-葡萄糖来制备 1 g/L D-葡萄糖标准品。要将浓度稀释至 0.5 g/L，取 500 μL 储备液，与 500 μL H₂Odi 混合，使最终体积达到 1 mL。
   注:此稀释过程对于创建准确的标准溶液至关重要。

4. 标准曲线准备

1. 使用新的 2 mL 微管，添加 表 1 中所示的缓冲液和葡萄糖体积。
2. 将干燥的恒温浴设置为 37 °C。 温度稳定后，向所有试管中加入 3.3 μL 葡萄糖氧化酶，然后向每个试管中加入 1.2 μL 过氧化物酶。将试管在 37 °C 下孵育 20 分钟。
3. 孵育后，立即向每个微管中加入 750 μL 50% H₂SO₄ （v/v），让混合物在冰浴中冷却 2 分钟。最终体积为 1,500 μL。最后，将溶液转移到塑料比色皿中，并测量 529 nm 处的吸光度。

表 1:GOX-H₂SO₄ 方法的葡萄糖校准曲线。 缩写: GOD = 葡萄糖氧化酶;POD = 过氧化物酶;H₂SO₄ = 硫酸。 请点击此处下载此表格。

5. 微生物样品检测

1. 通过在特定条件（包括温度、搅拌速度和孵育时间）的液体培养基中培养细菌或酵母来获得样品。一旦培养物达到所需的光密度 （OD） 或细胞浓度，收集培养物进行进一步处理。
   注: 爬行假单胞 菌以 300 rpm 和 28 °C 的恒定搅拌速度培养， 而 Debaryomyces hansenii 在 30 °C 下以 200 rpm 的搅拌速度在轨道振荡器中培养。在 D. hansenii 的特定情况下，食用菜籽油也被用作脂肪酶产生的诱导剂。
2. 根据生物安全方案，用 70% 酒精溶液或合适的清洁剂清洁工作区域。点燃燃烧器以确保无菌。
3. 使用无菌吸头将 100 μL 培养基转移到 1.5 mL 或 2 mL 微量管中。
4. 将样品在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 7 分钟，或在无温度控制的情况下以 10,000 × g 离心 7 分钟。离心后，小心去除溶液中含有葡萄糖的上清液，并丢弃沉淀。
5. 葡萄糖浓度范围为 1 至 20 g/L，使用 0.5 μL 上清液，然后与 749.5 μL 邻联茴香胺缓冲液、3.3 μL GOD 和 1.2 μL POD 混合。按照步骤 4.2 中的详细说明，在 37 °C 下孵育微管 20 分钟，然后立即加入 750 μL 的 50% H₂SO₄ ，并在冰浴中冷却 2 分钟。
   1. 对于高于 20 g/L 的浓度，在继续之前用无菌 H₂Odi 进行 1:1 稀释。
   2. 如果上清液样品之前在 -80 °C 或 -20 °C 下冷冻，请在室温下解冻并在使用前涡旋 30 秒。如果需要稀释，请使用无菌 H₂Odi。
   3. 对于葡萄糖浓度高于 30 g/L 的样品，使用无菌 H₂Odi 进行 1:1 稀释，得到稀释因子 2。
6. 在电子表格程序中使用方程 （2） 计算每个样品中的总葡萄糖浓度。
   （2）
   哪里:
   x = 葡萄糖浓度 （g/L） δ = 最终反应体积 （0.0015 L）
   y = 吸光度 M.S. = 样品用量*
   注: b 和 m 值来自对方法校准曲线趋势线进行建模的方程 （y = mx + b）。*M.S. 值必须基于用于获得相应稀释度比率的样品量（即，如果您取 0.5 μL 上清液，则 MS = 0.0000005 L = 0.5 × ^10-6 L）;如果使用稀释因子 （DF），则将获得的吸光度乘以 DF。
   例如，如果获得的吸光度为 0.5，而 DF 为 2，则结果将为 1.0。因此，y = 1.0，如前所述，该值应输入到方程 （2） 中。

6. 分析验证

1. 根据国家计量中心和墨西哥认证实体¹⁰ （CENAM-ema） 制定的标准，计算 GOX-H₂SO₄ 方法的分析验证参数。
   1. 以变异系数的百分比或 %CV = （S/x） × 100 计算精密度，其中 x 是样本组均值， S 是可接受值为 ≤10% 的标准差。
   2. 通过将标准曲线拟合到高于 0.995 的线性模型 R² 来确定线性度。
   3. 使用以下公式计算定量限 （LOQ）:LOQ = yB + 10sB，其中 yB 表示产生与目标信号等效信号的分析物浓度，10sB 表示空白标准偏差的 10 倍
   4. 使用以下方程计算系统误差:倾斜 = x - m，其中 x = 实验浓度的平均值，m 是理论浓度。
   5. 将准确度确定为实际值和理论值之间的一致性程度。
      回收率 = （CR/CV） × 100
      其中 CR 是实验浓度的平均值，CV 是理论浓度的变异系数。

7. 其他还原糖的干扰

1. 分别评估 0.5 g/L 储备液中的四种还原糖:葡萄糖、果糖、半乳糖和木糖。此外，使用海藻糖作为阴性对照。遵循所有样品的方案并测量 545 和 529 nm 处的吸光度。

Results

GOX-H₂SO₄ 的分光光度分析显示，在 529 nm 处有一个单一的最大吸光度 （λmax）（图 2A），在 545 nm 处观察到额外的吸光度值。通过分析不同葡萄糖浓度下的吸光度值，我们获得了 λ529 nm 的线性 （R²） 为 0.9977，λ545 nm 的 R² 为 0.9967（图 2B）。在给定范围内的线性是指提供与样品中的葡萄糖浓度成正比的结果的能力。这是使用决定系数进行评估的，该系数反映了回归模型（图 2A）在 0 到 1.0 的吸光度范围内的准确性。

Discussion

定量培养基中的葡萄糖对于了解微生物生长和代谢活性至关重要，因为葡萄糖是许多微生物的主要能量来源。在本研究中，我们采用 GOX-H₂SO₄ 方法准确测量培养基中的葡萄糖水平，旨在优化细菌或酵母发酵中的微生物过程。我们的研究结果与 Yuen 和 McNeill 的研究结果一致¹¹;然而，与它们不同的是，我们的研究结果表明，这些读数在较高的葡萄糖水平下是准确的。实验中的一个关键步骤是将 POD 溶液添加到试管中的时间。添加需要精确;如Bergmeyer⁹所述，如果在37 °C下反应时间超过25 min而不添加H₂SO₄，则可能导致读数不准确。因此，建议在所需时间（20 分钟）后立即添加 50% H₂SO₄，以确保通过 GOX-H₂SO₄ 方法获得的结果的准确性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量离心	Eppendorf	-	-
2.0 mL 微量离心	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	碳酸钙
D-葡萄糖	Meyer	50-99-7	D-葡萄糖
Drybath	FisherScientific	11-718-4	序列号 911NO251。块状 WxDxH mm/in： 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
葡萄糖氧化酶	Sigma Aldrich	G6125-50KU	酶粉
H2O	-	-	去离子水
H2SO4	Meyer	7664-93-9	盐酸
	Meyer	7647-01-0	盐酸
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	磷酸氢二钾
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	磷酸二氢钾
KOH	Meyer	1310-58-3	氢氧化钾
Lambda 35	PerkinElmer	-	分光光度计
微量离心管离心机	-	-	-
邻二茴香胺二盐酸盐	Sigma Aldrich	D3252	显色
过氧化物酶	Sigma Aldrich	P8125-50KU	酶粉
pH计	Hanna	1131	Hanna 1170
醋酸钠	Meyer	127-09-3	Meyer
称重刮刀	-	-	-