Bergmeyer葡萄糖定量法是一种分光光度酶法技术，主要用于临床检测，可准确且灵敏地测定葡萄糖含量。本文中，我们介绍了一种将该方法用于微生物样品的实验方案。
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摘要
摘要
葡萄糖浓度是细胞代谢的关键指标，可反映总体代谢速率、葡萄糖代谢的异常情况，在某些情况下还可揭示细胞如何将葡萄糖代谢与能量代谢相偶联。此外，细胞内和细胞外的葡萄糖水平也能指示细胞的代谢状态。与微生物学中常用的二硝基水杨酸法或荧光法等技术相比，酶学方法（如Bergmeyer葡萄糖定量法）具有更高的准确性和灵敏度。尽管Bergmeyer葡萄糖定量法主要应用于临床领域，但它同样适用于任何类型的细胞，然而目前尚未见针对细菌、真菌、酵母或其他微生物的详细报道。
本文介绍了一种利用酶法Bergmeyer葡萄糖定量方法测定细菌和酵母样品中葡萄糖含量的技术。该方法包括使用葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和o-二氨基联苯胺二盐酸盐，在37 °C下孵育20分钟，随后加入硫酸。然后在545 nm波长处测定吸光度。需要特别指出的是，尽管该技术在测定高浓度葡萄糖（高于60 g/L）时存在困难，但通过稀释倍数仍可准确测定低于50 g/L的葡萄糖浓度。这种酶学方法在微生物学及其他科学研究领域具有重要的分析价值。该方法的精确性和高灵敏度使其能够有效检测微生物样品中极低浓度的葡萄糖。
引言
葡萄糖是多种微生物（包括细菌、酵母和真菌）的主要能量和碳源。这些微生物通过细胞外膜上的转运蛋白摄取葡萄糖，随后在糖酵解代谢途径中经历一系列生化反应，最终转化为丙酮酸1。目前有多种用于定量还原糖（如葡萄糖）的技术，例如本尼迪克特试剂2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）法3,4、蒽酮法5或苯酚-硫酸法6。然而，这些方法会检测样品中所有存在的还原糖（如果糖和麦芽糖），这些糖可能产生信号干扰，从而影响特定糖类精确定量的准确性。
此外，这些方法需要严格的温度控制并涉及危险物质的处理，这可能会使操作过程复杂化并影响检测准确性。这些方法还可能受到样品中其他化合物的干扰，导致葡萄糖准确定量困难。相比之下，高效液相色谱法（HPLC）提供了一种更精确的替代方案，能够区分葡萄糖与其他还原糖，但其运行成本较高。这些不同的方法凸显了开发准确且经济高效的葡萄糖定量技术的持续需求7。
葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-硫酸（GOX-H2SO4）法使用两种酶：葡萄糖氧化酶（GOD）和过氧化物酶（POD）。GOD 是一种氧化还原酶，对 β-D-葡萄糖的氧化具有高度选择性8。该酶复合物在葡萄糖与氧气发生反应时作为催化剂，生成葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）。H2O2 通过一种显色性氧受体 o-二氨基联苯胺进行检测；当其与 POD 相互作用时，引发氧化反应并释放 H2O2，从而阻止葡萄糖酸重新转化为葡萄糖（见图1）。加入硫酸（H2SO4）可稳定所生成的颜色，同时终止酶促反应，避免因反应持续进行而可能产生的干扰9。
图 1：利用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖定量方法的示意图。 葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应生成过氧化氢（H2O2）和葡萄糖酸。随后，在过氧化物酶的作用下，H2O2 与邻苯二胺二盐酸盐发生反应。最后加入硫酸（H2SO4）以终止酶促反应，产生粉红色产物，在 529 nm 处测定吸光度。缩写：POD = 过氧化物酶；GOD = 葡萄糖氧化酶。 请点击此处查看该图的放大版本。
GOX-H2SO4 酶法是一种广泛用于测定生物样品中葡萄糖浓度的技术，这些样品大多具有临床意义。然而，很少有研究探讨可用于定量微生物培养基中葡萄糖含量以评估其消耗量的技术。因此，本实验方案介绍了一种通过葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、o-二氨基联苯胺二盐酸盐和 H2SO4 的酶促反应来定量测定微生物液体样品中葡萄糖含量的方法。该方法是在 Bergmeyer9 工作基础上的改进，采用了 50% (v/v) 的 H2SO4 以及更少的试剂用量。
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方案
1. 溶液配制
- 配制 100 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液。称取 1.28 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) 和 0.1304 g 磷酸氢二钾（K2HPO4）并将其加入玻璃烧杯中。然后加入70 mL去离子水（H2Odi），并使用 1 M 盐酸（HCl）或氢氧化钾（KOH）将 pH 调至 5.5。将溶液转移至容量瓶中，定容至 100 mL。随后将溶液转移至棕色容器中，并于 4-8 °C 长达3个月。
警告：在整个制备过程中需佩戴腈类手套，以防止皮肤接触和潜在污染，因为邻联二茴香胺二盐酸盐具有潜在致癌性。 - 制备1% w/v的溶液 o-联苯胺二盐酸盐。称取0.01 g o-联苯胺二盐酸盐，置于2.0 mL离心管中。使用1,000 μL移液器，加入1.0 mL H2用Odi溶解该化合物，然后通过上下吹打缓慢混匀。用铝箔包裹容器以避光，并于-20 °C 以保持稳定性。
注意：为便于在分析天平上称量时对试管进行支撑，可使用一个10 mL烧杯作为辅助支撑。这有助于稳定试管，减少因位移或倾斜而影响天平测量结果的风险，从而确保称量的准确性。 - 在100 mL容量瓶中，先加入10 mL磷酸盐缓冲液，然后加入1 mL 1% v/v o-联茴香胺二盐酸盐溶液。然后用磷酸盐缓冲液定容至100 mL，得到终浓度为0.01%的溶液 o-二氨基联苯胺缓冲液混合物。将溶液转移至棕色瓶中，并用铝箔包裹以避光。将溶液储存在4-8 °C 长达 3-4 个月。
注意：冷藏至关重要，可防止分解，否则可能影响实验测量结果的完整性。为避免降解 o-二氨基联苯胺缓冲液混合物，可取少量13 mL（足以用于12个样品）置于冰上14 mL塑料管中，直至使用。 - 制备50% H2SO4 溶液。取一个100 mL容量瓶，加入30 mL H2将反应液置于冰浴中，冷却10分钟。然后，缓慢加入51 mL H2SO4 （98% v/v）沿烧瓶壁加入，轻轻摇动以混匀溶液。等待混合物冷却，因为该反应为放热反应（产生热量）。用 H 调至终体积为 100 mL2吸取并转移溶液至玻璃棕色瓶中。
注意：使用通风橱并遵守所有安全规程，务必穿戴适当的防护装备。准备50 mL 40%的碳酸钙溶液，以中和可能发生的任何泄漏。 - 将0.04 g乙酸钠溶解于5 mL H₂O中，配制50 mM乙酸钠溶液2烧杯中加入 Odi。使用冰醋酸调节 pH 至 5.1。最后用 H 调至体积为 10 mL。2Odi
2. 酶的制备
- 在一支2.0 mL无菌微量离心管中，称取0.01 g葡萄糖氧化酶，加入1 mL 50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0），配制成终浓度为10 mg/mL的溶液。用铝箔纸包裹管体，并于-20 °C保存。
注意：该溶液可在-20 °C下保存长达2个月。 - 根据公式（1）计算每支塑料比色皿（总体积为1.5 mL）中达到目标酶活性所需的酶液体积V2：V1C1 = V2C2，其中V1为1,500 µL，C1为28.5 U酶活性，C2（酶液浓度）为12,970 U/mL（将10 mg酶[129,000 单位/g]溶于1 mL去离子H2O中）。
V2 = (1,500 µL × 28.5 U)/12,970 U = 3.29 µL （1）
注意：为提高移液准确性，可将该值四舍五入至3.3 µL。 - 在另一支2 mL微量离心管中，称取0.0031 g过氧化物酶，加入1 mL磷酸盐缓冲液（pH 5.5），配制成终浓度为3.1 mg/mL的溶液。用铝箔纸包裹微量离心管，并于-20 °C保存。
- 使用公式（1）计算每支比色皿中达到目标酶活性所需的过氧化物酶溶液体积。设定比色皿总体积为1,500 µL，目标酶活性为1.25 U，已知酶液浓度为1,551 U/mL，计算所需酶液体积。
V2 = (1,500 µL × 1.25 U)/1,551 U = 1.208 µL
注意：为提高移液准确性，该值已四舍五入至1.20 μL。
3. 葡萄糖标准品
- 通过将 0.01 g D-葡萄糖加入 10 mL 容量瓶中的 H2Odi 中，配制 1 g/L D-葡萄糖标准溶液。为将浓度稀释至 0.5 g/L，取 500 µL 原液并与 500 µL H2Odi 混合，最终体积为 1 mL。
注意：此稀释过程对于制备准确的标准溶液至关重要。
4. 标准曲线制备
- 使用新的 2 mL 微量离心管，加入 表 1 中指定的缓冲液和葡萄糖体积。
- 将干式恒温仪设定为 37 °C。待温度稳定后，向所有管中加入 3.3 µL 葡萄糖氧化酶，然后向每管加入 1.2 µL 过氧化物酶。在 37 °C 下孵育 20 分钟。
- 孵育结束后，立即向每支微量离心管中加入 750 µL 50% H2SO4（v/v），并在冰浴中冷却混合物 2 分钟。最终体积为 1,500 µL。最后，将溶液转移至塑料比色皿中，在 529 nm 处测定吸光度。
表1：GOX-H2SO4 法的葡萄糖标准曲线。 缩写：GOD = 葡萄糖氧化酶；POD = 辣根过氧化物酶；H2SO4 = 硫酸。请点击此处下载该表格。
5. 微生物样品检测
- 在特定条件下（包括温度、振荡速度和培养时间）于液体培养基中培养细菌或酵母以获得样品。当培养物达到预期的光密度（OD）或细胞浓度时，收集培养物以进行后续处理。
注意： Pseudomonas reptilivora 在300 rpm的恒定振荡速度下培养，并 28 °C, 而 Debaryomyces hansenii 以200 rpm的振荡速度培养于 30 °C 在轨道摇床中。在特定情况下 D. hansenii 食用菜籽油也被用作脂肪酶生产的诱导剂。 - 根据生物安全规程，使用70%酒精溶液或合适的清洁剂清洁工作区域。点燃酒精灯以确保无菌环境。
- 转移 100 µL 使用无菌吸头将培养基转移至1.5 mL或2 mL微量离心管中。
- 将样品在 7,500 × g 7 分钟 4 °C，或在 10,000 × g 7分钟，无需控温。离心后，小心移除含有溶解葡萄糖的上清液，并弃去沉淀。
- 使用 0.5 µL 上清液中葡萄糖浓度为1至20 g/L时，随后混合 749.5 µL 的 o二氨基联苯胺缓冲液, 3.3 µL 的GOD，然后 1.2 µL POD。将微量离心管在20分钟内于 37 °C，如步骤 4.2 所述，并立即加入 750 µL 50% H2SO4 并在冰浴中冷却2分钟。
- 对于浓度高于 20 g/L 的情况，用无菌 H2在继续之前进行Odi。
- 如果上清液样品先前在 -80 °C 或 -20 °C，使用前于室温下解冻并涡旋振荡30秒。若需稀释，请使用无菌H2Odi
- 对于葡萄糖浓度高于 30 g/L 的样品，用无菌 H2Odi，导致稀释倍数为2。
- 使用公式（Eq）计算每个样品中的总葡萄糖浓度2在电子表格程序中。
(2)
何处：
x = 葡萄糖浓度（g/L） δ 最终反应体积（0.0015 L）
y 吸光度 M.S. = 所用样品量*
注意：该 b 和 m 数值来源于该方法校准曲线趋势线的方程（y = mx + b）。*M.S. 值必须基于在相应稀释度下获得比值时所用样品量（即，如果你取 0.5 µL 上清液的体积，M.S. = 0.0000005 L = 0.5 × 10-6 L）；若使用稀释倍数（DF），将测得的吸光度乘以 DF。
例如，如果测得吸光度为 0.5，且稀释倍数（DF）为 2，则结果为 1.0。因此，y = 1.0，该值应代入公式（2），如先前所述。
6. 分析验证
- 根据国家计量中心和墨西哥认证实体10（CENAM-ema）的规定，计算 GOX-H2SO4 方法的分析验证参数。
- 以变异系数百分比（%CV）计算精密度：%CV = (S/x) × 100，其中 x 为样本组均值，S 为标准差，可接受值为 ≤10%。
- 通过将标准曲线拟合至线性模型，且决定系数 R2 大于 0.995 来确定线性范围。
- 使用以下公式计算定量限（LOQ）：LOQ = yB + 10sB，其中 yB 表示产生与目标信号相当信号的分析物浓度，10sB 表示空白样品标准差的 10 倍。
- 使用以下公式计算系统误差：偏倚 = x - m，其中 x 为实验浓度的平均值，m 为理论浓度。
- 将准确度定义为实测值与理论值之间的一致程度。
回收率% = (CR/CV) × 100
其中 CR 为实验浓度的平均值，CV 为理论浓度的变异系数。
7. 其他还原糖的干扰
- 分别测定四种还原糖：来自0.5 g/L储备液的葡萄糖、果糖、半乳糖和木糖。另以海藻糖作为阴性对照。对所有样品均按照方案操作，并在545 nm和529 nm处测定吸光度。
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结果
GOX-H2SO4 的分光光度分析显示在 529 nm（λmax）处有一个单一的最大吸收峰（图 2A），并在 545 nm 处观察到额外的吸收值。通过分析不同葡萄糖浓度下的吸光度值，我们得到在 λ529 nm 处的线性相关系数（R²）为 0.9977，在 λ545 nm 处的 R² 为 0.9967（图 2B）。线性是指在特定范围内，检测结果与样品中葡萄糖浓度呈直接正比关系的能力。本研究采用决定系数来评估该线性关系，以反映在吸光度范围 0 至 1.0 内回归模型的准确性（图 2A）。
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讨论
定量测定培养基中的葡萄糖对于理解微生物生长和代谢活性至关重要，因为葡萄糖是许多微生物的主要能量来源。在本研究中，我们采用GOX-H2SO4法准确测定培养基中的葡萄糖含量，旨在优化细菌或酵母发酵中的微生物过程。我们的研究结果与Yuen和McNeill11的结果一致；然而，与他们不同的是，我们的结果表明在较高葡萄糖浓度下读数仍保持准确。实验中的一个关键步骤是在向试管中加入POD溶液后的时间控制。该步骤必须精确：若在37 °C下反应时间超过25分钟且未加入H2SO4，可能导致读数不准确，正如Bergmeyer9所指出的。因此，建议在达到所需反应时间（20分钟）后立即加入50% H2SO4，以确保GOX-H2SO4法测定结果的准确性。
采用GOX-H2SO4法对葡萄糖进行定量，结...
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致谢
我们感谢以下机构的部分捐赠： 墨西哥国立理工学院 在 2023 和 2024 科学与技术发展研究项目申请征集16432.23-P y 19545.24-P）。我们感谢人文、科学与技术国家委员会（CONAHCyT) 对所获奖学金的致谢（832315号博士期间IHRH），并感谢Wendolyne Monroy-Martínez的参与与合作。 图1 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | - | - |
| 2.0 mL 微量离心管 | Eppendorf | - | - |
| CaCO3 | Meyer | 471-34-1 | 碳酸钙 |
| D-葡萄糖 | Meyer | 50-99-7 | D-Glucose |
| 干浴器 | FisherScientific | 11-718-4 | 型号 911NO251，模块尺寸 W×D×H mm/in：124 × 76 × 39 / 4.9 × 3.0 × 1.5 |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma Aldrich | G6125-50KU | 酶粉 |
| H2O | - | - | 去离子水 |
| H2SO4 | Meyer | 7664-93-9 | 硫酸 |
| HCl | Meyer | 7647-01-0 | 盐酸 |
| K2HPO4 | Meyer | 7758-11-4 | 磷酸氢二钾 |
| KH2PO4 | Meyer | 7778-77-0 | 磷酸二氢钾 |
| KOH | Meyer | 1310-58-3 | 氢氧化钾 |
| Lambda 35 | PerkinElmer | - | 分光光度计 |
| 微量离心管离心机 | - | - | - |
| 邻联甲苯胺二盐酸盐 | Sigma Aldrich | D3252 | 显色剂 |
| 过氧化物酶 | Sigma Aldrich | P8125-50KU | 酶粉 |
| pH 计 | Hanna | 1131 | Hanna 1170 |
| 乙酸钠 | Meyer | 127-09-3 | Meyer |
| 药匙 | - | - | - |
参考文献
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重印与许可
