微生物样品的 Bergmeyer 葡萄糖定量

Summary

Bergmeyer 葡萄糖定量是一种分光光度酶技术，主要用于准确、灵敏地测量葡萄糖量的临床测试。在此，我们提出了一种将这种方法用于微生物样品的方案。

Abstract

葡萄糖浓度是细胞代谢的关键指标，可以指示总代谢率、葡萄糖代谢的异常，以及在某些情况下，细胞如何将葡萄糖代谢与能量代谢相结合。此外，细胞内和细胞外葡萄糖水平指示细胞代谢状态。酶技术（如 Bergmeyer 葡萄糖定量）比微生物学中常用的其他技术（如二硝基水杨酸或荧光方法）更准确、更灵敏。虽然主要用于临床领域，但 Bergmeyer 葡萄糖定量也可以应用于任何细胞，但尚未详细报道细菌、真菌、酵母菌或其他微生物。

在此，我们提出了一种使用酶 Bergmeyer 葡萄糖定量方法定量细菌和酵母样品中葡萄糖的方法。该程序涉及葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和 邻联茴香胺二盐酸盐在 37 °C 下孵育 20 分钟，然后加入硫酸。然后在 545 nm 处测量吸光度。需要强调的是，尽管该技术在测量高浓度葡萄糖（高于 60 g/L）方面存在困难，但可以使用稀释因子测量低于 50 g/L 的浓度。这种酶法方法对于微生物学和其他科学领域的研究和分析很有价值。该方法的精度和灵敏度使其有助于检测微生物样品中低浓度的葡萄糖。

Introduction

葡萄糖是许多微生物（包括细菌、酵母菌和真菌）的主要能量和碳源。这些微生物通过位于细胞外膜上的转运蛋白吸收葡萄糖，葡萄糖在糖酵解代谢途径中经历一系列生化反应，转化为丙酮酸¹。有多种技术可用于定量还原糖，例如葡萄糖。例如，本尼迪克特试剂²、使用 3,5-二硝基水杨酸 （DNS）^3,4、安斯罗纳法⁵ 或苯酚硫酸⁶ 方法可以采用。然而，这些方法可以检测样品中存在的任何还原糖，例如果糖和麦芽糖，这些都会增加信号并使特定糖的准确定量复杂化。

此外，它们需要严格的温度控制和有害物质的处理，这可能会使过程复杂化并影响准确性。这些方法还会受到样品中存在的其他化合物的干扰，从而难以准确定量葡萄糖。相反，高效液相色谱 （HPLC） 提供了一种更精确的替代方案，可以区分葡萄糖和其他还原糖，尽管运营成本更高。这些对比鲜明的方法突出了开发准确且具有成本效益的葡萄糖定量技术的持续需求⁷。

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-硫酸 （GOX-H₂SO₄） 方法采用两种....

Protocol

1. 溶液制备

1. 准备 100 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液。称取 1.28 克磷酸二氢钾 （KH₂PO₄） 和 0.1304 克磷酸氢二钾 （K₂HPO₄） 并将它们加入玻璃烧杯中。现在，加入 70 mL 去离子水 （H₂Odi），并使用 1 M 盐酸 （HCl） 或氢氧化钾 （KOH） 将 pH 值调节至 5.5。将溶液转移至容量瓶中，并将最终体积调节至 100 mL。然后，将溶液转移到琥珀色容器中，并将溶液在 4-8 °C 下储存长达 3 个月。
   注意:在整个制备过程中佩戴丁腈手套，以防止皮肤接触和潜在污染，因为邻联茴香胺二盐酸盐具有潜在致癌性。
2. 制备 1% w/v 的 邻联茴香胺二盐酸盐溶液。称取 0.01 g 邻联茴香胺二盐酸盐，并将其放入 2.0 mL 离心管中。使用 1,000 mL 微量移液器，加入 1.0 mL H₂Odi 以溶解化合物，然后通过上下移液缓慢混合。将容器包裹在铝箔中，并将其储存在 -20 °C 以保持稳定性，从而使溶液避光。
   注:为了在分析天平上测量时便于支撑试管，可使用 10 mL 烧杯作为额外支撑。这有助于稳定管子，通过最大限度地降低位移或倾斜的风险来确保准确测量，因为位移或倾斜可能会改变天平上获得的结果。
3. 在 10....

Results

GOX-H₂SO₄ 的分光光度分析显示，在 529 nm 处有一个单一的最大吸光度 （λmax）（图 2A），在 545 nm 处观察到额外的吸光度值。通过分析不同葡萄糖浓度下的吸光度值，我们获得了 λ529 nm 的线性 （R²） 为 0.9977，λ545 nm 的 R² 为 0.9967（图 2B）。在给定范围内的线性是指提供与样品中的葡萄糖浓度成正比的结果的能力。这是使用决定系数进行评估的，该系数反映了回归模型（图 2A）在 0 到 1.0 的吸光度范围内的准确性。

Discussion

定量培养基中的葡萄糖对于了解微生物生长和代谢活性至关重要，因为葡萄糖是许多微生物的主要能量来源。在本研究中，我们采用 GOX-H₂SO₄ 方法准确测量培养基中的葡萄糖水平，旨在优化细菌或酵母发酵中的微生物过程。我们的研究结果与 Yuen 和 McNeill 的研究结果一致¹¹;然而，与它们不同的是，我们的研究结果表明，这些读数在较高的葡萄糖水平下是准确的。实验中的一个关键步骤是将 POD 溶液添加到试管中的时间。添加需要精确;如Bergmeyer⁹所述，如果在37 °C下反应时间超过25 min而不添加H₂SO₄，则可能导致读数不准确。因此，建议在所需时间（20 分钟）后立即添加 50% H₂SO₄，以确保通过 GOX-H₂SO₄ 方法获得的结果的准确性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量离心	Eppendorf	-	-
2.0 mL 微量离心	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	碳酸钙
D-葡萄糖	Meyer	50-99-7	D-葡萄糖
Drybath	FisherScientific	11-718-4	序列号 911NO251。块状 WxDxH mm/in： 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
葡萄糖氧化酶	Sigma Aldrich	G6125-50KU	酶粉
H2O	-	-	去离子水
H2SO4	Meyer	7664-93-9	盐酸
	Meyer	7647-01-0	盐酸
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	磷酸氢二钾
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	磷酸二氢钾
KOH	Meyer	1310-58-3	氢氧化钾
Lambda 35	PerkinElmer	-	分光光度计
微量离心管离心机	-	-	-
邻二茴香胺二盐酸盐	Sigma Aldrich	D3252	显色
过氧化物酶	Sigma Aldrich	P8125-50KU	酶粉
pH计	Hanna	1131	Hanna 1170
醋酸钠	Meyer	127-09-3	Meyer
称重刮刀	-	-	-