蚊子体内的微生物群落在媒介生物防控策略中具有广阔的应用前景。大多数共生微生物无法通过培养获得，因此需要进行宏基因组分析。本文介绍一种解剖雌蚊并分离卵巢、中肠和唾液腺的方法，可有效防止交叉污染，有助于在器官水平上开展微生物组研究，并加深对微生物在蚊子生物学中作用的理解。
本文内容
摘要
摘要
包括疟疾、登革热、西尼罗河热、寨卡病毒、乌苏图病毒和黄热病在内的蚊媒传播疾病全球负担持续增加，对公共卫生构成重大威胁。随着杀虫剂抗性的上升以及有效疫苗的缺乏，新的防控策略正聚焦于蚊虫的微生物群。然而，大多数共生微生物仍难以培养。因此，对蚊虫样本中细菌基因组多样性与功能的表征，依赖于宏基因组学及其后续的组装与分箱策略。从分离的器官中获取并分析宏基因组组装基因组（MAGs），可显著提供关于蚊虫相关微生物在特定器官中作用的关键信息，例如卵巢（生殖器官）、中肠（食物消化与免疫的关键部位）或唾液腺（病原体必须定植于此才能进入唾液，并在吸血过程中进入血液，因此在传播虫媒疾病中至关重要）。这些新重建的基因组可为开发新型病媒生物防控策略奠定基础。为此，必须在解剖过程中分离蚊虫器官，同时避免器官之间或与其他器官中微生物的交叉污染。本文中，我们描述了一种优化且无污染的解剖方案，用于在器官水平上研究蚊虫微生物组。
引言
蚊子传播多种致病病原体，对公共卫生构成严重威胁。由于蚊虫种群中杀虫剂抗性日益普遍，且目前尚无针对这些病原体的有效疫苗，聚焦于蚊子微生物组的新型生物防控方法正在兴起。其中，胞内细菌Wolbachia尤为突出，因其能够干扰病原体传播并操控宿主生殖1,2,3。此外，其他蚊虫共生菌在宿主的生存、发育或免疫系统，以及病原体感染与传播过程中均发挥关键作用，在防控虫媒疾病方面展现出巨大应用潜力4,5,6,7,8。
与蚊子相关的微生物涵盖了微生物生命的各个域（包括细菌、真核生物和真菌），这些微生物不仅与宿主密切相互作用，还在蚊子不同的体腔内彼此相互作用9,10。因此，更深入地了解蚊子微生物群、其潜在的季节性变化11，以及这些微生物成员在不同蚊体组织中直接相互作用的机制，有助于开发新的靶向生物防控方法或改进现有方法。然而，大多数共生微生物仍难以培养，导致无法对其进行表征。
第二代和第三代测序技术的出现，结合先进的基因组组装与分箱方法，使得重建微生物基因组成为可能，并得以探索不可培养微生物的多样性和功能潜力。本文介绍一种在防止交叉污染的前提下，对雌性蚊虫卵巢、中肠和唾液腺进行解剖的方法。该方法可用于后续的基因组DNA提取，以及进行宏条形码测序或鸟枪法宏基因组测序，从而在器官水平上研究蚊虫微生物群的多样性与功能。我们以库蚊属（Culex spp.）标本的蚊虫解剖及微生物组数据为例进行说明，但本方案亦可推广至其他属的媒介昆虫，如按蚊属（Anopheles）或伊蚊属（Aedes） 。
方案
注意：图1 展示了该方法的示意图，总结了本实验方案的各个步骤。
1. 材料准备
- 实验开始前，配制含0.5%有效氯的漂白剂溶液（世界卫生组织推荐），用于消毒仪器和工作台。
- 在900 mL水中溶解三片可溶性片剂，每片含1.5 g有效氯。等待15分钟，待片剂完全溶解，得到0.5%的漂白剂溶液。
- 将0.5%漂白剂溶液装入喷雾瓶中，喷洒至所有解剖器械表面，包括载玻片和工作台。
注意：器械和工作台应静置干燥约10分钟后再使用。
- 为防止外部细菌污染样本，在每次解剖前需用以下溶液清洗蚊虫：准备四个1.5 mL新灭菌离心管，其中两个装有96%乙醇，另两个装有1×PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水）。
- 准备蚊虫解剖后用于储存样本的离心管：四个1.5 mL无菌离心管，每管中加入100 µL保存缓冲液。
注意：每只蚊虫的唾液腺、卵巢、中肠及蚊体残骸各使用一个独立的保存管。
2. 蚊虫采集
- 采集成年雌性个体并保持其存活（来自野外或实验室，4-7天），直至进行表面灭菌。
3. 蚊虫的表面消毒
注意：在处理每个器官和个体之间，应清洁镊子和针头，并使用新的灭菌管。如果无法获得漂白剂，务必在解剖每个个体和器官之间彻底进行火焰灭菌，以防止生物材料的交叉污染。在下次使用前，解剖器械应保持干燥，不得残留任何漂白剂或乙醇。
- 为避免雌蚊在接触酒精时排空肠道内容物，将其置于冰上或-20 °C冰箱中进行冷麻醉（处理4分钟，确保组织和器官不冻结）。
- 将单只蚊虫转移至含有1 mL 96%乙醇的新灭菌1.5 mL离心管中，轻轻涡旋振荡（手动）30秒（充分摇动管内蚊虫，以去除体表鳞片及可能存在的细菌污染物）。使用含乙醇的离心管清洗两次。
- 将蚊虫转移至含有1 mL无菌1×PBS溶液的新灭菌1.5 mL离心管中，轻轻涡旋振荡（手动）30秒（防止DNA与乙醇共沉淀）。使用含无菌1×PBS的离心管清洗两次。
4. 蚊子的解剖
- 在载玻片上滴加数个小滴无菌 1x PBS，以方便放置蚊虫并冲洗解剖出的器官。
注意：无菌 PBS 滴应足够大，以容纳蚊虫器官。 - 取清洁后的蚊虫，将其置于载玻片上的一滴无菌 1x PBS 中。
- 使用灭菌镊子和针头解剖唾液腺，具体步骤如下：
- 用镊子夹住蚊虫胸部以防止其移动。然后将针头置于头部下方的颈部位置，轻轻拉扯蚊虫头部，使其与胸部分离。
注意：唾液腺位于胸部上部，通过唾液管与头部相连。在解剖过程中，切勿折断唾液管，否则当您将头部从胸部拉出时，唾液腺不会随之带出。因此，使用新鲜蚊虫（而非冷冻蚊虫）至关重要。 - 当头部与胸部分离后，观察两个唾液腺的出现，每个唾液腺由三个叶组成。在唾液管水平处剪下唾液腺，用针头取出，并将其放入新的一滴无菌 1x PBS 中进行冲洗，以防止器官间交叉污染。
- 用针头取出唾液腺，将其放入含有 100 µL 保存缓冲液的新灭菌离心管中。
- 用镊子夹住蚊虫胸部以防止其移动。然后将针头置于头部下方的颈部位置，轻轻拉扯蚊虫头部，使其与胸部分离。
- 使用灭菌镊子和针头按以下步骤解剖卵巢：
- 将蚊虫背面向上放置。用镊子夹住胸部以防止解剖过程中移动，用针头刺穿腹部第三节（从末端开始计数）。
注意：可选择性地去除蚊虫的腿和翅膀，以方便解剖。 - 在刺穿腹部第三节的同时，向下拉扯腹部以打开体腔，暴露内部器官。清除残留的蚊虫外骨骼碎片，以利于器官释放。
注意：腹部内的器官如中肠、马氏管和卵巢均可见。 - 用灭菌镊子取出两侧卵巢，将其放入载玻片上新的一滴无菌 1x PBS 中进行冲洗。随后用镊子夹取卵巢，放入含有 100 µL 保存缓冲液的 1.5 mL 离心管中。
- 将蚊虫背面向上放置。用镊子夹住胸部以防止解剖过程中移动，用针头刺穿腹部第三节（从末端开始计数）。
- 在腹部已打开且器官暴露后，使用新的灭菌镊子和/或针头取出中肠：
- 将中肠与前肠和后肠分离，然后从中肠上移除马氏管。用无菌针头夹取中肠，将其置于新的一滴无菌 1x PBS 中冲洗，以防止器官间交叉污染。
- 转移至另一滴新的无菌 1x PBS 中。用镊子打开中肠，以释放并富集细菌，具体操作见补充文件 1。用镊子夹住中肠，并用移液器将含有细菌的全部 PBS 液体转移至新的灭菌 1.5 mL 离心管中（含 100 µL 保存缓冲液），确保液体和组织均被保存。
- 再次在载玻片先前使用的位置加入 5 µL 1x PBS，并直接用移液器将 PBS 回吸至同一 1.5 mL 离心管中，以回收可能粘附在载玻片上的细菌。
- 使用无菌镊子夹取残余虫体（尸体），并将其存放在含有 100 µL 保存缓冲液的新灭菌 1.5 mL 离心管中。
- 材料保存至后续处理前：
- 在离心管上标注“物种、器官、日期、研究人员姓名”。
- 将解剖得到的卵巢、中肠、唾液腺和虫体残余在 -20 °C 下保存，直至后续处理。
- 在电子表格中记录所有样本的相关元数据，包括物种（或仅至属水平）、采集日期、国家、省份、纬度、经度、解剖人员姓名、是否为 gravid 雌虫、是否吸血。
结果
x`蚊子解剖
根据实验方案，我们从实验室种群的两只Culex pipiens molestus标本（包括一只 gravid 雌蚊）中采集并分离了卵巢、中肠、唾液腺以及残余躯体。在体视显微镜下观察，确认解剖操作干净完整：各器官完整无破损，且无残留碎片。一只Culex pipiens molestus标本的完整身体、头部与胸部，以及已解剖出的唾液腺、卵巢和中肠如图2所示。如预期所示，中肠和唾液腺的尺寸比蚊子卵巢小一个数量级。一只gravid Culex标本的卵连同其中肠和马氏管如图3所示。值得注意的是，当组织材料不够新鲜时，解剖更容易失败，组织也更易破裂（图4B、C）。因此，我们建议在采集后尽快进行解剖（最好在12小时内），此时组织仍具有弹性（图4A）。同样，也可对冷冻材料进行解剖，但由于组织脆弱，失败风险显著升高，且器官之间更易发生交叉污染（图4）。
微生物组数据
此外，我们采集并分离了三只个体的中肠和卵巢 Culex quinquefasciatus 来自新喀里多尼亚努美阿的样本，采用相同程序。我们从每个器官中提取了DNA，制备了用于全基因组测序的样品，并按照所述方法进行了微生物组数据分析 补充文件 1使用 PhyloFlash 对未组装的质量过滤短序列进行细菌分类多样性分析12 中肠与卵巢相比显示出明显不同的优势类群（图5A）。值得注意的是，卵巢细菌群落主要由 Wolbachia，此外还存在一个 螺旋体科 个体3卵巢中的菌相类型，而中肠菌群则表现出更广泛的多样性，包括γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria） 螺旋体科，以及厚壁菌门。基于相同的测序数据，我们重建了四个具有较高完整度的宏基因组组装基因组（MAGs） > 80% 和冗余 < 5%，属于螺旋体纲（Spirochaetia）以及α-和γ-变形菌纲（Alpha- and Gammaproteobacteria）表1).
正如预期，由于使用宏基因组短读长进行基因组重建存在特定局限性，本文重建的MAGs未能覆盖PhyloFlash结果所预测的全部分类多样性。分配给Wolbachia的MAG（表1中参考MAG 3）在所有卵巢以及两个中肠样本中均被检测到，且在卵巢中的覆盖度更高（图5B）。我们还在来自2号和3号Culex个体的中肠样本中重建了两个属于Enterobacteriaceae科的MAGs，包括Pantoea属（表1中参考MAG 1和2），这些MAGs在相应个体的卵巢中未被检测到（图5B）。最后，我们还重建了一个属于Spirochaetaceae科的细菌基因组，即参考MAG 4（表1），该基因组被归类于BR149属，此前Graña-Miraglia及其同事已成功从Culex pipiens的中肠中分离出该菌株13。有趣的是，该MAG在1号和3号个体的中肠以及3号个体的卵巢中均被检测到（图5B）。
图1：方法的示意图，总结了各个步骤。 材料准备、蚊虫采集、蚊虫清洗、蚊虫解剖以及储存。请点击此处查看此图的放大版本。
图2: Culex pipiens molestus 雌性 (A) 全身。 (B头部和胸部。C解剖的唾液腺. (D解剖的卵巢。 (E带有马氏管的解剖肠道。比例尺 = 500 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：吸血后雌性尖音库蚊（Culex pipiens molestus）解剖后的腹部结构。 图中显示了该标本的前肠、中肠、后肠、马尔比基氏小管及卵。红色虚线表示分离中肠与前肠和后肠时的剪切位置。比例尺 = 500 µm。缩写：F = 前肠；M = 中肠；H = 后肠；E = 卵；MT = 马尔比基氏小管。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4新鲜与冷冻组织的解剖 库蚊 蚊虫标本. 白色矩形表示A) 从新近解剖的标本中获取带有完整器官的蚊虫组织及（B，C) 解剖前经过冷冻的样本中破碎的生物材料。比例尺 = 720 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：三只 Culex quinquefasciatus 个体的微生物组分析示例。（A）通过 PhyloFlash12 提取 SSU rRNA 读段，对三个样本的中肠和卵巢中细菌多样性的可视化结果。（B）各样本中重建的宏基因组组装基因组（MAG）的平均覆盖度。缩写：MAG = 宏基因组组装基因组；Ind = 个体。请点击此处查看该图的放大版本。
| MAG | 参考MAG 4 | 参考MAG 2 | 参考MAG 1 | 参考MAG 3 |
| 长度 (bp) | 1,287,790 | 4,910,866 | 4,751,276 | 1,298,266 |
| 重叠群数量 | 9 | 162 | 149 | 123 |
| GC含量 (%) | 34.05 | 55.45 | 54.05 | 34.15 |
| 完成度 (%) | 84.5 | 97.18 | 98.59 | 91.55 |
| 冗余度 (%) | 0 | 2.82 | 4.22 | 0 |
| 域 | Bacteria | Bacteria | Bacteria | Bacteria |
| 门 | Spirochaetota | Proteobacteria | Proteobacteria | Proteobacteria |
| 纲 | Spirochaetia | Gammaproteobacteria | Gammaproteobacteria | Alphaproteobacteria |
| 目 | WRBN01 | Enterobacterales | Enterobacterales | Rickettsiales |
| 科 | WRBN01 | Enterobacteriaceae | Enterobacteriaceae | Anaplasmataceae |
| 属 | BR149 | Pantoea | - | Wolbachia |
表1：来自三个样本的重建MAGs 致倦库蚊 个体 基因组大小、片段数量、GC 含量比例、基于 Anvi'o 中可用的单拷贝核心基因集合评估的完整性及冗余度17 使用GTDB获得的分类学信息18.
补充文件1：微生物组数据分析的详细示例流程，从样品采集、DNA提取和全基因组测序开始，随后进行生物信息学流程以重建基因组并估计原核生物和真核生物序列读长的比例请点击此处下载该文件。
讨论
我们建议特别注意器官解剖的顺序，首先从唾液腺开始。事实上，我们观察到，如果保持蚊虫的完整性，从 Culex 标本的胸部中更容易提取唾液腺。若腹部或胸部受损，可能导致蚊体内部压力降低，从而影响操作。然而，也可以在胸部与腹部之间剪断，然后从头部和胸部中拉出唾液腺（A. B. Failloux，个人通讯）。此外，熟练掌握解剖技术可能具有挑战性，因此我们建议在正式实验前，先在足够数量的标本上进行练习。
以系统化方式分离蚊虫器官并避免交叉污染，对于多种下游蚊虫微生物组分析至关重要。在对单个卵巢进行解剖后，开展基因组解析的宏基因组学研究 Culex pipiens 法国南部的样本使得首个质粒的发现成为可能 Wolbachia 在 Culex pipiens (pWCP14）。采用类似方法，我们研究了pWCP的分布与频率 Culex pipiens 和 致倦库蚊 样本 来自全球大陆和岛屿地区的各种环境条件及实验室条件下。总体而言，数据揭示出一种显著保守的 Wolbachia 质粒元件在 库蚊 蚊子，表明该移动元件在内共生体生物学中具有关键作用15，需要进一步分析。
在此，我们提供了利用该系统性方法获得的蚊虫中肠和卵巢样本的微生物组分析的额外示例。我们观察到不同组织间微生物群存在明显差异（图5），其中既有共有的细菌类群，也有器官特异性的细菌类群。正如预期的那样，其存在 Wolbachia 在蚊子的卵巢和中肠中均检测到该内共生菌，但基于未组装的短序列读长，其在卵巢中的相对丰度以及宏基因组组装基因组（MAGs）的平均覆盖度均高于中肠，这与该内共生菌通过卵巢传播并随后扩散至体组织的观察结果一致。尽管本研究仅限于新喀里多尼亚的样本，但该实验方案可能有助于后续对 Wolbachia在全球范围内研究其基因组变异性，以及其在多种表型中的作用，包括对自身密度的调控和抗病毒保护。此外，本研究还展示了此处所述解剖方法如何用于检测蚊虫中肠样本中共生菌的分类多样性及其潜在功能特性。
我们获得了两个仅存在于两个中肠样本中的肠杆菌类草图基因组，证实了这两个样本在器官之间不存在污染。关于密螺旋体，在个体3的中肠和卵巢中均检测到，Juma 及其同事（2020年）观察到这些细菌存在于卵筏表面。作者认为，卵筏中发现的细菌群落可能主要通过母系遗传自卵巢，因为卵筏被保存在去离子且无菌的水中。然而，他们无法排除细菌在产卵后立即定植的可能性，并建议进一步研究卵巢微生物组16。
尽管该方案最初是针对库蚊（Culex pipiens）种团的标本设计的，但我们预计其可适用于更广泛的医学昆虫学研究群体，用于研究其他媒介昆虫，如按蚊（Anopheles）或伊蚊（Aedes）。通过在单个器官水平上操作，该方法可实现个体内部及个体间的基因组比较，从而在精细尺度上揭示共生微生物基因组的变异特征，并有望推动媒介控制策略的发展。这种唾液腺、卵巢和中肠的解剖与分离方法，能够避免微生物交叉污染，也可作为研究这三种器官内病毒感染动态的有用实验方案。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢Gilbert Legoff指导Jordan Tutagata如何从蚊子中分离唾液腺，以及Giuliano Mucci在蚊子器官照片拍摄方面提供的帮助。我们感谢Anna-Bella Failloux和Nonito Pages对本实验方案的有益讨论。 本研究由欧洲研究理事会（ERC）RosaLind启动基金“948135”资助，授予JR。 我们感谢Vectopole平台（IRD，蒙彼利埃）提供技术支持，以及对蚊子种群的饲养与维护。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96%酒精° | Fisher scientific | 10332562 | |
| 双目放大镜 | |||
| 漂白剂 | RAJA | 145517 | 150片，每片1.5 g |
| DNA建库试剂盒 | Illumina | 由MGX测序平台提供 | 曾用名：Nextera DNA Flex |
| DNA-RNA保护液（50 mL） | Zymo research | ZR1100-50 | 保存缓冲液 |
| DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | 69504 | DNA提取试剂盒 |
| 20 µL滤芯吸头 | Starlab | S1120-3810 | |
| 200 µL滤芯吸头 | Starlab | S1120-8710 | |
| 1000 µL滤芯吸头 | Starlab | S1122-1730-C | |
| 镊子 | FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Dumont #5镊子 |
| 文库定量试剂盒 | Roche | 由MGX测序平台提供 | KAPA文库定量试剂盒 |
| 2–20 µL微量移液器 | Eppendorf | 6.291704 | |
| 20–200 µL微量移液器 | Eppendorf | 6.291703 | |
| 100–1000 µL微量移液器 | Eppendorf | 7.648488 | |
| 显微镜载玻片 | Epredia | J1800BMNZ | 尺寸：75 mm × 50 mm |
| 针头 | Terumo | AN*2719R1 | |
| NGS试剂盒 | Agilent | 由MGX测序平台提供 | Fragment Analyzer Systems HS基因组DNA 50kb试剂盒 |
| NovaSeq 6000 | Illumina | 由MGX测序平台提供 | 测序仪 |
| PBS磷酸盐缓冲液（无菌） | Fisher scientific | 10212990 | |
| 永久性黑色记号笔 | |||
| 无菌Eppendorf管 | Dutscher | 33871 | 1.5 mL |
| 针头支撑架 | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1针持架，12 cm |
参考文献
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