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方法文章

小鼠中作为情感共情模型的观察性恐惧

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DOI：

10.3791/67130

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2024年11月22日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Cognition and Sociality, Institute for Basic Science (IBS), 2Department of Bio and Brain Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

本文内容

摘要

观察性恐惧范式通过检测啮齿类动物的替代性僵直行为来评估情感共情。该实验流程包括使观察者啮齿类动物接触接受厌恶足底电击的同种示范者，以诱发共情相关的僵直反应。通过采用观察性恐惧检测方法，研究人员能够探究情感共情背后的神经机制。

摘要

共情是指识别并分享他人情绪的能力，它在塑造社会互动中起着基础性作用。共情使个体能够对他人的心理状态作出反应，促进亲社会行为和社会联结的形成。观察性恐惧是情感共情的一个基本方面，指观察者目睹示范者经历厌恶刺激后，自身也表现出恐惧行为。这种由社会因素诱发的观察者间接性僵直反应，被称为情绪传染或情感共享，被认为是啮齿类动物具有类共情特征的指标。本文介绍了一种实验方案，用于评估观察者在接触接受厌恶足底电击的同种示范者时所产生的间接性僵直反应。利用啮齿类动物进行观察性恐惧检测已成为研究情感共情神经机制的广泛应用方法。鉴于观察性恐惧在哺乳动物中的普遍性，该方法进一步推动了我们对人类共情神经基础的理解。

引言

共情——识别并分享他人情感的能力——对我们的心理和社会互动至关重要1。本实验方案旨在通过观察性恐惧条件反射检测来研究啮齿类动物的情感共情，以评估观察者个体对恐惧的间接反应。共情能力具有深厚的神经生物学基础，并在进化上从啮齿类动物到人类具有连续性2。越来越多的证据表明，啮齿类动物对其社交同伴的情绪状态表现出显著的情感敏感性3，并展现出多种与共情相关的行为，包括观察性恐惧、类似安慰的异体理毛行为、疼痛的情绪传染以及亲社会帮助行为4,5,6,7,8,9。这种连续性具有重要意义，因为它使得研究人员能够利用动物模型深入探究人类共情背后的神经生物学机制10。

特别是观察性恐惧，可作为评估共情恐惧反应的一种有价值的动物行为模型，因为啮齿类动物能够通过观察同类接受厌恶刺激而间接体验恐惧4。研究表明，在人类和灵长类动物中，更强的间接恐惧反应与特质性共情水平呈正相关11,12，这表明观察性恐惧可能确实代表了情绪共情的一个基本特征2。与其他共情检测方法1,2,4,10相比，观察性恐惧条件反射的优势在于，它能够在不使观察者直接接受厌恶刺激的情况下测量情绪传染。这种方法提供了一种侵入性更小但可靠的评估情感共情的手段，适用于重复测量以及对共情相关神经环路的深入研究。

在观察性恐惧条件反射实验中，一只小鼠（观察者）通过观看另一只小鼠（示范者）接受重复的足底电击而间接地形成情境依赖性恐惧，自身并不直接经历厌恶刺激。该观察性恐惧条件反射检测采用一种双室恐惧条件反射装置，中间由透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）隔板分隔13。这种设置使一个腔室中的观察者小鼠能够清晰地看到对面腔室中的示范者小鼠。此外，气味和声音可通过金属棒构成的底部在两个腔室之间传递。在一个腔室中放置将接受足底电击这一厌恶刺激的示范者小鼠，而在另一个腔室中放置观察者小鼠，使其通过中间透明隔板观察示范者小鼠的痛苦表现。该实验范式包含两个阶段：5分钟的适应期，随后是4分钟的条件反射期。在条件反射期间，当示范者小鼠表现出对厌恶足底电击的典型反应（包括因疼痛发出的尖叫声、跳跃、奔跑和僵直）时，观察者小鼠会表现出僵直行为。这种由社会因素诱发的观察者间接僵直反应被视为情绪传染的指标，是啮齿类动物情感共情的一种基本形式。观察性恐惧检测方法在啮齿类动物中的建立，使研究人员能够探究介导情感共情的神经回路和遗传基础。

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方案

本研究所涉及的所有使用活体动物的实验程序均经基础科学研究所（IBS）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。使用10至12周龄的雄性或雌性C57BL/6J小鼠（观察者与示范者），小鼠按性别分笼饲养，每笼2至5只，饲养环境温度恒定在23–25 °C，光照周期为12小时明/12小时暗。小鼠可自由获取饲料和饮水ad libitum。实验前未对小鼠进行任何操作处理。本研究中所用试剂与设备的详细信息见《材料表》Table of Materials。

1. 观察性恐惧条件反射的准备工作

  1. 饲养条件：断奶后将同窝小鼠共同饲养（每笼2-3只）。非同窝小鼠应分笼饲养13。对于涉及配对交配的实验，准备配对笼，每笼放置1只雄性与2只雌性小鼠。将雄性和雌性共同饲养至少10周。
  2. 环境适应：在行为学测试开始前至少30分钟，将动物连同其饲养笼转移至等候区，使其适应测试环境。
    注意：实验房间的光照强度应维持在约90 lux，等候区的适应光照强度应维持在35 lux。
  3. 观察性恐惧条件反射实验设置
    1. 装置配置：组装用于观察性恐惧条件反射的装置，其高度为32.7 cm，宽度为19.1 cm，长度为37.8 cm（图1A）。
      1. 装置中央设有一个带孔（六个孔，半径为3 mm）的透明有机玻璃隔板（18 cm宽 × 32.2 cm长），将装置分为两个腔室。在每个腔室底部放置由多根不锈钢棒组成的栅格，用于传递足底电刺激。
    2. 确保观察性恐惧条件反射的实验程序包括两个阶段：5分钟的适应期，随后是4分钟的条件反射期，在条件反射期内每10秒给予示教小鼠一次持续2秒的足底电刺激（1 mA）。使用FreezeFrame软件对上述程序进行编程。
      注意：如先前所述14，确保1 mA的足底电刺激强度能够可靠地诱导示教动物产生完整的行为反应谱，包括奔跑、发声和跳跃。避免降低该刺激强度，因其可能导致示教者和观察者反应不一致。然而，若在特定实验条件下较低强度或较少次数的电刺激即可诱导示教者产生完整的行为反应，则可考虑采用较低刺激参数。
  4. 视频记录：打开摄像机，确保测试腔室完全处于画面范围内，以便后续分析。
    注意：将摄像机安装在隔音箱内，并正对动物上方位置，以确保清晰记录动物的行为表现。

2. 观察性恐惧条件反射实验流程

  1. 适应期
    1. 根据将接受厌恶性足底电击的动物，指定其中一只为观察者，另一只为示教者。
    2. 先将示教小鼠放入将施加足底电击的实验舱内，随后将观察小鼠置于由透明聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）隔板分隔的对侧舱内。
    3. 关闭实验舱门后，立即运行软件中的预设程序。
      注意：在FreezeFrame软件中输入完整实验程序，包括一个无足底电击的适应期，随后进入条件化阶段，在此阶段每10秒向示教小鼠施加一次持续2秒的足底电击，同时全程使用摄像机进行记录。
    4. 在适应期阶段，允许观察小鼠和示教小鼠在实验舱内自由活动和探索，持续5分钟。
  2. 条件化期
    1. 在适应期结束后，自动向示教小鼠施加足底电击，持续4分钟。
    2. 确保观察小鼠在条件化期间能够目睹示教小鼠的疼痛反应。
      注意：未使用镇痛药物，以保留示教小鼠对电击的疼痛反应，这些疼痛反应是诱导观察小鼠情绪状态改变所必需的社会性线索。
    3. 每次实验结束后，将示教小鼠和观察小鼠分别放入不同的暂养笼中。测试全部完成后，将每只动物放回其原饲养笼。
    4. 使用70%乙醇和纸巾清洁实验装置及底部栅格。
      注意：为消除前次实验动物遗留的嗅觉线索并保证各次实验间的一致性，每次重复实验之间必须使用消毒剂彻底清洁装置。此外，所有实验结束后还需用70%乙醇擦拭一次。

3. 旁观性冻结反应的分析

  1. 分析观察者小鼠在习惯化期和条件化期的记录行为15。
  2. 运行软件，自动检测观察者小鼠持续超过 0.75 s 的静止时段，此类时段被视为僵直。
    注意：可采用手动或自动方式分析僵直反应的评分15。

4. 随访程序

  1. 实验结束后，监测所有动物的行为和健康状况，确保其完全从各种应激因素中恢复。
  2. 测试完成后，立即为动物提供适当的饲养环境和护理，包括食物和饮水。
  3. 记录实验期间及实验后的任何行为变化，以评估条件化处理的影响。

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结果

如行为示意图（图1A）所示，实验会话开始于适应阶段（5分钟），随后进入观察性恐惧条件化阶段（4分钟）。在本实验中，观察性恐惧（OF）组中的示范小鼠在条件化阶段会接受厌恶性足底电击，而对照（Con）组中的小鼠则不接受足底电击。只有OF组中的观察小鼠目睹了示范小鼠在接受重复足底电击时表现出的痛苦反应。在条件化阶段，OF组小鼠的共情性僵直时间显著高于Con组（图1B）。OF组与Con组在条件化期间的总僵直时间（以秒计）存在明显差异（图1C）。

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讨论

本行为学实验方案中描述的情境性观察恐惧条件反射（OFC）测试，用于研究小鼠的情感共情能力4,16。为成功实施该实验范式，需仔细考虑实验条件和实际操作细节，特别是影响受试动物情绪反应的因素，包括个体间的熟悉程度、社会隔离、社会等级、先前的电击经历，以及施加于示范鼠的足底电击强度4,17,18,19,20,21,22。在OFC实验中，示范鼠对足底电击的行为反应作为社会性线索，引发观察鼠的情绪传染，表现为观察鼠出现替代性僵直反应。如先前研究所示

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由基础科学研究所（IBS）认知与社会性研究中心（IBS-R001-D2）以及韩国脑科学研究所（KBRI）基础研究计划资助，该计划由科学技术、信息通信和未来规划部通过韩国脑科学研究所（KBRI）提供资金支持（项目编号：23-BR-03-04）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
精密动物刺激器Coulbourn InstrumentsH13-15
网格地板Coulbourn InstrumentsH13-15
网格用带状电缆Coulbourn InstrumentsH93-01-25
FreezeFrameACTIMETRICSACT-100A
FreezeView 软件ACTIMETRICS
刺激器ACTIMETRICSACT-712
观察性恐惧实验箱Coulbourn Instruments高 32.7 cm × 宽 19.1 cm × 长 37.8 cm 
视频记录系统ACTIMETRICS
隔音箱
70% 乙醇广泛可得
消毒剂广泛可得
纸巾广泛可得
聚甲基丙烯酸甲酯隔板定制N/A宽 18 cm × 长 32.2 cm 
GraphPad Prism 8GraphPad Software Inc.

参考文献

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