U型水平泳动法用于制备低DNA碎片化指数的高质量精子

摘要

本方案描述了一种利用精子运动特性和触壁性筛选DNA片段化指数较低的高质量精子的方法。该方法采用U形水平泳道，使高质量精子能够穿过缓冲液滴到达对侧，而死精子、细胞碎片和杂质则被排除在外。

摘要

人类精液是一种复杂的混合物，包含前向运动的精子、非前向运动的精子、不动精子、细胞碎片以及黏稠的精浆。高质量精子是指具有正常形态且能够前向运动的精子，这类精子通常表现出较低的DNA碎片指数（DFI）和较高的受精潜能。制备高质量精子是人类辅助生殖技术中的关键步骤。传统的精子处理方法——非连续密度梯度离心法（DGC）——耗时且劳动强度大。反复离心可能损伤精子DNA，从而影响后续的受精过程及胚胎发育。本研究介绍了一种用于制备胞浆内单精子注射（ICSI）用精子的U形水平泳动（UHS）方法，该方法显著消除了离心对精子DNA造成的不利影响。  UHS方法是在ICSI操作培养皿中利用受精培养基构建一条U形泳道。在UHS泳道左侧起点处放置一个10 µL的受精培养基微滴，用于承载精液样本；在泳道左中段间隔位置再放置两个10 µL的受精培养基缓冲微滴，所有微滴之间通过受精培养基相连。随后，将培养皿覆盖以培养油，并在37 °C、6% CO₂条件下孵育过夜，以达到平衡状态。接着，将3 µL精液加入起点处的微滴中。高质量精子会自主游向UHS泳道的右侧，便于将其吸入ICSI注射针内。而死亡精子、细胞碎片及其他黏性杂质则大部分滞留在起始点或缓冲微滴中。我们同时采用UHS和DGC两种技术处理了21份精液样本，并比较了它们的DFI。结果显示，DGC组的DFI为5.5% ± 3.2%，而UHS组的DFI为1.7% ± 1.1%。两组之间的差异具有统计学意义（P < 0.05）。

引言

精液优化与精子制备技术在获得结构和功能更优越的精子细胞组分方面起着关键作用，这是人类辅助生殖技术中的重要步骤¹。精液优化的目的包括：（1）减少或去除精浆中的前列腺素、免疫活性细胞、抗精子抗体、不动的低质量精子、细菌及碎片；（2）降低或消除精液的黏稠度；（3）促进精子获能，增强受精能力。理想的精子制备技术应能回收功能良好的精子群体，保持其DNA完整性，并避免因精子和白细胞产生活性氧（ROS）而导致的功能障碍²。

目前应用最广泛的精子制备技术是密度梯度离心法（DGC）。该方法的优点是回收率高³，且易于标准化。在实际应用中，可根据样本质量灵活选择双层密度梯度法⁴、微型DGC法或单层梯度离心法⁵。该方法可用于制备活力良好、不含细胞碎片、污染的白细胞、非生殖细胞及退化生殖细胞的高质量精子。然而，该方法的缺点是需要进行离心操作，可能导致精子DNA损伤⁶。

本文所述方法改编自Baldini等人的原始研究⁷，该研究主要关注注射皿中精子的水平迁移。该改良方法采用U形水平通道，用于分离具有较强活力的高质量精子。....

方案

本研究经南京医科大学附属淮安第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号：KY-2024-181-01）。已获得提供样本患者的知情同意。实验操作应由经验丰富的人员依照良好实验室规范和临床指南进行。^11,12所用试剂与设备的详细信息见下文 材料表.

1. ICSI 操作皿的准备

1. 使用 20 µL 受精培养基在 ICSI 操作皿中制作 U 形轨迹（图 1）。U 形轨迹左侧轨道长度应约为 30 mm，右侧轨道长度也应约为 30 mm。
2. 用移液器吸取 10 µL 受精培养基，在 U 形轨迹左侧起点处制作一个圆形液滴。将其与 U 形轨迹左侧起点连接，用于添加精液储备液。
3. 在 UHS 通道左侧中段间隔制作两个 10 µL 的受精培养基缓冲液滴。用受精培养基将所有液滴连接起来。
4. 在 U 形通道右侧使用 2.5 µL 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制作一条细长的液滴带。确保 PVP 条带与 U 形通道右侧轨道平行。
5. 在 PVP 条带右侧使用卵母细胞处理培养基制作六个微滴，每滴 20 µL。
6. 向培养皿中加入 7 mL 培养油，确保油层覆盖所有....

结果

采用上游泳法（UHS）和密度梯度离心法（DGC）对21份样本进行处理优化，并比较两种方法之间的精子DNA碎片率。在ICSI培养皿中使用UHS泳道的方法可替代可能对精子造成损伤的DGC法。具有优良前向运动能力的高质量精子可沿U形泳道边缘顺畅游动（图2），更便于ICSI针逐一捕获。利用UHS泳道分离出的高质量精子具有更低的DNA碎片指数（DFI）（图3）。

为获得图3中所示数据，采用精子染色质扩散（SCD）法检测经密度梯度离心（DGC）和上游法（UHS）分离的高质量精子的精子DNA碎片指数（DFI）。结果显示，经DGC法分离的高质量精子DFI高达5.5% ± 3.2%，而经UHS法分离的高质量精子DFI为1.7% ± 1.1%（P < 0.05）（表1）。

讨论

采用本文所述UHS方法分离高质量精子的关键步骤是建立含有缓冲液滴的UHS泳道。UHS泳道和缓冲液滴均使用洗涤后获得的精液制备。UHS泳道可引导高质量精子自由游动并沿泳道边缘富集，便于收集。缓冲液滴可降低精液黏度，滤除死精子、细胞碎片及其他杂质。UHS泳道右侧与平行的PVP条带之间的距离应尽量缩小，以减少ICSI针全程移动所需时间。

与不连续密度梯度法相比，UHS泳道法涉及的实验人员手工操作步骤更少，有助于降低其劳动强度。通过UHS泳道法获得的高质量精子无需经历反复的离心过程，因而DNA碎片指数（DFI）更低。这更有利于受精、妊娠结局以及子代安全¹³。

本方案的主要局限性在于其高度依赖高质量精子的自主游动能力。该方法不适用于精子完全不活动的患者。在极重度弱精子症或极重度少精子症的情况下，能够游向正确通道的高质量精子数量较少，寻找高质量精子的时间可能会延长。有时可能需要从左侧通道或缓冲液滴中寻找高质量精子。这些区域中的死亡精子、细胞碎片以及黏性杂质可能导致ICSI针头堵塞，从而延长整.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7% 聚乙烯吡咯烷酮溶液	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
吸液器	LABOTECT	-	Aspirator
生物洁净工作台	Suzhou Antai	-	Biological clean workbench
囊胚培养液	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
卵裂期培养液	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 培养箱	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
培养用油	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
一次性塑料移液管	BD Falcon	357575	disposable plastic transfer pipette
受精培养液	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI 操作皿	BD Falcon	351006	培养皿
即用型透明质酸酶	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
倒置显微镜	NIKON	-	Inverted microscope
体外受精工作站	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler 计数板	Sefi Medical Instruments		Makler counting chamber
显微操作系统	NIKON	-	Micro operating system
卵母细胞处理液	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
光学显微镜	OLYMPUS	-	Optical microscope
相差显微镜	NIKON	-	Phase contrast microscope
精子计数板	Markler	-	Sperm Counting Board
精子梯度分离液	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
精子核DNA完整性检测试剂盒	Shenzhen HuaKang	-	Sperm Nucleus DNA Integrity Kit (SCD)
体视显微镜	NIKON	-	Stereoscopic microscope
台式离心机	HETTICH	-	Tabletop centrifuge
恒温试管架	GRANT	-	Thermostatic test tube rack
三气培养箱	ASTEC	-	Tri-gas incubator