U型水平泳动法用于制备低DNA碎片化指数的高质量精子

摘要

本方案描述了一种利用精子运动特性和触壁性筛选DNA片段化指数较低的高质量精子的方法。该方法采用U形水平泳道，使高质量精子能够穿过缓冲液滴到达对侧，而死精子、细胞碎片和杂质则被排除在外。

摘要

人类精液是一种复杂的混合物，包含前向运动的精子、非前向运动的精子、不动精子、细胞碎片以及黏稠的精浆。高质量精子是指具有正常形态且能够前向运动的精子，这类精子通常表现出较低的DNA碎片指数（DFI）和较高的受精潜能。制备高质量精子是人类辅助生殖技术中的关键步骤。传统的精子处理方法——非连续密度梯度离心法（DGC）——耗时且劳动强度大。反复离心可能损伤精子DNA，从而影响后续的受精过程及胚胎发育。本研究介绍了一种用于制备胞浆内单精子注射（ICSI）用精子的U形水平泳动（UHS）方法，该方法显著消除了离心对精子DNA造成的不利影响。  UHS方法是在ICSI操作培养皿中利用受精培养基构建一条U形泳道。在UHS泳道左侧起点处放置一个10 µL的受精培养基微滴，用于承载精液样本；在泳道左中段间隔位置再放置两个10 µL的受精培养基缓冲微滴，所有微滴之间通过受精培养基相连。随后，将培养皿覆盖以培养油，并在37 °C、6% CO₂条件下孵育过夜，以达到平衡状态。接着，将3 µL精液加入起点处的微滴中。高质量精子会自主游向UHS泳道的右侧，便于将其吸入ICSI注射针内。而死亡精子、细胞碎片及其他黏性杂质则大部分滞留在起始点或缓冲微滴中。我们同时采用UHS和DGC两种技术处理了21份精液样本，并比较了它们的DFI。结果显示，DGC组的DFI为5.5% ± 3.2%，而UHS组的DFI为1.7% ± 1.1%。两组之间的差异具有统计学意义（P < 0.05）。

引言

精液优化与精子制备技术在获得结构和功能更优越的精子细胞组分方面起着关键作用，这是人类辅助生殖技术中的重要步骤¹。精液优化的目的包括：（1）减少或去除精浆中的前列腺素、免疫活性细胞、抗精子抗体、不动的低质量精子、细菌及碎片；（2）降低或消除精液的黏稠度；（3）促进精子获能，增强受精能力。理想的精子制备技术应能回收功能良好的精子群体，保持其DNA完整性，并避免因精子和白细胞产生活性氧（ROS）而导致的功能障碍²。

目前应用最广泛的精子制备技术是密度梯度离心法（DGC）。该方法的优点是回收率高³，且易于标准化。在实际应用中，可根据样本质量灵活选择双层密度梯度法⁴、微型DGC法或单层梯度离心法⁵。该方法可用于制备活力良好、不含细胞碎片、污染的白细胞、非生殖细胞及退化生殖细胞的高质量精子。然而，该方法的缺点是需要进行离心操作，可能导致精子DNA损伤⁶。

本文所述方法改编自Baldini等人的原始研究⁷，该研究主要关注注射皿中精子的水平迁移。该改良方法采用U形水平通道，用于分离具有较强活力的高质量精子。该方法避免了离心导致的DNA损伤，并在卵胞浆内单精子注射（ICSI）过程中最大限度地减少了死精子、细胞碎片及其他黏性杂质的影响。

该特定方法涉及使用受精培养基在ICSI操作皿中创建一条UHS通道。在UHS通道左侧起点处放置一个10 µL的受精培养基微滴，用于承载精液。在UHS通道左中段等间距位置再放置两个10 µL的受精培养基缓冲液滴，所有液滴均通过受精培养基相连。将装置覆盖培养油后，于37 °C、6% CO₂条件下过夜孵育，以达到平衡。随后，将3 µL精液加入UHS通道左侧起点的微滴中。高质量的精子会游向UHS通道右侧的轨道区域，便于使用ICSI注射针进行收集。而死亡精子、细胞碎片及其他黏性杂质则主要停留在原始位置或缓冲液滴中。

微流控芯片模拟了女性生殖道中的自然选择过程，能够在无需离心的条件下从精液中有效分离出高质量的精子。这对于提高精子活力⁸、降低精子DNA碎片率⁹以及改善妊娠结局¹⁰具有重要意义。然而，此类装置的制备过程复杂、成本较高，且难以广泛推广应用。

本文所述方案提供了一种新颖、简单且可行的替代方法。该方法利用精子的运动特性，获得的结果可与微流控技术相媲美。所获得的精子具有较强的活力、较低的DNA碎片率，非常适合用于卵胞浆内单精子注射（ICSI）。

方案

本研究经南京医科大学附属淮安第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号：KY-2024-181-01）。已获得提供样本患者的知情同意。实验操作应由经验丰富的人员依照良好实验室规范和临床指南进行。^11,12所用试剂与设备的详细信息见下文 材料表.

1. ICSI 操作皿的准备

1. 使用 20 µL 受精培养基在 ICSI 操作皿中制作 U 形轨迹（图 1）。U 形轨迹左侧轨道长度应约为 30 mm，右侧轨道长度也应约为 30 mm。
2. 用移液器吸取 10 µL 受精培养基，在 U 形轨迹左侧起点处制作一个圆形液滴。将其与 U 形轨迹左侧起点连接，用于添加精液储备液。
3. 在 UHS 通道左侧中段间隔制作两个 10 µL 的受精培养基缓冲液滴。用受精培养基将所有液滴连接起来。
4. 在 U 形通道右侧使用 2.5 µL 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制作一条细长的液滴带。确保 PVP 条带与 U 形通道右侧轨道平行。
5. 在 PVP 条带右侧使用卵母细胞处理培养基制作六个微滴，每滴 20 µL。
6. 向培养皿中加入 7 mL 培养油，确保油层覆盖所有液滴的最高点。将其置于 37 °C、6% CO₂ 培养箱中过夜平衡。

2. 精液样本采集

1. 向患者提供关于精液样本采集的清晰书面和口头指导。确保样本采集完整，并指导患者在采集前3至7天内避免射精。
2. 采集精液 通过 使用一次性、无菌且无毒的专用精子采集杯进行手淫取精。确保收集全部精液，并告知受试者如有任何部分样本丢失需立即报告。
3. 核对患者配偶的姓名、有效身份证件及指纹。在精子采集杯的杯体和杯盖上标注患者配偶的姓名和病历号。
4. 男性患者采集精液后，工作人员应与患者面对面交接标本。取少量精液样本进行包装和保存。确保患者在包装区域签字确认。
5. 将包封的样本编号并储存2年。在精液处理记录本中记录患者信息、编号以及接收人和见证人的签名。
6. 若生殖中心任何工作人员发现患者身份可疑，应停止接收标本并重新核对患者身份。不得同时接收两个或以上标本。若怀疑标本存在混淆，应停止接收。

3. 精液标本分析

1. 观察精液标本的颜色。
   注意：正常精液在液化后呈均匀的灰白色。精子浓度极低的精液可能呈透明状。若存在红细胞，精液可能呈红褐色。若患者有黄疸或服用某些维生素，精液可能呈黄色。
2. 采用称重法测量精液体积，精确至0.1 mL。
3. 将精液样本置于37 °C环境中15-30分钟。用大孔径（直径约1.5 mm）一次性塑料移液管吸取精液，让其自然滴落，观察是否有拉丝现象。
   注意：正常液化的精液形成细小、分散的液滴。若黏度异常，液滴可形成超过2 cm的细丝。
4. 若精液在60分钟内仍未完全液化，加入等量的受精培养液，然后使用一次性塑料移液管反复吹吸混合液，直至完全液化。
5. 使用精密pH试纸（pH 6.0-10.0）测定精液的pH值。
6. 取10 µL充分液化的精液，滴加至Makler计数板上。在光学显微镜200倍视野下评估精子活动力，并观察是否存在精子凝集及非精子细胞。
7. 在光学显微镜200倍视野下评估精子浓度。

4. 拾取卵母细胞

1. 在取卵前一天准备取卵用培养皿（OPD）。向一个无菌的35 mm培养皿中加入2.5 mL卵母细胞处理液，然后加入1.5 mL油，并将培养皿置于37 °C培养箱中过夜平衡。
2. 在取卵前一天准备两个卵母细胞培养皿（OCD）。向无菌中心井培养皿的内圈加入1 mL受精培养液，然后加入1 mL油；在外圈加入4 mL受精培养液。将培养皿置于37 °C、6% CO₂的培养箱中过夜平衡。
3. 在取卵前30分钟打开所有加热器和加热板，并测量温度。
4. 使用手部消毒剂洗手，并用流动水彻底冲洗。佩戴清洁、无菌且无尘的手套。
5. 将无菌培养皿放置在37 °C加热平台上预热。
6. 在取卵前严格核对患者身份。
7. 通过负压将卵泡液吸入无菌试管中，然后立即交予实验室胚胎学家。
8. 将所有卵泡液倒入无菌培养皿中，在低倍体视显微镜下寻找卵母细胞-冠状-累积复合体（OCCCs）。使用移液器拾取OCCCs，并将其放入OPD中，在37 °C下临时保存。
9. 记录卵泡液的量、颜色、卵泡数量以及OCCCs的数量。
10. 取卵后，使用无菌巴斯德移液器将OCCCs转移至OCD中。迅速放入培养箱（37 °C、6% CO₂、5% O₂、饱和湿度）中培养2小时。
11. 准备一个四孔培养皿，在第一孔中加入0.5 mL透明质酸酶溶液，其余三孔每孔加入1 mL卵母细胞处理液。在37 °C下孵育1小时。
12. 使用巴斯德移液器将第4.10步中的OCCCs转移至含透明质酸酶的孔中，作用30秒。然后将OCCCs转移至含卵母细胞处理液的孔中。
13. 使用直径为150 µm的卵母细胞剥离管吹打并吸取OCCCs，以去除颗粒细胞。然后使用新的巴斯德移液器将卵母细胞转移至卵母细胞处理液中进行洗涤。将其转移至另一个预先平衡的OCD中，并置于37 °C、6% CO₂的培养箱中。

5. 精子筛选与ICSI操作

1. 将5 µL精液加入ICSI操作皿U形轨道左侧起点处的受精培养基微滴中，该微滴已在步骤1.1至1.6中制备完成。
2. 将ICSI操作皿置于37 °C、6% CO₂的培养箱中孵育30–60分钟。
3. 打开倒置显微镜、显微镜操作系统及载物台加热装置，确保所有操作控制恢复至原始可调范围，以实现平稳舒适的操作。
4. 将ICSI注射针安装至针夹中，将针夹固定在显微操作仪上，在4倍物镜下调整持卵针与注射针，并依次调节其角度与位置，使两根针相对于载物台彼此平行。在×20物镜下检查操作针的移动范围。
5. 在4倍物镜下调节持卵针与注射针的角度和位置，使两针针尖相对于载物台彼此平行。前后左右移动操作针，在10倍和20倍物镜下检查操作针的移动范围。
6. 抬高持卵针与注射针，确保操作台与加热台之间的高度允许操作容器轻松放置，且不接触操作针。
7. 经双重核对后，将步骤4.12中选出的卵母细胞逐个转移至ICSI操作皿中的卵母细胞处理培养基微滴中，每滴一枚卵母细胞。
8. 将含有卵母细胞的操作皿放置于已准备好的显微镜操作台加热载物台上。
9. 在10倍物镜下调节显微镜焦距，使操作皿内微滴边缘清晰可见。
10. 将注射针插入ICSI操作皿的PVP条带中，调节显微镜使注射针清晰可见，同时吸入少量PVP至注射针内。
11. 将注射针移至U形轨道右侧长条区域，挑选形态良好、前向运动能力强的优质精子进行捕获。
12. 将捕获的精子转移至右侧PVP条带底部，并置于操作皿底部位置。
13. 轻压精子尾部中段或下段处的注射针，迅速向后拉动注射针，划破精子使其停止运动。
14. 将精子从尾部至头部吸入注射针内。
15. 将注射针转移至右侧含有卵母细胞的卵母细胞处理培养基微滴中。
16. 降低持卵针，轻轻移动卵母细胞，使第一极体位于12点钟位置，并固定卵母细胞。
17. 调节显微操作针与卵母细胞膜处于同一水平面，将精子推至注射针尖端。
18. 在卵母细胞3点钟位置垂直穿透透明带，继续进针直至到达卵母细胞中心或略超过中心位置，随后轻微回撤注射针。
    注意：当细胞质和精子发生快速回流时，表明卵母细胞膜已破裂，吸液动作应立即停止。
19. 缓慢将精子注入卵母细胞胞质中，随后退出注射针。精子注入胞质的深度应约为卵母细胞直径的50%–75%。
20. 退出注射针后，调节持卵针的负压以释放卵母细胞。
21. 重复上述步骤，直至所有成熟卵母细胞完成注射。
22. 将ICSI培养皿从显微镜加热台转移至解剖显微镜下。
23. 从培养箱中取出卵裂期培养皿。
24. 将已注射精子的卵母细胞转移至卵裂期培养皿中的微滴内。
25. 将卵裂期培养皿重新放回37 °C、6% CO₂、5% O₂的培养箱中继续培养。

6. 采用DGC方法制备精子

1. 向一支15 mL无菌锥底离心管中加入1.5 mL 45%密度梯度离心溶液。
2. 缓慢将1.5 mL 90%密度梯度离心液加至45%密度梯度离心液底部，保持两液体间的界面清晰。
3. 轻柔地将液化精液加至梯度离心液上层，并在300 x g条件下离心 g 15分钟（室温）。
4. 移除上清液，将约0.5 mL的剩余精子沉淀加入3 mL受精培养基中，吹打混匀。
5. 在室温下以 200 x 离心 g 5 分钟。
6. 用移液器吸走上清液，留下约0.2 mL的沉淀。
7. 加入适量受精培养液重悬沉淀，计数精子浓度和活力，并记录。置于37°C、6% CO2培养箱中备用。

7. 精子核DNA完整性的检测（精子染色质扩散法，SCD）

1. 实验前将室内温度调节至20-28 °C。取出试剂盒，于室温下平衡30-60分钟。
2. 配制变性液：取0.8 mL浓缩变性液，加入100 mL蒸馏水中，混匀。
3. 配制70%乙醇溶液：取26.65 mL蒸馏水与70.35 mL无水乙醇，配制成70%乙醇溶液。
4. 配制90%乙醇溶液：取9.55 mL蒸馏水与90.45 mL无水乙醇，配制成90%乙醇溶液。
5. 将低熔点琼脂糖管（含25 µL低熔点琼脂糖溶液）置于90-100 °C水浴中加热1-2分钟，直至琼脂糖完全融化。随后将管子放入37 °C水浴中保温5分钟，使温度恒定。
6. 取优化处理前的精液3-10 µL及优化处理后的精子悬液，分别加入不同的低熔点琼脂糖管中，充分混匀。
7. 取30 µL含精子的低熔点琼脂糖悬液，水平滴加至预处理过的载玻片上。
8. 轻轻盖上盖玻片（尺寸为22 mm × 11 mm），尽量避免产生气泡。
9. 将预处理过的载玻片水平置于2-8 °C冰箱中冷却4分钟，整个过程保持水平状态。取出载玻片后，轻轻滑动移除盖玻片。
10. 迅速将预处理过的载玻片浸入变性液中，反应7分钟。
11. 取出预处理过的载玻片，浸入蒸馏水中5秒。
12. 取出预处理过的载玻片并竖直放置，用滤纸吸去玻片表面水滴，避免接触标本区域。
13. 将预处理过的载玻片浸入裂解缓冲液中，准确反应20分钟。
14. 将预处理过的片段浸入洗涤液中3分钟，以洗去裂解液。
15. 取出预处理过的载玻片，浸入70%乙醇溶液中2分钟。
16. 取出预处理过的载玻片，浸入90%乙醇溶液中2分钟。
17. 取出预处理过的载玻片，浸入无水乙醇溶液中2分钟。
18. 取出预处理过的载玻片，自然晾干。
19. 在棕色空瓶中按1:1比例配制Wright染色液A与B。
20. 将预处理过的载玻片水平放置，加入混合染液，确保染液覆盖整个玻片表面（约0.5-1 mL染液）。
21. 染色5分钟后，用蒸馏水轻轻冲洗染色后的载玻片10-15次，去除多余染剂。
22. 让载玻片自然干燥，在光学显微镜下以400×观察。计数超过200个精子，确定具有小晕环、无晕环及退变形态的异常精子所占百分比。

8. 统计分析

1. 使用商业软件进行统计分析。
2. 采用Friedman检验比较原始精液、DGC和UHS之间的DFI（%）。
   注意：对于两种方法之间的两两比较，使用Wilcoxon符号秩检验。将p值≤0.05视为具有统计学意义。

结果

采用上游泳（UHS）和密度梯度离心（DGC）方法对21个样本进行优化处理，并比较两种方法之间的精子DNA碎片化指数。使用ICSI培养皿中的UHS通道法可替代可能对精子造成损伤的DGC法。高质量且前向运动能力良好的精子可沿U形通道边缘顺畅游动（图2），更便于ICSI针逐一捕获。利用UHS通道分离出的高质量精子具有更低的DFI（图3）。

为获得图3中所示数据，采用精子染色质扩散（SCD）法检测了经密度梯度离心法（DGC）和上游法（UHS）分离的高质量精子的精子DNA碎片指数（DFI）。结果显示，经DGC法分离的高质量精子DFI高达5.5% ± 3.2%，而经UHS法分离的高质量精子DFI为1.7% ± 1.1%（P < 0.05）（表1）。

讨论

采用本文所述UHS方法分离高质量精子的关键步骤是建立含有缓冲液滴的UHS泳道。UHS泳道和缓冲液滴均使用洗涤后获得的精液制备。UHS泳道可引导高质量精子自由游动并沿泳道边缘富集，便于收集。缓冲液滴可降低精液黏度，滤除死精子、细胞碎片及其他杂质。UHS泳道右侧与平行的PVP条带之间的距离应尽量缩小，以减少ICSI针全程移动所需时间。

与不连续密度梯度法相比，UHS泳道法涉及的实验人员手工操作步骤更少，有助于降低其劳动强度。通过UHS泳道法获得的高质量精子无需经历反复的离心过程，因而DNA碎片指数（DFI）更低。这更有利于受精、妊娠结局以及子代安全¹³。

本方案的主要局限性在于其高度依赖高质量精子的自主游动能力。该方法不适用于精子完全不活动的患者。在极重度弱精子症或极重度少精子症的情况下，能够游向正确通道的高质量精子数量较少，寻找高质量精子的时间可能会延长。有时可能需要从左侧通道或缓冲液滴中寻找高质量精子。这些区域中的死亡精子、细胞碎片以及黏性杂质可能导致ICSI针头堵塞，从而延长整...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7% 聚乙烯吡咯烷酮溶液	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
吸液器	LABOTECT	-	Aspirator
生物洁净工作台	Suzhou Antai	-	Biological clean workbench
囊胚培养液	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
卵裂期培养液	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 培养箱	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
培养用油	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
一次性塑料移液管	BD Falcon	357575	disposable plastic transfer pipette
受精培养液	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI 操作皿	BD Falcon	351006	培养皿
即用型透明质酸酶	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
倒置显微镜	NIKON	-	Inverted microscope
体外受精工作站	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler 计数板	Sefi Medical Instruments		Makler counting chamber
显微操作系统	NIKON	-	Micro operating system
卵母细胞处理液	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
光学显微镜	OLYMPUS	-	Optical microscope
相差显微镜	NIKON	-	Phase contrast microscope
精子计数板	Markler	-	Sperm Counting Board
精子梯度分离液	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
精子核DNA完整性检测试剂盒	Shenzhen HuaKang	-	Sperm Nucleus DNA Integrity Kit (SCD)
体视显微镜	NIKON	-	Stereoscopic microscope
台式离心机	HETTICH	-	Tabletop centrifuge
恒温试管架	GRANT	-	Thermostatic test tube rack
三气培养箱	ASTEC	-	Tri-gas incubator