本方案详细介绍了利用MultiBac杆状病毒系统重组表达人源肌球蛋白-7a全酶，并通过定制的体外丝状蛋白滑动实验研究其运动特性的操作步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
基于MultiBac系统的入源肌球蛋白-7a的纯化及生物物理表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肌球蛋白-7a 是一种以肌动蛋白为底物的马达蛋白，在听觉和视觉过程中发挥关键作用。肌球蛋白-7a 的突变会导致 Usher 1 型综合征，这是人类最常见且最严重的聋盲疾病形式。目前认为，肌球蛋白-7a 可与其他 Usher 蛋白形成跨膜黏附复合物，对感光细胞和耳蜗毛细胞的结构与功能完整性至关重要。然而，由于难以获得纯净且完整的蛋白样品，人类肌球蛋白-7a 的确切功能机制仍不明确，相关的结构与生物力学研究十分有限。近期研究表明，哺乳动物的肌球蛋白-7a 是一种多聚体马达复合物，由一条重链和三种轻链组成：调节轻链（RLC）、钙调蛋白以及钙调蛋白样蛋白 4（CALML4）。与钙调蛋白不同，CALML4 不能结合钙离子。这两种对钙离子敏感和不敏感的钙调蛋白对于哺乳动物肌球蛋白-7a 机械特性的精确调控均具有关键作用。本文详细描述了一种利用 MultiBac 杆状病毒蛋白表达系统制备重组人源肌球蛋白-7a 全酶的方法。该方法可获得毫克级高纯度的全长蛋白，从而实现对其生化与生物物理特性的表征。我们进一步提供了一种利用定制化手段评估其机械与运动特性的实验方案 体外 运动性分析和荧光显微镜技术。完整的人源肌球蛋白-7a蛋白及其功能表征的详细实验方案的建立，为深入研究肌球蛋白-7a在视觉和听觉中的分子机制奠定了基础。
引言
肌球蛋白是一类分子马达蛋白，可与肌动蛋白相互作用，驱动多种细胞过程1,2,3,4。人类拥有12个类别共39个肌球蛋白基因5，参与多种生理功能，如肌肉收缩6和感觉过程7。每个肌球蛋白分子是由重链和轻链组成的多聚复合物。重链可分为头部、颈部和尾部区域。头部含有肌动蛋白和核苷酸结合位点，负责ATP水解并在肌动蛋白丝上产生作用力2。颈部由多个α螺旋IQ基序构成，特定的一组轻链结合于此处。它们共同作为杠杆臂，将马达蛋白的构象变化放大为大幅度的运动8,9,10。尾部包含类别特异性的亚结构域，在调节肌球蛋白马达活性以及介导与细胞内结合伴侣的相互作用方面发挥调控作用2,11。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本文描述了一种合成完整人源肌球蛋白-7a全酶并表征其体外运动性的实验方案。该方案分为三个部分：首先，利用MultiBac杆状病毒蛋白表达系统表达人源肌球蛋白-7a；其次，使用E.coli His6-SUMO系统分别纯化肌球蛋白-7a的轻链；最后，通过肌动蛋白丝滑动实验研究人源肌球蛋白-7a的运动特性。
1. 基于MultiBac系统的肌球蛋白-7a复合物的制备
- 构建用于表达人源肌球蛋白-7a复合物的杆状病毒多基因表达盒（16天）
注意：插入肌球蛋白-7a亚基cDNA至pACEBac1载体需要一个克隆周期（4天），完成表达肌球蛋白-7a复合物所需的所有扩增模块的逐步连接则需要三个克隆周期，总计16天。- 使用商业试剂盒，按照制造商提供的方案，将编码肌球蛋白-7a重链（HC）、钙调蛋白（calmodulin）、CALML4和RLC的cDNA克隆至pACEBac1载体中（参见材料表；图1A）。在肌球蛋白-7a HC的C末端插入一个FLAG标签，以利于纯化。
注意：哺乳动物肌球蛋白-7a存在两种剪接异构体，仅在N末端相差一个11个氨基酸的片段23
- 使用商业试剂盒，按照制造商提供的方案，将编码肌球蛋白-7a重链（HC）、钙调蛋白（calmodulin）、CALML4和RLC的cDNA克隆至pACEBac1载体中（参见材料表；图1A）。在肌球蛋白-7a HC的C末端插入一个FLAG标签，以利于纯化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
纯化的肌球蛋白-7a复合物和轻链蛋白可通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，如图3所示。位于200 kDa标记上方的条带对应于肌球蛋白-7a重链（255 kDa）。从上到下，在22 kDa与14 kDa标记之间迁移的三条带分别为RLC（20 kDa）、钙调蛋白和CALML4。尽管钙调蛋白与CALML4的分子量相似，均约为17 kDa，但使用16% Tris-甘氨酸凝胶可将这两种蛋白分离。
视频 1 和 图 5 展示了使用哺乳动物肌球蛋白-7a 进行的典型肌动蛋白丝滑动实验。该实验揭示的一个显著特征是肌球蛋白-7a 的运动速度较慢。为更清晰地观察由该肌球蛋白驱动的肌动蛋白丝运动，视频以正常速度的 500 倍回放。该实验可进一步改进，用于研究温度、离子强度和溶液黏度等外部因素对肌球蛋白-7a 活性的影响。此外，可将肌球蛋白-7a 结合蛋白引入流动池，以探究其对肌动蛋白-肌球蛋白相互作用及运动行为的影响。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种利用昆虫细胞生产重组人源肌球蛋白-7a蛋白的详细实验方案。尽管Sf9/杆状病毒系统已被用于生产多种肌球蛋白40,41,42,43，但直到最近才成功利用MultiBac杆状病毒系统纯化出哺乳动物来源的肌球蛋白-7a14。研究表明，哺乳动物肌球蛋白-7a可与三种轻链结合，这三种轻链对其蛋白结构和功能完整性均至关重要14。这与无脊椎动物中的同源蛋白及其他大多数肌球蛋白不同，后者通常仅结合一种或两种类型的轻链44,45。因此，要合成人源肌球蛋白-7a全酶，必须在每个Sf9细胞中同时表达至少四个不同的基因。在此情况下，MultiBac系统相较于多种杆状.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢西弗吉尼亚大学显微成像设施和视觉功能与形态学核心团队在图像分析方面的讨论与帮助。本工作得到西弗吉尼亚大学医学院向R.L.提供的终身教职启动资金支持。本工作还获得美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）视觉科学生物医学研究卓越中心（Vs-CoBRE）（P20GM144230）以及NIGMS西弗吉尼亚生物医学研究卓越网络（WV-INBRE）（P20GM103434）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 微量离心管 | VWR | 87003-294 | |
| 1X FLAG 肽 | GenScript | N/A | 定制多肽合成 |
| 22x22 mm 盖玻片，No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| 250 mL 锥形离心管 | Nunc | 376814 | |
| 250 mL 通气锥形摇瓶 | IntelixBio | DBJ-SF250VP | |
| 2-巯基乙醇 | VWR | M131 | |
| 75x25x1 毫米 Vistavision 显微镜载玻片 | VWR | 16004-42 | |
| 肌动蛋白>99% 纯度） | 细胞骨架 | AKL99 | |
| Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置 | 默克生命科学 | UFC510024 | |
| Amicon Ultra-4 离心过滤单元 | 默克生命科学 | UFC801024 | |
| ANTI-FLAG M2 亲和凝胶 | Millipore Sigma | A2220 | |
| ATP | 默克生命科学 | A7699 | |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| Bio-Spin 一次性层析柱 | 伯乐（Bio-Rad） | 732-6008 | |
| BL21 感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | C2530H | |
| Bluo-Gal | 赛默飞世尔科技 | 15519028 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | 5470 | |
| BstXI 酶 | New England Biolabs | R0113S | |
| 钙调蛋白 | Millipore Sigma | 208694 | |
| 过氧化氢酶 | Millipore Sigma | C40 | |
| Champion pET-SUMO 表达系统 | 赛默飞世尔科技 | K30001 | |
| cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | 罗氏诊断 | 5056489001 | |
| Cutsmart 缓冲液 | New England Biolabs | B6004S | |
| DL-二硫苏糖醇 | Millipore Sigma | DO632 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Millipore Sigma | DO632 | |
| DNase I，Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-610-304 | |
| 双面胶带 | Office Depot | 909955 | |
| EGTA，分子生物学级 | Millipore Sigma | 324626-25GM | |
| EGTA，分子生物学级 | Millipore Sigma | 324626-25GM | |
| 乙醇 | 赛默飞世尔科技 | BP2818 | |
| ExpiFectamine Sf 转染试剂 | Gibco | A38915 | |
| FAST项目 | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | ||
| Fisherbrand Model 505 超声波破碎仪 | Fisher Scientific | FB505110 | |
| 庆大霉素试剂溶液 | Gibco | 15710-064 | 10 mg/mL，溶于蒸馏水 |
| 葡萄糖 | 默克生命科学 | G5767 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Millipore Sigma | G2133 | |
| 甘油 | Invitrogen | 15514-011 | |
| HisPur 钴树脂 | 赛默飞世尔科技 | 89966 | |
| I-CeuI 酶 | New England Biolabs | R0699S | |
| 图像稳定插件 | https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | ||
| ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
| 咪唑 | 默克生命科学 | I2399 | |
| In-Fusion Snap Assembly Master Mix | TaKaRa | 638948 | |
| IPTG | 赛默飞世尔科技 | 15529019 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | A451SK | |
| 卡那霉素 | Fisher Scientific | AAJ67354AD | |
| 大孔径移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-134 | 1-200 μL |
| LB 琼脂，即用型粉末 | 赛默飞世尔科技 | J75851-A1 | |
| 亮肽素蛋白酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 78435 | |
| 氯化镁 | 赛默飞世尔科技 | J61014.=E | 1M |
| 氯化镁 | 赛默飞世尔科技 | J61014.=E | 1M |
| Max Efficiency DH10Bac 感受态细胞 | Gibco | 10361012 | |
| 微量离心管，1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| 1.7 mL 微型离心管 | VWR | 87003-294 | |
| 微量离心管，1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| 显微镜 | 尼康 | 型号：Eclipse Ti 配备 H-TIRF 系统，100X TIRF 物镜 | |
| 显微镜相机 | ORCA-Fusion BT | ||
| 显微镜激光单元 | Andor iXon Ultra | ||
| Miller's LB肉汤 | 康宁 | 46-050-CM | |
| MOPS | 默克生命科学 | M3183 | |
| MOPS | Millipore Sigma | M3183 | |
| NanoDrop One/OneC 微体积紫外-可见光分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-ONE-W | |
| NanoDrop One/OneC 微量紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-ONE-W | |
| NEB 5-alpha 感受态大肠杆菌（高效） | New England Biolabs | C2987H | |
| NEBuffer r3.1 | 新英格兰生物实验室 | B6003S | |
| NIS Elements | 尼康 | ||
| NIS-Elements | 尼康 | ||
| 硝酸纤维素 | LADD Research Industries | 53152 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Gibco | 31985070 | |
| pACEBac1 载体 | 日内瓦生物技术公司 | ||
| Parafilm | 默克生命科学 | P7793 | |
| PMSF | Millipore Sigma | 78830 | |
| PureLink RNase A（20 mg/mL） | Invitrogen | 12091021 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250） | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒（50） | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒（50） | QIAGEN | 28104 | |
| 快速CIP | 新英格兰生物实验室 | M0525S | |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Invitrogen | R415 | |
| S.O.C. 培养基 | Invitrogen | 15544034 | |
| SENP2 蛋白酶 | PMID:17591783 | 实验室纯化 | |
| Sf9细胞 | 赛默飞世尔科技 | 11496015 | |
| Sf-900 III SFM (1X) - 无血清完全培养基 | Gibco | 12658-027 | |
| Slide-A-Lyzer G3 透析盒，10K 截留分子量，3 mL | 赛默飞世尔科技 | A52971 | |
| 氯化钠 | 默克生命科学 | S7653 | |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | S7653 | |
| Stericup Quick Release 真空驱动一次性过滤系统 | 默克生命科学 | S2GPU01RE | |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA连接酶缓冲液 - 10X，含10 mM ATP | 新英格兰生物实验室 | B0202A | |
| 盐酸四环素 | Millipore Sigma | T7660-5G | |
| Tris | Millipore Sigma | 10708976001 | |
| Triton X | American Bioanalytical | 9002-93-1 |
参考文献
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
- Titus, M. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
