基于 MultiBac 系统的人肌球蛋白 7a 纯化和生物物理表征

Summary

该方案详细说明了使用 MultiBac 杆状病毒系统重组生产人肌球蛋白 7a 全酶的程序，以及使用定制的体外丝滑行测定法研究其运动性的程序。

Abstract

肌球蛋白 7a 是一种基于肌动蛋白的运动蛋白，对听觉和视觉过程至关重要。肌球蛋白 7a 突变导致 1 型 Usher 综合征，这是人类最常见和最严重的聋盲形式。据推测，肌球蛋白 7a 与其他 Usher 蛋白形成跨膜粘附复合物，这对感光细胞和耳蜗毛细胞的结构功能完整性至关重要。然而，由于获得纯、完整蛋白质的挑战，人肌球蛋白 7a 的确切功能机制仍然难以捉摸，可用的结构和生物力学研究有限。最近的研究表明，哺乳动物肌球蛋白-7a 是一种多聚体运动复合物，由一条重链和三种类型的轻链组成:调节轻链 （RLC）、钙调蛋白和钙调蛋白样蛋白 4 （CALML4）。与钙调蛋白不同，CALML4 不与钙离子结合。钙敏感和不敏感的钙调蛋白对于哺乳动物肌球蛋白 7a 的适当微调其机械性能都至关重要。在这里，我们描述了一种使用 MultiBac 杆状病毒蛋白表达系统生产重组人肌球蛋白 7a 全酶的详细方法。这产生了毫克级的高纯度全长蛋白，可用于其生化和生物物理表征。我们进一步提出了一种方案，用于使用定制的 体外 运动测定和荧光显微镜评估其机械和运动特性。完整的人肌球蛋白 7a 蛋白的可用性，以及此处描述的详细功能表征方案，为进一步研究肌球蛋白 7a 在视觉和听觉中的分子方面铺平了道路。

Introduction

肌球蛋白是与肌动蛋白相互作用以驱动许多细胞过程的分子运动蛋白 1,2,3,4。人类有 12 个类别和 39 个肌球蛋白基因⁵ （myosin genes），它们参与广泛的生理功能，如肌肉收缩 6 （muscle contraction^） 和感觉过程⁷（sensory process）。每个肌球蛋白分子都是由重链和轻链组成的多聚体复合物。重链分为头部、颈部和尾部区域。头部包含肌动蛋白和核苷酸结合位点，这些位点负责 ATP 水解并在肌动蛋白丝上产生力²。颈部由几个 α 螺旋 IQ 基序形成，其中一组特定的轻链结合在一起。它们共同充当杠杆臂，将电机的构象变化放大为大运动 ^8,9,10。尾部包含类特异性亚结构域，在调节肌球蛋白的运动活动和介导与细胞结合伴侣的相互作用中发挥调节作用 ^2,11。

人肌球蛋白 7a 是 7 类肌球蛋白的成员，对听觉和视觉过程至关重要^12,13。人肌球蛋白-7a 的 IQ 基序与轻链的独特组合有关，包括调节轻链 （RLC）、钙调蛋白和钙调蛋白样蛋白 4 （CALML4）14,15,16。除了稳定杠杆臂外，这些轻链还调节肌球蛋白 7a 响应钙信号传导的机械特性，这一特性似乎是哺乳动物亚型¹⁴ 所独有的。

编码肌球蛋白 7a 重链 （MYO7A/USH1B） 的基因缺陷是导致 1 型 Usher 综合征的原因，这是人类最严重的视力和听力综合损失形式¹⁷。此外，轻链基因 CALML4 是定位为 USH1H 致病等位基因的候选基因之一，USH1H 是 1 型 Usher 综合征的另一种变体^15,18。在视网膜中，肌球蛋白 7a 在视网膜色素上皮细胞和感光细胞中表达¹³。它与黑色素体在视网膜色素上皮 （RPE） 中的定位有关 ¹⁹ 和 RPE 细胞对感光器外段盘的吞噬作用²⁰。在内耳中，肌球蛋白 7a 主要存在于立体纤毛中，它在建立发束和控制机械电转导过程中起关键作用 12,21,22。

虽然肌球蛋白 7a 在感觉细胞中的重要性已得到充分证实，但其在分子水平上的功能机制仍然知之甚少。这种知识差距部分是由于纯化完整蛋白质（尤其是哺乳动物亚型）的挑战。最近，使用 MultiBac 系统重组表达完整的人肌球蛋白-7a 全酶¹⁴ 取得了重大进展。这一进步使这种运动蛋白的结构和生物物理表征成为可能，从而发现了人肌球蛋白-7a 的几种独特特性，这些特性特别适应哺乳动物的听觉功能^14,23。

MultiBac 系统是一种先进的杆状病毒/昆虫细胞平台，专为真核生物多聚体复合物的表达而设计^24,25。该系统的一个关键特征是它能够在单个 MultiBac 杆状病毒中托管多个基因表达盒，每个盒编码复合物的一个亚基。多基因表达盒的组装通过所谓的增殖模块进行促进:一个归巢核酸内切酶 （HE） 位点和一个位于多个克隆位点 （MCS） 两侧的匹配设计的 BstXI 位点。该模块可通过限制性/连接对单个表达盒进行迭代组装，利用 HE 和 BstXI 限制性酶切位点在连接时被消除的事实。在本文中，人肌球蛋白 7a 重链、 RLC 、钙调蛋白和 CALML4 分别被克隆到 pACEBac1 载体内的增殖模块中（图 1A），然后通过迭代过程组装到多基因表达盒中（图 1B）。通过将 mini-Tn7 元件从 pACEBac1 载体转座到基因组中的 mini-attTn7 靶位点，肌球蛋白 7a 多基因盒被整合到杆状病毒基因组 （bacmid） 中（图 1C）。按照杆粒纯化、杆状病毒生产和扩增的程序（图 1D、E）制备重组肌球蛋白 7a MultiBac 杆状病毒，并可用于大规模蛋白质生产（图 1F）。此外，肌球蛋白-7a 轻链可以在大肠杆菌中单独产生，并使用可切割的 His6-SUMO 标签 26,27,28 进行纯化。纯化的轻链可用于研究它们的结合动力学和肌球蛋白-7a 的调节。

纯化的肌球蛋白 7a 蛋白可以进行结构、生化和生物物理研究，以深入了解这种运动蛋白的结构功能调节。此外，可以使用多种体外重建方法检查其与肌动蛋白网络和其他结合蛋白²⁹ 的相互作用。这些分析的结果将为这种肌球蛋白的生物物理特性提供信息，从而从机制上理解肌球蛋白 7a 如何驱动细胞骨架变化并最终塑造感觉细胞的独特形态和功能。在本文中，我们详细介绍了一种专门适用于哺乳动物肌球蛋白 7a 的肌动蛋白丝滑动测定工作流程。肌动蛋白丝滑动测定是一种强大的体外运动测定，可定量研究由固定在盖玻片表面上的大量肌球蛋白马达推动的荧光肌动蛋白丝的运动 30,31,32。该检测的优点包括设置简单、设备要求最低（配备数码相机的宽视场荧光显微镜）和高重现性。此外，由于肌动蛋白丝的运动是由一组固定的肌球蛋白马达驱动的，因此该测定法对于研究单体肌球蛋白（如肌球蛋白-7a）的运动特别有用^14,33。该方案包括从实验程序到成像分析的多项修改，专门针对哺乳动物肌球蛋白 7a 的独特运动特性量身定制。随着完整肌球蛋白 7a 蛋白的可用性和此处概述的功能表征方案，本文为进一步研究肌球蛋白 7a 在生理和病理过程中的分子作用奠定了基础。

Protocol

注意:这里我们描述了一种合成完整人肌球蛋白 7a 全酶并在体外表征其运动性的方案。该方案分为三个部分:首先，使用 MultiBac 杆状病毒蛋白表达系统表达人肌球蛋白 7a;其次，使用 大肠杆菌 His6-SUMO 系统分别纯化肌球蛋白 7a 轻链;最后，使用肌动蛋白丝滑动测定研究人肌球蛋白 7a 的运动。

1. 基于 MultiBac 系统的肌球蛋白-7a 复合物生产

1. 创建用于表达人肌球蛋白 7a 复合物的杆状病毒多基因盒（16 天）
   注:需要一个克隆周期（4 天）将肌球蛋白-7a 亚基的 cDNA 插入 pACEBac1 载体中，需要三个克隆周期才能完成表达肌球蛋白-7a 复合物所需的所有增殖模块的逐步连接，总共需要 16 天。
   1. 按照制造商的方案，使用商业试剂盒将编码 肌球蛋白-7a 重链 （HC）、钙调蛋白、CALML4 和 RLC 的 cDNA 克隆到 pACEBac1 载体中（参见 材料表; 图 1A）。在肌球蛋白 7a HC 的 C 端插入 FLAG 标签以帮助纯化。
      注:哺乳动物肌球蛋白 7a 以两种剪接亚型形式产生，仅在 N 端²³ 处的 11 个氨基酸片段不同。这种短的 N 末端延伸在调节肌球蛋白-7a 的 ATP 酶活性中起关键作用¹⁴。已经表明，添加 N 端标签会破坏这种 N 端延伸的正常调节，并显着降低电机的酶活性和运动性¹⁴。因此，采用 C 端 FLAG 标签以避免破坏蛋白质的自然调节。
   2. 如下所述，使用归巢核酸内切酶/BstXI 增殖构建肌球蛋白 7a 全酶的多基因表达盒（图 1B）。
      注:归巢核酸内切酶 I-CeuI 产生与 BstXI 消化产生的末端兼容的粘性末端。连接后，会产生一个归巢核酸内切酶/BstXI 杂交限制性位点，该位点不能被任何一种酶切割。可以重复相同的过程来集成更多的乘法模块。如果插入片段或载体构建体上存在 I-CeuI 和 BstXI 的多个限制性位点，则必须通过定点诱变消除这些额外的位点，以确保 I-CeuI 和 BstXI 切割位点是唯一的。
   3. 插入片段制备:用归巢核酸内切酶 I-CeuI 消化插入片段构建体（例如 pACEBac-M7a HC）（参见 材料表），然后使用 PCR 纯化试剂盒纯化线性化质粒（参见 材料表）。此外，用 BstXI 消化线性化质粒（参见 材料表），使用凝胶电泳分离含有基因表达盒的片段，并使用凝胶提取试剂盒进行纯化（参见 材料表）。
      注意:根据制造商的方案，I-CeuI 和 BstXI 需要不同的缓冲条件才能达到 100% 活性。此外，使用 I-CeuI 完全切割至少需要 3 小时，而 BstXI 只需要 15 分钟的孵育时间。因此，需要按顺序进行消化。
   4. 载体制备:通过 BstXI 消化线性化载体构建体（例如 pACEBac-CaM）。碱性磷酸酶包含在载体制备中，以防止载体质粒连接到自身（参见 材料表）。通过电泳获得消化产物，并使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
   5. 连接:用 T4 DNA 连接酶连接 I-CeuI/BstXI 处理的插入片段和 BstXI 处理的载体（参见 材料表）。在室温 （20 °C -25 °C） 下以 1:1 的质量比进行连接反应 10 分钟，使插入 DNA 与载体 DNA 的质量比接近 100 ng，在每次连接反应中保持总质量接近 100 ng。
   6. 转化和质粒分析:按照制造商的建议将连接混合物转化到 DH5α 细胞中（参见 材料表），并筛选庆大霉素抗性的阳性菌落。使用市售试剂盒纯化质粒（参见 材料表），并根据特异性限制性消化模式和插入片段的 DNA 测序验证正确的克隆（例如，同时含有 M7a HC 和 CaM 的质粒）。
   7. 整合多个基因表达盒:重复步骤 1.1.2 至 1.1.6 以整合表达其他肌球蛋白-7a 亚基的其他基因盒。
2. 重组杆粒 DNA 生产和纯化（4 天; 图 1C）。
   注:第 1 天 - 细菌转化和转化菌落的生长。第 2-3 天 - 生长菌落和筛选成功转化。第 3 天 - 选择并划线阳性菌落，开始过夜接种。第 4 天 - 杆粒 DNA 的纯化。
   1. 按照制造商的建议，用 1 ng 测序的 pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM 质粒转化 DH10Bac 感受态细胞（参见 材料表）。
   2. 将 20-200 μL 细胞铺在含有 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素、100 μg/mL 四环素、100 μg/mL 卤代吲哚基-β-半乳糖苷和 40 μg/mL IPTG 的琼脂平板上（参见 材料表），并将板在 37°C 下孵育 48 小时，以允许在阴性克隆中形成深蓝色。
      注:卤化吲哚基-β-半乳糖苷对继续表达 LacZ 的菌落进行染色（表明转座不成功），从而能够选择转座成功的白色菌落。
   3. 仔细选择一个分离的白色集落，并在 5 mL 含有 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素和 10 μg/mL 四环素的 LB 培养基中，在 37 °C 下在轨道振荡器中以 225 rpm 的速度培养细胞过夜。
   4. 将培养物以 2,465 x g 离心 10 分钟以沉淀大 肠杆菌。弃去上清液，将沉淀重悬于试剂盒中的 300 μL 缓冲液 P1 中。
      注:虽然此处使用了 Miniprep 试剂盒中的缓冲液，但纯化杆粒产物的方案与试剂盒提供的方案不同。
   5. 从试剂盒中加入 300 μL 缓冲液 P2。将试管倒置几次进行混合，然后在室温下孵育 3 分钟。
   6. 从试剂盒中加入 300 μL N3 缓冲液，倒置混合以终止裂解反应。在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 10 分钟。
   7. 将上清液转移到干净的无菌管中，再重复离心 10 分钟。
   8. 将 800 μL 上清液转移到另一个无菌 1.7 mL 微量离心管中（参见 材料表），并加入 600 μL 冷异丙醇（参见 材料表），通过严格倒置混合。然后在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 20 分钟。
   9. 弃去上清液并找到白色小颗粒。用 800 μL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀（参见 材料表），并在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 5 分钟。 沿管壁小心添加乙醇，以免干扰沉淀。
   10. 弃去上清液并重复乙醇洗涤一次。在室温下风干沉淀 5 分钟。如有必要，小心吸出多余的液体。
   11. 用试剂盒中的 20 μL EB 缓冲液溶解沉淀。通过轻弹试管或通过移液轻轻混合确保沉淀完全溶解。使用分光光度计测定浓度（参见 材料表）。
   12. 根据需要调整缓冲液体积，使杆粒浓度约为 1 μg/μL。将杆粒 DNA 储存在 4 °C 直至准备好生产 P0 病毒。
       注意:纯化的杆粒可以保持在 4 °C 并保持有效数月。我们已经看到 1 岁以下的杆粒产品成功转染。或者，可以将杆粒等分并储存在 -20 °C。应避免多次冻融循环，因为它们会降低转染效率。
3. 用杆粒转染 Sf9 昆虫细胞以产生重组杆状病毒（6 天; 图 1D）
   注:第 1 天 - 用杆粒 DNA 转染细胞。第 2-6 天 - 观察细胞的生长和表达。第 6 天 - 收集 P0 病毒。
   1. 将培养基中的 Sf9 细胞（参见 材料表）以 0.33 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度加入 6 孔板中，每孔 3 mL。让板在室温下静置 30 分钟，让细胞附着在板的底部。
   2. 对于每个孔，通过在无菌微量离心管中混合 10 μL 阳离子脂质体转染试剂（参见 材料表）和 250 μL 改进的最低必需培养基 （MEM） 培养基（参见 材料表）来制备转染混合物。倒置混合并在室温下孵育 5 分钟。
   3. 向转染混合物中加入 1 μg（基于步骤 1.2.12 中确定的浓度）未稀释的肌球蛋白-7a 杆粒。倒置混合并在室温下孵育 5 分钟。
   4. 将整个 DNA-脂质混合物均匀滴加到孔中。为未转染的细胞留出一个孔作为阴性对照。
   5. 用薄膜密封 6 孔板（参见 材料表）并在 27 °C 下孵育 6 天。在这段时间里观察成长和分离。如果构建体上存在荧光标签，请检查荧光发展（图 2）。
   6. 当转染的细胞出现晚期感染的迹象时，将含有病毒的培养基从感染的孔中转移到 15 mL 锥形管中，并以 805 x g 离心 10 分钟。
   7. 将上清液转移到干净的 15 mL 锥形管中，用铝箔包裹，并在 4 °C 下储存。 该产品现在是 P0 病毒，根据我们的经验，可以有效储存和使用长达四个月。
4. 扩增杆状病毒原液（3-5 天; 图 1E）
   1. 在 250 mL 锥形瓶中的 Sf9 细胞培养基中制备浓度为 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的 100 mL（或所需体积）的 Sf9 细胞（参见 材料表）。
   2. 向 Sf9 细胞悬浮培养物中加入 1:100 比例 （v/v） 的 P0 病毒原液，并在 27 °C 下在轨道振荡器中以 135 rpm 孵育。
   3. 每 24 小时监测一次生长，直到细胞达到 ~90% 的细胞死亡。一旦达到此范围，将细胞悬液以 500 x g 离心 10 分钟，并收集含有 P1 病毒的上清液。
   4. 使用 0.22 μm 真空过滤过滤上清液（参见 材料表）。将过滤后的产品避光保存并储存在 4 °C。 该产品现在是 P1 病毒。
      注:病毒滴度在 4 °C 下长期储存会降低。如果新鲜病毒储液已储存 4 个月以上，请考虑制备新鲜病毒储液，或在用于表达³⁴ 之前对病毒储液进行滴定。
5. 蛋白质表达（从开始表达到收集细胞沉淀之间 60 -72 小时; 图 1E）
   1. 制备浓度为 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的对数期生长 Sf9 细胞，并以 12 mL 病毒与 300 mL 细胞悬液的比例添加 P1 病毒。
      注:蛋白质产量约为 1 mg/L。建议至少使用 1.5 L 细胞悬液进行这种蛋白质表达。
   2. 在 27 °C 的轨道振荡器中以 135 rpm 培养细胞约 60 小时。
      注:可以在不同的时间点收集小样品，并使用 SDS 凝胶进行分析以评估蛋白质表达水平。此外，如果蛋白质与荧光标签融合，则可以使用荧光显微镜评估表达水平。细胞应在细胞死亡开始前收获。
   3. 将细胞悬液在 4 °C 下以 3,735 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。沉淀物可以储存在 -80 °C 下直至进一步使用或保存以长期储存。我们通常在几周内使用细胞沉淀，但在冷冻几个月后已经回收了活性蛋白。
6. 蛋白质纯化（2 天; 图 1F)
   注:第 1 天 - 使用 FLAG 亲和层析进行蛋白质提取和纯化。第 2 天 - 透析过夜后分装并冷冻样品。下面描述的方案用于从 1.5 L 细胞沉淀中纯化肌球蛋白-7a。
   1. 制备含有 10 mM MOPS （pH 7.2）、500 mM NaCl、10 mM MgCl₂、1 mM EGTA、1 μg/mL 亮肽素和 100 μg/mL 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的主缓冲液。用 0.22 μm 孔径过滤器过滤，并将缓冲液储存在 4 °C（参见 材料表）。
      注:PMSF 在水溶液中不稳定。在 100% 乙醇中制备 1 M 的 PMSF 储备溶液，并在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
   2. 通过在主缓冲液中补充 3 片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂、2 mM ATP 和 0.1 mM 二硫苏糖醇（DTT;参见 材料表），制备 75 mL 提取缓冲液。
   3. 在沉淀仍冷冻时向沉淀中加入 75 mL 提取缓冲液。将沉淀物放在冰上的提取缓冲液中，直至其解冻。使用血清移液管打碎沉淀以加速解冻过程。
   4. 使用 1/2 英寸（13 毫米）尖端，以 50% 振幅、5 秒开、5 秒关，在冰上对重悬液进行超声处理 10 分钟。
   5. 将总裂解物在 4 °C 下以 33,746 x g 离心 30 分钟。 在离心过程中，用 40 mL PBS 洗涤 3 mL 的 50% 抗 FLAG 亲和树脂浆液（参见 材料表），制备 1.5 mL FLAG 树脂。通过在 4 °C 下以 800 x g 离心 2 分钟来沉淀树脂。 小心去除 PBS，不要干扰树脂。
   6. 将裂解物离心的上清液加入到洗涤的树脂中，并在 4 °C 下连续旋转孵育 1 小时。
   7. 在 4°C 下以 800 x g 离心 2 分钟，使树脂沉淀。 在不干扰树脂的情况下，去除上清液。
   8. 将树脂重悬于 40 mL 主缓冲液中，并在 4 °C 下以 800 x g 离心 2 分钟。 小心去除上清液，不要干扰树脂。重复洗涤 1 次。
   9. 将洗涤后的树脂转移到两个聚丙烯离心柱中（参见 材料表）。用 2 mL 主缓冲液洗涤每根色谱柱 1 次。在 4 °C 下以 1,400 x g 离心色谱柱 2 分钟，除去主缓冲液。 树脂将填充在底部。
   10. 向主缓冲液中加入 100 μg/mL FLAG 肽（参见 材料表）制备洗脱缓冲液。
   11. 向每根色谱柱的填充树脂中加入 300 μL 洗脱缓冲液，并通过移液轻轻混合，以确保树脂被洗脱缓冲液完全水合。让树脂与洗脱缓冲液在冰上孵育 10 分钟。
   12. 将色谱柱在 4 °C 下以 1,400 x g 离心 2 分钟。 将流出液转移到干净的微量离心管中，并将其保存在冰上。这是第一个部分。
   13. 重复步骤 1.6.11-1.6.12，以便从每列中收集 4 个馏分。
   14. 用洗脱级分进行 SDS-PAGE 凝胶电泳³⁵ 以确定它们的相对浓度。凝胶电泳时，制备含有 500 mM NaCl、10 mM MOPS、2 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA 和 1 mM DTT 的透析缓冲液。
   15. 合并最浓缩的馏分。将样品转移到 10K MWCO 透析盒中（参见 材料表）并在 4 °C 下透析过夜。 使用 1 L 透析缓冲液处理约 500 μL 蛋白质。至少更换 3 次透析缓冲液。
       注:离心柱和离心洗脱方法允许在高浓度 （0.5-1 mg/mL） 下洗脱蛋白质。通常不需要进一步的浓缩步骤。然而，如果需要更浓缩的蛋白质，将样品加载到 100,000 MWCO 浓缩管上（参见 材料表），并在 4 °C 下以 1,400 x g 离心 5 分钟。重复此过程，直到达到所需的蛋白质溶液体积。
   16. 第二天，小心地从透析盒中取出样品。每个 PCR 管分装 15 μL，然后将试管放入液氮容器中进行快速冷冻。冷冻的蛋白质可以储存在 -80 °C 以备将来使用（图 3A）。
       注:使用这种方法的肌球蛋白-7a 的产量通常在 0.5 至 1 mg/L 之间。

2. 使用 大肠杆菌 His6-SUMO 系统纯化轻链 RLC 和 CALML4（7 天）

注:第 1-4 天 - 质粒的克隆和纯化。第 5 天 - 细菌转化。第 6-7 天 - 最终蛋白质的纯化、等分和冷冻。

1. 将编码 RLC 和 CALML4 的 cDNA 克隆到 pET-SUMO 载体中，该载体在 SUMO 之前包含 His6 序列以帮助纯化。需要时，可以使用 SENP2 蛋白酶从融合蛋白上切割 His6-SUMO 结构域^26,36。
2. 对于每种轻链蛋白，用质粒转化 BL21 大肠杆菌 感受态细胞（参见 材料表），并用转化的细胞开始 5 mL 过夜液体培养。
3. 第二天，将 5 mL 过夜培养物接种到 1 L 含有 50 μg/mL 卡那霉素的 Luria-Bertani （LB） 肉汤中。让培养物在 37 °C 下生长，以 270 rpm 的速度连续振荡，直到光密度 （O.D.） 达到 0.6 - 1.0。
   注意:一旦达到 0.2，OD 值大约每 20 分钟翻一番。经常监控 O.D.。
4. 通过向培养物中加入 250 μM 异丙基 b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 来启动蛋白质表达。在 37 °C 或 16 °C 下孵育 3-5 小时过夜，并以 270 rpm 连续振荡。
5. 通过在 4 °C 下以 4,347 x g 离心细胞悬液 15 分钟来沉淀大肠杆菌。 丢弃上清液。
6. 制备含有 50 mM Tris-HCl、1 M NaCl、5 mM 咪唑和 10% 甘油的重悬缓冲液，pH 值为 7.4（参见 材料表）。保持在冰上。
7. 将沉淀重悬于 15-25 mL 重悬缓冲液中，并将悬浮液转移到干净的烧杯中，将总体积调节至 35 mL。以 1:1000 （v/v） 的比例向悬浮液中加入 DNase 和 RNase，终浓度分别为 1 μg/mL 和 2 μg/mL。向悬浮液中加入一份不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂、4 mM 2-巯基乙醇和 1% Triton X（参见 材料表）。在冰上保持 20 分钟。
8. 在冰水中对沉淀悬浮液进行超声处理，开启 1 秒，关闭 1 秒，以 100% 振幅共 1 分钟。将匀浆裂解物在 4 °C 下连续旋转 2 小时。
   注:添加 Triton X 有助于裂解细胞，为超声处理做准备。
9. 将裂解物在 4 °C 下以 26,900 x g 离心 45 分钟。此时，开始准备钴树脂（参见 材料表）。使用 500 μL 钴树脂进行 1 L 大肠杆菌 培养。在 4 °C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟，用超纯水洗涤树脂 2 次，然后用悬浮缓冲液洗涤 1 次。
10. 裂解物离心后，将上清液与洗涤的树脂混合，并在 4 °C 下轻轻摇动 30 分钟。
11. 将裂解物 - 树脂悬浮液在 4°C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟。 树脂将填充在试管底部。在不干扰树脂的情况下，去除上清液。
12. 在 4 °C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟，用重悬缓冲液洗涤树脂。 去除上清液。重复洗涤，直到上清液变为无色。
13. 制备含有 50 mM Tris HCl、300 mM NaCl、5 mM 咪唑、10% 甘油、4 mM 2-巯基乙醇和 0.25 μM SENP2 蛋白酶的洗脱缓冲液（参见 材料表）。把它放在冰上。
14. 将树脂重悬于 1 mL 重悬缓冲液中，并在 4 °C 下连续旋转孵育过夜。
15. 第二天，以 4,347 x g 离心 2 分钟以沉淀树脂。收集上清液，其中含有裂解的轻链蛋白和蛋白酶。
16. 向填料中加入 1 mL 洗脱缓冲液。重复离心并收集上清液。
17. 通过快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 去除蛋白酶。简而言之，用含有 50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% 甘油和 5 mM DTT （pH 7.4） 的缓冲液制备体积排阻柱（参见 材料表）。使用 10,000 MWCO 浓缩管将上清液浓缩至 500 μL。使用注射器将浓缩的样品加载到连接到自动色谱系统的色谱柱上，用含有 50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% 甘油和 5 mM DTT （pH 7.4） 的缓冲液流出。使用紫外分光光度法监测收集的馏分。收集分子量对应于轻链的蛋白质级分。
    注:如果在蛋白酶中设计了纯化标签（例如 GST 标签），则蛋白酶也可以通过亲和层析去除。
18. 用洗脱级分运行 SDS-PAGE 凝胶，以确定每个级分中轻链蛋白的纯度和相对浓度。所需组分是那些含有浓缩轻链蛋白且没有任何可见蛋白酶条带的组分。合并所需的蛋白质组分，并使用 10,000 MWCO 浓缩管³⁵.
19. 在液氮中快速冷冻蛋白质等分试样，并立即转移至 -80 °C 进行长期储存（图 3B）。
    注:使用 大肠 杆菌 His6-SUMO 系统的 RLC 和 CALML4 的产量约为 1-2 mg/L。

3. 肌球蛋白 7a 定制肌动蛋白丝滑动测定 （3 h）

注意:本节中使用的方法类似于其他肌球蛋白³¹ 描述的方法，主要修改是肌球蛋白在高离子强度缓冲液中的孵育和应用，以及实现准确测量帧到帧位移所需的长间隔。

1. 通过在聚合缓冲液（50 mM KCl、25 mM MOPS、2 mM MgCl 2 、1 mM DTT（pH 7.0））中聚合球状肌动蛋白（G-肌动蛋白）在4°C下过夜来制备 20 μM 丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。通过添加 1.2 倍摩尔过量的罗丹明 - 鬼笔环肽来标记 F-肌动蛋白（参见 材料表）。用铝箔覆盖并在冰上孵育至少 2 小时。
   注:G-肌动蛋白可从商业供应商处购买（参见材料表）或从兔肌肉丙酮粉末^31,37 中纯化。标记的 F-肌动蛋白可以在该浓度下在 4 °C 下储存长达 2 个月。
2. 如前所述准备一个流动室³¹.简而言之，将两条相距 2-3 毫米的双面胶带放在清洁和硝酸纤维素处理的显微镜载玻片上（参见 材料表）。将盖玻片硝酸纤维素面朝下放在试纸条上，形成一个体积约为 10 μL 的流通室（图 4）。
3. 进行肌动蛋白丝滑动测定
   1. 向流通室中，在 500 mM NaCl 运动缓冲液（500 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA （pH 7.4））中加入一个体积为 0.2 mg/mL 纯化的人肌球蛋白-7a 蛋白的腔室。在室温下孵育 5 分钟。
      注意:在高盐缓冲液中添加肌球蛋白 7a 至关重要，因为这可以缓解自身抑制状态并允许肌球蛋白 7a 以活化构象粘附在表面。
   2. 在 150 mM NaCl 运动缓冲液（150 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA、1 mM DTT（pH 7.4））中，用三室体积的 1 mg/mL BSA（参见材料表）洗涤流通室，通过在出口处使用干净的抹布吸收多余的液体。^{第 3 次}洗涤后孵育 1 分钟。
   3. 在 150 mM NaCl 运动缓冲液中，将一个腔室体积的 10 nM 罗丹明鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白流过流动室。在具有 100 倍物镜的荧光显微镜下监测肌动蛋白丝与表面的结合。肌动蛋白丝的密度应该是最佳的（图 5A），确保在视野中有足够的细丝进行跟踪，但又足够稀疏以防止多根细丝重叠，这会使跟踪复杂化。
   4. 用三腔体积的 150 mM NaCl Motility Buffer 清洗流动室，以去除未结合的肌动蛋白丝和过量的罗丹明-鬼笔环肽。
   5. 通过添加一个腔室体积的最终缓冲液（200 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA、50 mM DTT、2 mM ATP、2.5 mg/ml 葡萄糖、100 μg/mL 葡萄糖氧化酶、2 μM RLC、2 μM CaM、2 μM CALML4）来启动运动。
   6. 使用 561 nm 激发在荧光显微镜上记录图像，以观察罗丹明鬼笔环肽标记的肌动蛋白。在载玻片上找到具有所需肌动蛋白密度的区域（图 5A），并每 30 秒捕获一次图像，持续 30 分钟。
      注意:哺乳动物肌球蛋白 7a 的速度约为 5 nm/s。在设置采集帧速率时，重要的是要确保帧之间的细丝位移足够长（超过一个像素）以实现准确跟踪。帧之间的子像素移动可能会导致对速度的高估。30 秒的帧速率允许肌动蛋白丝在帧之间移动约 150 nm，对应于显微镜上的两个以上像素。但是，应注意在所使用的显微镜上可以观察到明显的位移。如果可用，可以使用多位置记录同时收集多个视场进行分析。
4. 使用 FAST 程序（安装在 Mac 上）分析肌动蛋白丝的运动³⁸。
   注意:此处使用的 FAST 程序只是量化细丝运动的众多选项之一。我们选择使用 FAST，因为它是自动化的、快速的，并且不需要付费软件。其他选项包括基于 MATLAB 的算法（如 FIESTA）、基于 ImageJ/FIJI 的方法（如 MTrack2 和手动跟踪）以及基于 Python 的方法（如 Philament³⁹）。
   1. 下载并安装 FAST 程序 （github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3 兼容版本，以及用于 nd2 文件转换的附加模块。注意:原始 python2 版本可以在 github.com/turalaksel/FASTrack） 中找到。
   2. 按照³⁸ 中的说明运行 FAST 程序，使用容差值 33 仅保留平滑移动的细丝。
      注意:如果图像包含舞台机械问题或同时收集多个系列的漂移，则应首先对影片进行稳定处理。为此，我们推荐斐济插件 Image Stabilizer，可从以下地址下载 - （https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html）。
   3. 使用 FAST 程序分析新创建的 .tif 图像，方法是首先设置 -xmax 和 -ymax 值。这些参数为程序输出的散点图设置参数，并表示最长细丝长度（以 nm/s 为单位）和最大细丝速度（以 nm/s 为单位）。在此示例中，我们使用 20,000 nm 的 -xmax 和 20 nm/s 的 -ymax 来确保捕获所有数据（图 5D）。
   4. 使用 -px 设置采集图像的像素大小，此处为 65 nm，使用 -minv 设置细丝包含在分析中所需的最小速度（以 nm/s 为单位）。对于本例中肌球蛋白-7a 的低速度，请使用 0.1 nm/s。
   5. 使用 -maxd 设置帧之间允许链接的灯丝的最大距离。设置此参数是为了避免在帧之间链接单独的细丝，在此示例中，我们使用默认的 2000 nm。
   6. 使用 pt 设置细丝速度波动的容差，并且仅包含运动平稳的细丝。此示例使用 33% 的容差阈值。这意味着速度标准差大于速度平均值 33% 的细丝将被排除在进一步分析之外。
   7. 最后，使用 -d 表示包含用于分析的.tif堆栈的文件夹。包含给定参数和值的整个命令字符串将为:fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [包含影片的文件夹名称]。
      注意:FAST 程序将输出散点图（图 5D）及其相关的原始数据，可以提取这些数据以便在其他程序中进行分析和可视化（图 5C）。它还将输出跟踪细丝路径的图（图 5B），该图应用于验证跟踪是否按预期工作。下面包括绘图和其他可能的数据可视化的示例。

Results

纯化的肌球蛋白-7a 复合物和轻链蛋白可以通过 SDS-PAGE 凝胶电泳进行评估，如图 3 所示。200 kDa 标记物上方的条带对应于肌球蛋白 7a 重链 （255 kDa）。从 上到下在 22 和 14 kDa 标志物之间迁移的三个条带分别是 RLC （20 kDa）、钙调蛋白和 CALML4。虽然钙调蛋白和 CALML4 的分子量相似，约为 17 kDa，但这两种蛋白质可以使用 16% Tris-甘氨酸凝胶进行分离。

视频 1 和 图 5 展示了哺乳动物肌球蛋白 7a 的特征性肌动蛋白丝滑动测定。该测定揭示的一个直接特征是肌球蛋白 7a 的运动缓慢。该视频以正常速度播放 500 倍，以更好地可视化由该肌球蛋白驱动的肌动蛋白丝的运动。可以修改该测定法以进一步研究温度、离子强度和溶液粘度等外部因素如何影响肌球蛋白 7a 的活性。此外，肌球蛋白 7a 结合蛋白可以引入流动槽，以研究它们对肌动球蛋白相互作用和运动的影响。

图 1:基于 MultiBac 系统的肌球蛋白-7a 全酶生产工作流程。 （A） 将编码肌球蛋白-7a 重链、RLC、CALML4 和钙调蛋白的 cDNA 插入 pACEBac1 载体的多个克隆位点 （MCS） 中。（B） 通过迭代连接包含肌球蛋白-7a 重链、RLC、CALML4 和钙调蛋白 cDNA 的 pACEBac1 载体，构建用于编码肌球蛋白-7a 复合物的多基因表达盒。（C） 通过将 mini-Tn7 元件从 pACEBac1 载体转座到基因组中的 mini-attTn7 靶位点，将肌球蛋白 7a 多基因盒整合到杆状病毒基因组中。（D） 用含有肌球蛋白 7a 多基因盒的重组杆粒转染 Sf9 细胞，产生表达肌球蛋白-7a 复合物的杆状病毒。（E） 通过将 P0 病毒接种到 Sf9 细胞悬液培养物中并收集上清液，可以扩增杆状病毒。所得产物 P1 病毒可用于大规模蛋白质表达。（F） 基于 FLAG 亲和柱的肌球蛋白-7a 复合物纯化工作流程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:转染表达带有 C 端 GFP 标签的球粒 sf9 细胞的代表性荧光图像。 这些图像显示了杆状病毒感染的正常进展:细胞在转染后第 4 天左右开始表达肌球蛋白-7a，几乎所有细胞都在一周内被感染。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:纯化的肌球蛋白-7a 复合物和轻链蛋白的 SDS 凝胶。 （A） 使用 MultiBac 系统纯化的全长人肌球蛋白-7a 全酶。标明了重链 （HC） 和轻链。（B） 使用 His6-SUMO 系统纯化的 RLC 和 CALML4。钙调蛋白 （CaM） 被购买（参见 材料表）并从牛脑中纯化。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:流通室组装和肌动蛋白滑动分析的工作流程。 使用两片双面胶带将硝酸纤维素处理的盖玻片连接到显微镜载玻片上。这形成了一个体积约为 10 μL 的流通室。蛋白质按顺序添加到流通室中，而多余的溶液则使用薄纸通过通道吸取。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:滑动肌动蛋白丝测定和跟踪分析的代表性结果。 （A） 延时记录的示例帧显示由表面装饰的肌球蛋白 7a 电机驱动的肌动蛋白丝运动。（B） FAST 程序针对 （A） 所示的相同视场输出的细丝跟踪图像。（C） 哺乳动物肌球蛋白 7a 产生的肌动蛋白滑动速度的代表性直方图:4.2 ± 1.4 nm/s（平均值±标准偏差;轨迹数 = 550）。（D） FAST 程序自动生成的输出示例，显示计算的细丝长度和速度。%STUCK 显示根据用户提供的最小速度截止值被视为卡住的细丝的百分比。MVEL 表示所有非卡住细丝的平均速度。 请单击此处查看此图的较大版本。

视频 1:用肌球蛋白 7a 进行的肌动蛋白丝滑动测定。 纯化的全长人肌球蛋白 7a 附着在表面。该短片以每 30 秒 1 帧和 200 毫秒曝光拍摄。 请点击此处下载此视频。

Discussion

这里介绍的是从昆虫细胞生产重组人肌球蛋白 7a 蛋白的详细方案。尽管 Sf9/杆状病毒系统已被用于产生多种肌球蛋白 40,41,42,43，但直到最近才使用 MultiBac 杆状病毒系统成功纯化了哺乳动物肌球蛋白-7a ¹⁴。发现哺乳动物肌球蛋白 7a 与三种类型的轻链相关，所有这些轻链对于蛋白质的结构和功能完整性都是必需的¹⁴。这与它的无脊椎动物同源物和大多数其他肌球蛋白形成鲜明对比，后者通常只与一种或两种轻链类型结合^44,45。这意味着要合成人肌球蛋白-7a 全酶，每个 Sf9 细胞中必须至少同时表达四个不同的基因。在这种情况下，MultiBac 系统与多种杆状病毒的共感染相比具有显著优势，因为它确保了每个感染细胞中肌球蛋白 7a 复合物亚基的可重复比率。事实上，Belyaev 等人已经从统计上证明了这一点:随着病毒类型数量的增加，细胞接受相同病毒的可能性急剧降低⁴⁶。例如，对于两种病毒类型，只有 12.78% 的细胞达到相等的比率，而当使用四种病毒类型时，假设每种病毒类型独立分布在细胞之间，则该百分比下降到 0.29%。当亚基蛋白需要以一致的比例组装以产生复合物的最大产量时，这种可变性可能会产生问题。虽然本文侧重于哺乳动物肌球蛋白 7a，但越来越明显的是，MultiBac 系统为生产多聚体复合物提供了一种比共感染方法更优化的方法，特别是对于具有更多亚基且产量低的蛋白质。

使用该方法实现肌球蛋白-7a 蛋白的高产量生产有几个因素至关重要。首先，确定收获 Sf9 细胞的最佳时间至关重要。这允许最大的蛋白质生产，同时最大限度地减少病毒引起的细胞裂解和死亡的有害影响。与单顺反子杆状病毒系统或表达较小蛋白质相比，基于 MultiBac 的蛋白质复合物生产通常表现出延迟的表达峰值。我们发现收获肌球蛋白 7a MultiBac 病毒感染的细胞的最佳时间是感染后 60 - 65 小时。强烈建议在整个过程中持续监测蛋白质表达水平。如果融合了荧光蛋白标签，则可以使用荧光显微镜来完成，否则可以通过 SDS-PAGE 分析来实现。此外，同时监测细胞活力以确定实现最高蛋白产量和最小细胞死亡的最佳时机也很重要。

肌球蛋白-7a 是一种易受蛋白质降解影响的大单体肌球蛋白¹⁴。为防止纯化过程中的降解，必须确保所有缓冲液都经过预冷，并且所有程序都在 4 °C 下进行。此外，尽量减少肌球蛋白 7a 与蛋白酶的暴露至关重要。除了使用蛋白酶抑制剂混合物外，我们还建议将细胞裂解物与 FLAG-resin 的孵育时间保持在 1 小时。延长此持续时间并未显示可显著改善填料结合或提高总蛋白产量，并且可能会带来更高的蛋白降解风险。

与低等物种⁴⁴ 的亚型相比，哺乳动物肌球蛋白 7a 的一个显着特征是它结合了独特的轻链成分。这些轻链在肌球蛋白 7a 的功能中起着重要的调节作用。例如，钙调蛋白以 Ca²⁺ 依赖性方式与肌球蛋白重链动态相互作用⁴⁷，调节其运动和机械输出，这种机制似乎特别适应哺乳动物的听毛细胞¹⁴。虽然钙调蛋白与单个 IQ 基序的确切结合亲和力尚未在整个分子的背景下确定，但我们已经观察到，随着细胞裂解物中多余的轻链在纯化过程中被去除，一些钙调蛋白会逐渐解离。这可能会改变肌球蛋白 7a 的机械性能。为了缓解这种情况，我们在洗脱步骤中采用离心柱结合温和离心。这允许以小体积和高浓度洗脱蛋白质，从而无需浓缩步骤。这种做法缩短了总蛋白纯化过程，并将轻链解离的风险降至最低。在肌动蛋白滑动测定中，我们在最终缓冲液中加入过量的轻链蛋白，以确保天然轻链与肌球蛋白 7a 重链保持结合。

对过量轻链的要求代表了肌球蛋白 7a 的肌动蛋白滑动测定与其他经过充分研究的肌球蛋白（如肌球蛋白-2）之间的几个差异之一。肌球蛋白-2 检测通常在低离子强度（例如 50 mM）下进行。随着离子强度提高到生理强度 （150 mM），肌动蛋白丝趋于分离，运动减慢。在肌球蛋白 7a 的情况下，运动在低离子强度下停滞，并且仅在大于或等于 150 mM 时观察到滑动。由于全长肌球蛋白 7a 的自抑制，它在高离子强度溶液中以类似于肌球蛋白丝在应用前溶解的方式应用于盖玻片，以允许蛋白质以允许后续滑动的方向和构象结合。

在肌球蛋白 7a 的肌动蛋白滑行测定中观察到的低速度为获取和分析运动数据带来了一些挑战。事实上，与骨骼肌肌球蛋白相比，易位慢了几个数量级，最初开发该测定法时使用³⁰。这种低速度会导致难以准确测量和对速度的高估，这与帧速率⁴⁸ 成正比。任何跟踪方法的定位精度都是有限的，即使是静态对象在连续图像之间也会发生明显的位置偏移。随着采样率的增加，这会导致人为地提高速度值。这种效应对于任何类型的运动测定都是正确的，但对于帧之间发生几个像素的大移动的测定，相对效应非常小。通过以非常长的间隔（每 60 秒、90 秒等）获取数据点，可以验证测得的速度是否准确，因为该值应不受采样率的影响。由于肌球蛋白 7a 的记录间隔很长，因此可以利用延迟在同一采集期间从多个位置进行记录。这有效地允许一次录制多个电影。这种方法的缺点是，由于位置的切换，载物台的机械缺陷会导致额外的漂移。这可以通过如上所述使用图像稳定来解释。

在 FAST 软件的原始 Python2 版本 （github.com/turalaksel/FASTrack） 中，每个输出数据点表示 N 帧窗口（默认为 5 帧）内细丝的速度。该软件的修改后的 Python3 版本 （github.com/NeilBillington/FASTrack3） 包括一个额外的输出，其中数据点基于细丝。软件生成的默认绘图基于 N 窗口型数据集。两种输出类型同样有效，尽管原始输出将在每部电影中产生更多的数据点，但我们通常使用基于细丝的数据，因为这与量化细丝滑动的现有方法更直接地具有可比性，并且可以产生有关特定电影中具有特定速度的细丝数量的更直观信息。请注意，即使在这种细丝类型分析中，数据点的数量也不会与真实的细丝数量完全对应，因为当细丝交叉路径时，跟踪就会停止，然后在交叉后出现新的轨迹时检测到它们。

本文中描述的方法的局限性是哺乳动物蛋白在昆虫细胞中表达。尽管许多此类蛋白质（包括这种蛋白质）已经以这种方式成功表达，但还有其他表达系统可能更接近地模拟蛋白质的天然环境。哺乳动物表达系统可以向蛋白质引入昆虫系统中不存在的重要翻译后修饰。在细菌系统中的表达在更大程度上也是如此，如这里用于产生肌球蛋白轻链。尽管如此，我们认为在这些情况下，相对简单和高收益率超过了潜在的局限性。用于表征蛋白质的 体外 运动测定在它可以产生多少关于蛋白质的信息方面受到限制。例如，肌球蛋白调节的许多方面都被测定所掩盖或规避，因此无法使用该技术进行研究。存在许多其他检测类型，例如单分子运动、光学捕获以及生化和生物物理技术，以研究肌球蛋白 在体外 的特性，但这里选择丝状滑动测定作为测量肌球蛋白活性的方法，因为它需要的蛋白质比许多生化测定少，易于执行并且可以证明成功的运动， 告诉我们这种蛋白质在生化和机械上都具有活性。

此处描述的工作流程代表了生产高质量肌球蛋白 7a 蛋白和表征其机械特性的一系列方法。尽管这些方法是专门针对这种肌球蛋白类别的，但表达和纯化程序通常更能作为如何产生这种不稳定蛋白质的指南，该蛋白质由几种不同的多肽组成，具有解离和降解的趋势。此外，表征方法对所有类型的运动蛋白都很有用，特别是，数据采集和分析参数的考虑旨在对测量低速分子马达转位率的任何人有用。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL 微量离心管	VWR	87003-294
1X FLAG 肽	金斯瑞	N/A	定制肽合成
22x22mm 1.5 号盖玻片	VWR	48366-227
250 mL 锥形离心管	Nunc	376814
250 mL 通气锥形 Erlenmyer 摇瓶	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-巯基乙醇	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision 显微镜载玻片	VWR	16004-42
肌动蛋白（>99% 纯度）	细胞骨架	AKL99
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 离心过滤装置	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 亲和凝胶	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin 一次性层析柱	Bio-Rad	732-6008
BL21 感受态大肠杆菌	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	5470
BstXI 酶	New England Biolabs	R0113S
钙调蛋白	Millipore Sigma	208694
过氧化氢酶	Millipore Sigma	C40
冠军 pET-SUMO 表达系统	Thermo Fisher	K30001
cOmplete，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-二硫苏糖醇	Millipore Sigma	DO632
DL-二硫苏糖醇	Millipore Sigma	DO632
DNase I，光谱化学	Fisher Scientific	18-610-304
双面胶带	Office Depot	909955
EGTA，分子生物学级	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA，分子生物学级	Millipore Sigma	324626-25GM
乙醇	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf 转染试剂	Gibco	A38915
FAST 程序	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
费雪品牌 505 型 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
庆大霉素试剂溶液	Gibco	15710-064	10 mg/mL，溶于蒸馏水中
	Millipore Sigma	G5767
葡萄糖氧化酶	Millipore	Sigma G2133
甘油	Invitrogen	15514-011
HisPur 钴树脂	Thermo Fisher	89966
I-CeuI 酶	New England Biolabs	R0699S
图像稳定器插件	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ 斐济	https://imagej.net/Fiji/Downloads
咪唑	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly 预混液	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
异丙醇	Fisher Scientific	A451SK
卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ67354AD
大口径移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-134	1-200 μL
LB 琼脂，现成粉末	Thermo Fisher	J75851-A1
亮肽素蛋白酶抑制剂	Thermo Fisher	78435
氯化镁	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
氯化镁	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
最大效率 DH10Bac 感受态细胞	Gibco	10361012
微量离心管，1.7mL	VWR	87003-294
微量离心管，1.7mL	VWR	87003-294
微量离心管，1.7mL	VWR	87003-294
显微镜	尼康	型号：Eclipse Ti，带 H-TIRF 系统，带 100X TIRF 物镜
显微镜相机	ORCA-Fusion BT
显微镜激光装置	Andor iXon Ultra
Miller's LB 肉汤	康宁	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha感受态大肠杆菌（高效）	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	康
NIS 元件	尼康
硝酸纤维素	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I 减血清培养基	Gibco	31985070
pACEBac1 载体	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A （20 mg/mL）	Invitrogen	12091021
QIAprep 离心小量提取试剂盒 （250）	QIAGEN	27106
QIAquick 凝胶提取试剂盒 （50）	QIAGEN	28704
QIAquick PCR 纯化试剂盒 （50）	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
罗丹明鬼笔环肽	Invitrogen	R415
S.O.C. 培养基	Invitrogen	15544034
SENP2 蛋白酶		PMID：17591783	实验室纯化
Sf9 细胞	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM （1X） - 无血清培养基完整	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 透析盒，10K MWCO，3	mLThermo Fisher	A52971
氯化钠	Millipore Sigma	S7653
氯化钠	Millipore Sigma	S7653
Stericup快速释放真空驱动一次性过滤系统	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA连接酶缓冲液 - 10X，含10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
盐酸四环素	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	美国生物分析	9002-93-1