一种用于小鼠疼痛研究中同步行为与脑动态的自动化斜视法

摘要

本方案提供了一种可与神经生理学测量指标时间锁定的、用于长期追踪啮齿类动物自动眨眼的方法。该方案预期对研究偏头痛等疼痛障碍机制的研究人员具有实用价值。

摘要

自发性疼痛在实时追踪和量化方面一直存在挑战，难以避免人为偏差。对于头痛类指标（如偏头痛等疾病）而言，这一问题尤为突出。眼睑收缩（eye squint）作为一种可随时间连续测量的变量指标，已被证明在预测此类检测中的疼痛状态方面具有有效性。本文提供了一种利用 DeepLabCut（DLC）对头部可自由旋转但身体固定的实验小鼠进行眼睑收缩（眼睑之间的欧氏距离）自动化量化分析的实验方案。该方案可实现无偏倚的眼睑收缩量化，并能与神经生理学等机制性测量指标直接配对和比较。我们评估了人工智能训练所需的关键参数，以确保能够有效区分收缩与非收缩时段。我们还展示了在降钙素基因相关肽（CGRP）诱导的偏头痛样表型中，以亚秒级分辨率可靠追踪和区分眼睑收缩的能力。

引言

偏头痛是全球最常见的脑部疾病之一，影响超过十亿人¹。偏头痛的临床前小鼠模型已成为研究偏头痛机制的重要手段，因为与人类研究相比，这些研究更容易进行控制，从而能够对与偏头痛相关的行为进行因果关系分析²。此类模型已显示出对诱发偏头痛的化合物（如降钙素基因相关肽（CGRP））具有强烈且可重复的表型反应。在啮齿类动物模型中，对与偏头痛相关行为的可靠测量仍存在迫切需求，尤其是那些可与成像和电生理学等机制性指标相结合的行为测量方法。

偏头痛样脑状态的表型特征表现为畏光、足爪痛觉过敏、面部伤害性刺激超敏以及面部痛苦表情³。这些行为通过动物在光照区域停留的总时间（畏光）以及足爪或面部触觉敏感阈值（足爪痛觉过敏和面部伤害性超敏）进行测量，且通常仅在较长时间段（数分钟或更长）内进行单次读数。通过给予偏头痛诱导化合物（如CGRP）可在动物中诱发偏头痛样行为，从而模拟人类偏头痛患者所经历的症状³（即体现表面效度）。此类化合物在人类中给药时同样可引发偏头痛症状，表明这些模型具有构建 效度⁴。通过药物干预使行为表型得到缓解的研究，已推动了偏头痛治疗相关发现，并进一步验证了这些模型的有效性（即体现预测效度）^5,6。

例如，单克隆抗降钙素基因相关肽（CGRP）抗体（ALD405）可减轻经CGRP处理小鼠的畏光行为⁵和面部 grimace（痛苦表情）⁶；其他研究也表明，CGRP拮抗剂药物可减少动物由一氧化二氮诱导的类偏头痛行为^7,8。近期的临床试验已证实，阻断CGRP在治疗偏头痛方面取得成功^9,10，由此推动了多种靶向CGRP或其受体的药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。偏头痛相关表型的临床前评估促进了临床研究的突破，因此对于理解某些难以在人体中直接检测的偏头痛复杂机制至关重要。

尽管具有诸多优势，使用这些啮齿类动物偏头痛行为读数的实验通常在时间点采样的能力上受到限制，且可能具有主观性并容易受到人为实验误差的影响。许多行为检测方法难以在更精细的时间分辨率下捕捉活动，通常难以捕获发生在亚秒时间尺度上的更动态的事件，例如脑活动层面的变化。在具有意义的时间分辨率下，对随时间推移而发生的更自发、自然出现的行为要素进行量化已被证明十分困难，这限制了对神经生理机制的研究。建立一种能够在更快速时间尺度上识别偏头痛样活动的方法，将有助于对外验证偏头痛样脑状态。进而，这种方法可与脑活动同步，从而构建出更为可靠的偏头痛脑活动特征谱型。

一种与偏头痛相关的表型——面部痛苦表情，已被广泛用于多种情境下作为动物疼痛的测量指标，可实现瞬时测量并随时间进行追踪¹¹。面部痛苦表情通常被用作自发性疼痛的指标，其依据在于人类（尤其是非言语个体）及其他哺乳动物在经历疼痛时会自然地表现出面部表情的变化¹¹。过去十年中，针对小鼠疼痛的面部痛苦表情研究已采用诸如小鼠面部痛苦评分量表（Mouse Grimace Scale, MGS）等标准化工具，以统一描述啮齿类动物的疼痛状态¹²。MGS的面部表情变量包括眼眶紧缩（眯眼）、鼻部隆起、颊部隆起、耳部位置及胡须形态变化。尽管已有研究表明MGS能够可靠地表征动物疼痛¹³，但该方法主观性强，依赖于准确的评分，而不同实验操作者之间的评分可能存在差异。此外，MGS的局限性在于其采用非连续性评分尺度，且缺乏足够的时间分辨率，难以精确追踪随时间自然发生的疼痛相关行为。

一种应对方法是客观量化一种稳定的面部特征。眯眼是最稳定可追踪的面部特征⁶。在考虑所有MGS变量（眯眼、鼻部隆起、面颊隆起、耳位和胡须变化）时，眯眼占数据总变异性的大部分⁶。由于眯眼对使用MGS获得的总体评分贡献最大，并且能够可靠地追踪对CGRP的反应^6,14，因此它是追踪偏头痛小鼠模型中自发性疼痛最可靠的方法。这使得眯眼成为一种由CGRP诱导的可量化的非稳态行为。多个实验室已使用包括眯眼在内的面部表情特征来表征与偏头痛相关的潜在自发性疼痛^6,15。

在将自动化斜视检测与偏头痛机制研究相结合方面，仍存在若干挑战。例如，若不依赖必须在各次实验中以相同方式校准的固定位置，可靠地追踪斜视一直较为困难。另一个挑战是，难以以连续尺度而非离散尺度（如MGS）进行此类分析。为应对这些挑战，我们旨在将机器学习方法（以DeepLabCut（DLC）的形式）整合到我们的数据分析流程中。DLC是由Mathis及其同事开发的一种姿态估计算法模型，已广泛应用于多种行为研究¹⁶。利用该姿态估计软件，我们训练出能够以接近人类水平的准确度预测小鼠眼部关键点位置的模型。该方法解决了重复性人工评分的问题，同时显著提高了时间分辨率。此外，通过建立这些模型，我们实现了在更大实验群体中可重复地量化斜视程度，并估算类似偏头痛的脑部活动。本文介绍了该方法的开发与验证过程，该方法可实现斜视行为的追踪，并能与神经生理学等其他机制性测量指标进行时间同步。总体目标是推动需要时间锁定斜视行为的啮齿类动物模型中的机制性研究。

方案

注意：本实验中使用的所有动物均按照美国爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行操作。

1. 准备数据采集设备

1. 确保所有必要设备的可用性：确保运行DLC所需的推荐硬件至少具有8 GB内存。有关硬件和软件的信息，请参见材料表。
   注意：数据可以以任意格式采集，但必须在分析前转换为DLC可读的格式。最常见的格式为AVI和MP4。
2. 配置至少一个摄像头，以便能够检测动物的一只眼睛。如果两只眼睛均可见，则需进行额外的滤波处理，因为这可能在追踪过程中引起干扰。有关此类滤波的示例，请参见第10节中提供的数据。
3. 通过Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation处提供的软件包安装DLC。
4. 在摄像头设置中，将单个摄像头置于小鼠侧面角度（约90°）。为遵循本示例，以10 Hz频率采样，小鼠处于固定状态，但可自由进行相对于身体的完整头部运动。摄像头与动物之间的距离保持在2至4英寸之间。

2. 设置 DLC

1. 安装 DLC 后，创建用于工作的环境。为此，请使用以下命令通过更改目录导航到下载 DLC 软件的文件夹。
   cd folder_name
   注意：此处即为 DEEPLABCUT.yaml 文件所在的位置。
2. 运行第一条命令以创建环境，并通过输入第二条命令激活该环境。
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda activate Deeplabcut
   注意：每次使用 DLC 前，请确保已激活环境。
   激活环境后，使用以下命令打开图形用户界面（GUI），并开始创建模型。
   python -m deeplabcut

3. 构建模型

1. 打开图形用户界面后，点击底部的创建新项目以开始建立模型。
2. 为项目命名，名称应具有明确意义且唯一，以便后续识别，并在实验者字段中输入姓名。检查位置部分，确认项目将被保存的路径。
3. 选择浏览文件夹 并找到用于训练模型的视频。若不希望将视频从原始目录移动，请勾选将视频复制到项目文件夹。
4. 点击创建以在计算机上生成新项目。
   注意：视频必须涵盖您将观察到的行为的全部范围（例如眯眼、非眯眼以及介于两者之间的所有行为）。模型仅能识别与训练数据中相似的行为；若某些行为组成部分缺失，模型可能难以准确识别。

4. 配置设置

注意：此处可定义诸如需要追踪的点、从每个训练视频中提取的帧数、默认标记点大小，以及与模型训练方式相关的变量等细节。

1. 创建模型后，通过选择 编辑 config.yaml 来修改配置设置。选择 编辑 以打开配置设置文件，指定与模型相关的关键设置。
2. 修改 bodyparts 以包含需要追踪的眼部所有部位，然后修改 numframes2pick，使每段训练视频中选取的帧数达到总计 400 帧。最后，将 dotsize 更改为 6，以便在标注时默认点的大小足够小，能够准确地标记在眼部边缘周围。

5. 提取训练帧

1. 配置完成后，在图形用户界面顶部导航至提取帧选项卡，然后在页面右下角选择提取帧。
2. 通过图形用户界面底部的加载进度条监控处理进度。

6. 标注训练帧

1. 在图形用户界面中导航至标注帧选项卡，并选择标注帧。找到显示每个选定训练视频对应文件夹的新窗口。选择第一个文件夹，此时将打开一个新的标注图形界面。
2. 对所选视频的每一帧中标注在配置过程中定义的关键点。完成所有帧的标注后，保存标注结果，并对下一个视频重复此过程。
3. 为准确标注斜视程度，应使用两个尽可能靠近眼睛最高点（中心）的位置点，并分别标明每个点的上下位置。将这两个长度的平均值近似作为斜视程度的测量值。
   注意：在标注过程中，DLC 不会自动保存进度。建议定期手动保存，以避免已标注数据的丢失。

7. 创建训练数据集

1. 手动标注后，进入训练网络选项卡，选择训练网络，以提示软件开始训练模型。
2. 在命令窗口中监控训练进度。

8. 评估网络

1. 网络训练结束后 完整，导航至 评估 网络 标签并选择 评估网络. 等待 片刻，直到蓝色加载圆圈 消失，表明自评估已完成，模型已准备就绪可供使用。

9. 分析数据/生成带标签的视频

1. 要分析视频，请进入 分析视频 选项卡。选择 添加更多视频，并选中需要分析的视频。
2. 如果数据的 CSV 输出已满足需求，可选择 将结果保存为 CSV。
3. 当所有视频采集完成后，点击底部的 分析视频 以开始视频分析。
   注意：此步骤必须在第 9.5 步生成带标签视频之前完成。
4. 视频分析完成后，转至 创建视频 选项卡，并选择已分析的视频。
5. 选择 创建视频，软件将开始生成带标签的视频，以可视化对应 .csv 文件中的数据。

10. 处理最终数据

1. 应用位于 https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc 的宏，将原始数据转换为本分析所用的格式（即欧几里得距离）。
2. 将标注为 Step1 和 Step 2 的宏导入并应用于 CSV 文件，以滤除所有次优数据点，并将数据转换为眼睑上下中心区域点的平均欧几里得距离。
3. 运行名为 Step3 的宏，根据脚本中设定的 阈值（默认为 75 像素），将每个数据点标记为 0（无皱眉）或 1（皱眉）。
   注意：这些宏的参数可能需要根据实验设置进行调整（参见讨论部分）。皱眉的阈值以及眼睑最大值的自动滤波参数，可能需根据动物体型和摄像机距离进行修改。此外，也可根据数据筛选的严格程度，调整用于剔除次优数据点的数值。

结果

本文提供了一种利用 DeepLabCut 高时间分辨率可靠检测斜视的方法。我们优化了训练参数，并对该方法的优势与局限性进行了评估（图 1）。

在训练模型后，我们验证了模型能够准确估计眼睑的上缘点和下缘点（图2），这些点作为欧氏距离测量的坐标点。欧氏距离定义为眼睛上下两点之间距离的平均长度。我们的模型能够识别非眯眼（图2A）和眯眼（图2B）的情况。蓝色点表示用于确定每一帧图像中欧氏距离的点。绿色、黄色、橙色和紫色点用于帮助模型更准确地估计欧氏距离，并在头部处于非理想位置时降低置信度值（即校正头部运动以及不同实验会话中位置变化的影响）。随后，我们采用多种不同方法对模型的准确性进行了验证。

为了验证用于模型训练的理想帧数，我们训练并测试了四个样本帧数不同的模型（

讨论

本方案提供了一种易于获取的深度方法，用于使用基于机器学习的工具，在保持与先前方法相同（或更优）时间分辨率的同时，以接近人类水平的准确度区分斜视。该方法主要使自动化斜视评估能够更便捷地为更广泛的使用者所采用。相较于以往模型，我们用于评估自动化斜视的新方法具有多项改进。首先，通过使用更少但实际参与斜视量化计算的关键点，该方法提供了比ASM更为稳健的度量指标。这降低了假阳性与假阴性的可能性，因为在生成表征斜视的数值时，分析所依赖的关键点更少。换言之，DLC模型要求眼部周围每个点均为必要但非充分条件，以决定是否纳入某一时间点。这使得我们能够在使用与ASM相同数量关键点的情况下，过滤质量不佳的数据，同时避免因依赖过多组成点所带来的更大变异性。此外，我们通过设计不完全依赖训练人员准确性的模型，减少了潜在的人为误差。

在处理数据时，我们发现该方法能够准确过滤掉次优点和超出可能范围的异常点，因为这些点超出了小鼠眼球的最大尺寸（方案第10节）。我们使用了宏程序来检查围绕眼球的10个点中每个点的置信度值是否大于0.92，并过滤掉低于该阈值的点。未来可根据需要调整此参数，以使处理后的数据更具或更少选择性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CUDA toolkit 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
搭载 Windows 11 系统的英特尔第 13 代处理器计算机
用于自由活动小鼠的 LabFaceX 2D 眼睑追踪附加模块：	FaceX LLC	NA	任何能够记录动物眼睛的相机均可满足要求，但这是我们的眼动追踪硬件。
NVIDIA GPU 驱动程序版本 450.80.02 或更高
NVIDIA RTX A5500，24 GB DDR6	NVIDIA	[490-BHXV]	任何满足您所使用的 DLC 版本最低要求（目前为 8 GB）的 GPU 均可满足需求。我们使用的是 NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9–3.11
TensorFlow 版本 2.10