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小鼠和大鼠中枢神经系统靶向基因治疗载体的腰椎鞘内注射

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DOI：

10.3791/67138

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2025年5月16日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

腰椎鞘内注射是一种具有转化相关性的给药途径，可用于将基因治疗递送至中枢神经系统。本标准化操作方案全面涵盖了新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射技术，旨在指导研究人员在临床前基因治疗研究中采用该技术。

摘要

一种用于治疗神经系统疾病的中枢神经系统靶向方法是利用腰椎鞘内给药途径。该方法可绕过血脑屏障，直接进入脑脊液，优先靶向中枢神经系统内的细胞。已有多种采用腰椎鞘内注射途径的已发表临床前研究，推动了基因治疗临床试验的发展；然而，相关方案在不同文献中存在差异且分散于多个资源中。本文提供了一套完整的针对新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射方案，适用于临床前基因治疗研究。经过适当培训，该注射技术可快速且可靠地实施。除详细描述各发育阶段的注射操作流程外，还讨论了可能影响研究结果的相关参数，如注射体积。为展示腰椎鞘内注射在靶向中枢神经系统中的应用，本文呈现了在成功或失败注射后，腺相关病毒血清型9在脑、脊髓及外周组织中的表达情况。

引言

治疗需要广泛中枢神经系统（CNS）递送的神经疾病面临的一大挑战在于，尽管这些疾病本身是基因治疗的良好候选对象，但CNS及相关细胞类型的靶向效率普遍较低1。目前已有大量研究致力于通过改造递送载体来优化对中枢神经系统内细胞和组织的广泛靶向1,2。然而，利用现有的基因治疗载体技术，结合特定的病毒载体与给药途径，仍可实现相对广泛的载体分布3,4。目前实现单次治疗后广泛CNS递送的金标准方法是将腺相关病毒血清型9（AAV9）直接注射至脑脊液（CSF）中。

直接脑脊液注射通常有三种给药途径：腰椎鞘内注射（IT）、脑室内注射（ICV）和小脑延髓池注射 （ICM）5。这些给药途径在中枢神经系统（CNS）及外周组织中的生物分布模式各不相同，但均具有绕过血脑屏障（BBB）的优势，可作用于参与神经系统疾病病理过程和表型表现的中枢神经系统细胞6。其中，腰椎IT注射是临床药物递送在人体应用中的标准方法，因其临床操作常规且简便，相较于ICV和ICM注射具有更低的侵入性。

腰椎鞘内注射是一种在麻醉和镇痛领域广泛应用的成熟技术，首篇相关论文发表于1885年7。针对成年小鼠的腰椎鞘内注射首项操作方案发表于1980年8，此后该方法被广泛采用并多次综述9。此后对这些操作方案进行了若干细微调整或改进10,11,12，包括一种节省试剂的技术13。针对成年大鼠的腰椎鞘内注射方案最早发表于1976年，包括用于慢性给药的导管植入技术14和用于单次治疗的直接注射方法15。近年来，已有研究团队发表了针对新生期或幼年小鼠及大鼠的腰椎鞘内注射操作方案16,17。

该技术通过绕过血脑屏障并靶向中枢神经系统（CNS）细胞，已得到广泛应用和验证，推动了多种神经系统疾病基因治疗的临床前和临床研究取得成功。在模拟神经系统疾病的小鼠、大鼠和非人灵长类动物中获得的积极疗效和安全性数据，激发了人们对这些疾病潜在临床获益的广泛关注和浓厚兴趣18,19,20,21,22,23。目前已有部分研究进入临床试验阶段（例如，clinicaltrials.gov 编号 NCT02362438、NCT04737460、NCT03381729 和 NCT05518188）3,6。本文描述了一种适用于不同年龄小鼠和大鼠的简化腰椎鞘内注射方案，无需移除脑脊液，可用于转化型基因治疗项目。该方案与现有并被广泛采用的方案相似，但将相关方案集中引用并配以视频演示，便于查阅和参考，具有重要价值。本方案详细说明了对出生后0-1天（P0-1）的新生小鼠和大鼠，以及出生后小于<P10的幼年小鼠和大鼠，和出生后大于>P21的小鼠和大鼠进行注射的操作，并展示了在P1小鼠中成功与失败的腰椎鞘内注射的代表性结果。在讨论部分，阐述了操作过程中常见的错误、需要特别注意的具体细节，以及在启动临床前研究前如何练习此类注射的建议。

方案

本文所述实验程序已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验中涉及小鼠的方案使用野生型C57BL6/J雄性和雌性小鼠，年龄为P1-P28天。涉及大鼠的方案使用野生型Sprague-Dawley雄性和雌性大鼠，年龄为P1-P56天。除第3节所述的存活手术外，所有其他操作仅引起短暂不适，无需使用麻醉剂或镇痛剂。实验人员应密切监测实验动物是否出现超出短暂不适的情况，并就麻醉剂和镇痛剂的必要性咨询本单位IACUC及兽医人员的指导意见。所用试剂与设备的详细信息见于 材料列表.

1. 小鼠腰椎鞘内注射 >P21

  1. 准备
    1. 制备注射用溶液，包括所需浓度的基因治疗载体以及对照溶液（通常为载体生产过程中使用的制剂缓冲液）。注射用溶液应为无菌溶液，并在整个操作过程中保持无菌状态。
      注意：整个操作过程中，所有溶液均应置于冰上保存。
    2. 收集并消毒所有材料，包括注射器和针头、移液器以及注射溶液。遵循机构关于生物安全柜使用和注射剂暴露的指南。本文所述操作均在II级生物安全柜中进行。
    3. 使用微量移液器量取所需体积的注射溶液，并转移至无菌石蜡膜上。注射体积为 5 µL 常用于成年小鼠，并将其视为目标体积 >P21（表1).
      注意：如有必要，可增加体积；但应密切监测动物对较大注射体积的不良反应。有关注射体积及不良反应的详细信息，请参见讨论部分。溶液也可直接从移液器吸头转移至注射器，或使用经校准的气密微量注射器直接量取注射溶液的体积。
    4. 用一支30 G 0.5英寸针头的微升注射器吸取溶液，注意避免吸入气泡。
      注意：针头的规格和长度会影响皮肤穿刺效果。选择注射器大小时，注射体积不应小于注射器容量的10%。当注射体积超过注射器容量的50%时，应确保能够用食指轻松推动活塞。若无法轻松推动活塞，请使用容量更大的注射器。
  2. 限制
    1. 用惯用手在纸巾上抓住清醒（未麻醉）小鼠的尾巴。纸巾有助于固定、安抚小鼠，并防止其咬人。小鼠应保持中立的俯卧位，身体侧面朝向操作者。
      注意：在操作前无需对小鼠进行该固定方法的训练或适应性驯化。小鼠在固定过程中可能会出现挣扎行为，但不应引发明显的疼痛反应。若观察到持续性或超出瞬时范围的疼痛反应，可能需要给予镇痛剂处理；请咨询兽医指导。
    2. 用非优势手将部分纸巾折叠覆盖在小鼠头部和上半身，并用非优势手的拇指和食指牢固夹住骨盆带。确保手掌呈杯状，环绕在小鼠头部周围。小鼠的髂嵴应可触及，并位于每根手指远节指骨的中央位置。图1A，B).
      注意：用手或纸巾固定时不应妨碍呼吸。
    3. 轻轻旋转尾部基部，以确保脊柱位置正确对齐。小鼠的骨盆应保持方正，使腰椎的椎体突起与工作台面垂直。
    4. 用70%酒精消毒棉片擦拭小鼠背部腰椎区域。
    5. 在髂嵴颅侧约2-6 mm处分开毛发，以帮助观察注射位置。
    6. 触摸L4-L5或L5-L6椎间隙，位于髂嵴头侧约2-6 mm处。
      注意：具体距离因小鼠的大小和年龄而异。
  3. 注射
    1. 用惯用手握住微量注射器的中部，将其垂直置于小鼠脊柱的L4-L5或L5-L6椎间隙处。确保在不大幅度移动手部的情况下，可用食指按压注射器的推杆。将针头斜面向小鼠头部，穿刺椎间隙处的皮肤。
    2. 当针尖触及椎间隙周围骨缘时，将注射器角度减小至30-45度（图1A).
    3. 针头应滑入椎间隙，引起尾巴突然抽动，并应被椎骨紧密夹住。
    4. 在不移动注射器的情况下，平稳地推动活塞，于10秒内将溶液注入。
    5. 将注射器保持原位，在完全压下活塞后停留15–30秒，以使溶液充分扩散并防止回流。
    6. 以相同的30-45度进针角度平稳缓慢地将注射器从小鼠体内抽出。在拔出针头的同时，旋转注射器以防止回流。
      注意：旋转注射器时切勿推进针头，以免对脊髓造成物理损伤。
    7. 将小鼠从固定装置中释放，并放回其饲养笼中。
    8. 注射后观察小鼠的行走异常、运动功能障碍、呼吸异常及协调性。有关不良反应的更多细节，请参见讨论部分。
    9. 按照制造商的建议清洁设备。对于多次注射，建议每种基因治疗载体和对照溶液使用不同的注射器。
      注意：可拆卸的针头可以清洗、灭菌并多次重复使用；然而，钝化的针头不应继续使用，因其可能对动物造成伤害，并增加注射失败的风险。钝化的针头难以顺利刺穿皮肤，应予以妥善丢弃。若注射器数量有限，建议先完成所有对照载体（溶剂）的注射，再进行基因治疗载体的注射，并且应先注射最低剂量的基因治疗制剂，再依次给予较高剂量。
    10. 遵循机构关于动物间设备消毒的指导原则。

啮齿类动物脊髓注射示意图，展示药物通过脊髓的给药与分布。
图1小鼠和大鼠腰椎鞘内注射时手指与注射器放置示意图 (A小鼠的侧面图 >P21 显示腰椎鞘内注射过程中针头放置位置及注射器角度的转变。红色虚线椭圆表示手指在小鼠髂嵴上的定位位置。脊柱的放大视图显示了鞘膜下腔（蓝色）、针头大致放置位置（绿色箭头）以及脊髓（粉色）。（背侧视图B一只小鼠 >P21，（C一只小鼠 D一只大鼠 >P21，标注了针头放置的参考点（绿色圆圈）、骨盆带（黄色虚线椭圆）和手指放置位置（红色虚线椭圆）。切口位置和牵开器也在图中示出。D). 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 小鼠和大鼠腰椎鞘内注射

  1. 准备
    1. 遵循步骤 1.1。唯一的例外是步骤 1.1.3 中的进样体积。
      注意：新生小鼠（P0-P1）的推荐注射体积不应超过 3 µL，对于幼鼠（P5-P7）不应超过 5 µL，对于幼年小鼠（P10）不应超过 10 µL. 推荐的新生大鼠（P0-P1）注射体积不应超过 5 µL，对于幼年大鼠（P5-P7）不应超过 10 µL，对于幼年大鼠（P10）不应超过 30 µL (表1).
  2. 限制
    1. 用惯用手将小鼠/大鼠的尾巴握在纸巾上。小鼠/大鼠应保持中立的俯卧位，身体侧面朝向操作者。
      注意：小鼠/大鼠可能因固定而挣扎，但不应出现明显的疼痛反应。若观察到持续性疼痛反应，可能需要给予镇痛剂；请咨询兽医指导。
    2. 用非惯用手的拇指和食指轻轻而稳固地抓住骨盆带。髂嵴应可触及，并位于每根手指末节指骨的中央。图1C).
      注意：在此年龄段，无需担心被咬伤，因此无需用纸巾包裹小鼠或大鼠。但对于P5-10天的大鼠，可能需要使用纸巾以固定体型较大的幼鼠，保持其静止。
    3. 轻轻旋转尾部基部，以确保脊柱正确对齐。小鼠/大鼠的骨盆应保持方正，使腰椎的椎体突起与工作台面垂直。
    4. 用70%酒精棉片擦拭小鼠/大鼠的背部腰椎区域。
    5. 如有毛发，将毛发分开，位置在髂嵴颅侧约1-3 mm处，以帮助观察注射部位。在较年轻的大小鼠中，目标区域更易于观察。在无毛的新生动物中，椎间隙处可能可见凹陷。
    6. 触摸或可视化 L4-L5 或 L5-L6 椎间隙，位于髂嵴头侧约 1-3 mm 处。
      注意：具体距离因小鼠/大鼠的大小和年龄而异。
  3. 注射
    1. 用惯用手握住微量注射器的中部，将其与小鼠/大鼠脊柱呈30–45度角放置。针尖斜面朝向小鼠/大鼠头部，穿刺皮肤的位置位于椎间隙尾侧约1–3 mm处。由于注射器呈倾斜方向，皮肤穿刺点略位于椎间隙的尾侧。
      注：此距离可能因小鼠/大鼠的年龄和体型而异。
    2. 其余步骤与小鼠实验的步骤1.3.3-1.3.10相同 >P21

3. 大鼠腰椎内注射（年龄 >P21）

注意：文献中描述了多种鞘内注射（IT）操作方法，从非麻醉状态下的技术到更复杂的外科手术方法均有报道14,15。本文所述方法采用轻度麻醉和小切口，通过微创技术实现直接注射。使用麻醉剂（如异氟烷气体）有助于固定动物、放松肌肉组织，并防止注射过程中发生移动。在注射部位皮肤上做一小切口，可暴露椎间隙，便于观察，从而提高注射准确性，并避免穿刺厚实皮肤的需要。由于存在手术切口，必须使用麻醉药和镇痛药。随着操作熟练，可根据操作者判断并遵循机构相关规定，在P21日龄以上的 rats 中实施腰椎鞘内注射，且可选择不使用麻醉或不做皮肤切口15。请遵循机构关于实验动物麻醉、适当镇痛药物使用及存活手术的相关指南与要求。

  1. 准备
    1. 按照步骤 1.1 进行操作。唯一的例外是步骤 1.1.3 中的注射体积和步骤 1.1.4 中的针头尺寸。大鼠的注射体积因年龄和体型差异可能有很大变化。有关不同年龄的注射体积，请参见讨论部分（表 1）。
      注：建议对成年大鼠使用 27 G × 1" 针头，因为更细的针头可能会弯曲，而较短的针头可能无法充分穿透鞘内腔。如有需要，也可使用更长（1.25–1.5"）的针头。
    2. 使用首选且经批准的麻醉剂对大鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。
      注：在本实验所描述的操作中，大鼠使用异氟烷气体进行麻醉，并使用 1:1 的利多卡因与布比卡因混合液作为局部麻醉剂。在整个手术和恢复过程中，应使用经批准的外部热源维持体温。
    3. 对每只动物按照标准无菌外科手术程序准备手术部位。简而言之，剃除背部腰区的毛发，并用外科清洗液、聚维酮碘和 70% 异丙醇对皮肤进行消毒。
  2. 手术操作
    1. 将大鼠置于中立的俯卧位，身体侧面朝向操作者。
    2. 触诊骨盆带，确定髂嵴和腰骶交界处。在出生后第 21 天以上（>P21）的大鼠中，椎骨突起可被轻易识别。
    3. 使用手术刀在 L4-L5 或 L5-L6 椎间隙上方做一个 1 cm 的切口。切口应仅涉及皮肤及下方筋膜，保留肌肉完整。
      注：在后续操作过程中，使用牵开器固定切口皮肤有助于暴露术野。
    4. 用非优势手的拇指和食指轻轻但牢固地夹住骨盆带。髂嵴应可触及，并位于每根手指远端指骨的中央（图 1D）。使用蚊式钳沿背部中线探查，以定位椎间隙。
  3. 注射
    1. 用优势手握住微量注射器的中部，将其垂直于大鼠脊柱，对准 L4-L5 或 L5-L6 椎间隙。确保在不大幅度移动手部的情况下，可用食指下压注射器推杆。将针头斜面朝向大鼠头部方向，穿刺肌肉进入椎间隙上方。
    2. 将针头推进至椎间隙。
      注：当针头穿过椎骨突起之间时可能会有轻微阻力，此时可能需要轻微调整注射器的角度以通过该间隙，但注射器应基本保持约 90 度，即与脊柱垂直。当针头进入鞘内腔时，会感到一个“弹响”感。根据麻醉条件的不同，可能观察到或未观察到尾巴或腿部的抽动反应。针头应被椎骨紧密夹持。
    3. 小心保持注射器位置不变，下压推杆，在 30 秒内完成溶液注射。
      注：与小鼠注射不同，采用本方法时，可能无法在 >P21 的大鼠中减小注射器的角度。较大体积的注射应以较慢速度进行，以防止压力过度积聚。
    4. 推杆完全下压后，保持注射器原位 30–60 秒，以使溶液充分扩散并防止回流。
    5. 平稳地将注射器从大鼠体内拔出。拔出针头时，旋转注射器以防止回流。
      注：旋转注射器时需注意不要推进针头，以免对脊髓造成物理损伤。
    6. 使用经批准的方法（如缝合或伤口夹）关闭皮肤切口。在本实验所用大鼠中，皮肤切口采用 5-0 PDS II 缝线以连续皮内缝合或单纯间断缝合方式关闭。
    7. 使大鼠从麻醉中恢复。
    8. 执行步骤 1.3.9–1.3.10 及所有术后护理指南。

结果

尽管多种因素可能影响基因治疗载体的转导效率，组织学染色仍然是确定腰椎鞘内（IT）注射是否成功最准确的方法。注射后基因治疗载体在中枢神经系统（CNS）内分布广泛且均匀，是操作成功的标志。图2C展示了在新生小鼠（P1）中，通过鞘内注射自互补AAV9介导的基因治疗载体，在注射后4个月时实现弱泛表达的转基因表达（使用JeT启动子驱动，剂量为1.3 × 1011 vg/小鼠）的成功案例。采用靶向该基因治疗所递送转基因的探针进行RNAscope分析，结果显示在腰髓、颈髓和脑组织中均有广泛分布。图中同时包含肝脏和心脏切片，以说明即使通过直接脑脊液（CSF）注射，基因治疗载体仍可能分布至外周组织。

小鼠脑组织的组织学切片，标记为A-C，显示结构差异；示意图分析。
图2：注射后4个月（P1时注射）的小鼠中枢神经系统及外周组织的5微米染色组织切片。 红色染色通过RNAscope显示转基因表达，细胞核的蓝色复染通过苏木精完成。(A) 注射对照配方缓冲液。(B) 使用AAV9载体（scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA）进行脑实质内注射失败。(C) 使用AAV9载体（scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA）成功进行腰段鞘内注射。(B) 和 (C) 中使用的基因治疗载体剂量为具有临床转化相关性的1.3E11 vg/小鼠。比例尺：上图（5 mm）；下图（1 mm）。 请点击此处查看该图的放大版本。

如图2B所示，表达信号在腰段脊髓高度集中，而在脑组织中缺乏表达，可能提示发生了脊髓实质内注射，应视为注射失败。这种情况通常是由于针头插入过深，穿透了蛛网膜下腔，进入脊髓实质所致。此外，若脊髓和脑组织中表达信号极低或完全缺失（未示出），也应视为靶向错误的失败注射，前提是所使用的载体和剂量应能实现中枢神经系统的广泛分布。此问题可能源于针头插入深度不足，或进针位置偏离中线。

成功注射后观察到的表达模式可能因以下八个因素而有所不同：(1) 注射时的年龄，(2) 预存免疫反应，(3) 输注速率，(4) 基因治疗载体，(5) 基因治疗剂量，(6) 细胞表面蛋白，(7) 嗜性，以及 (8) 若适用，驱动转基因表达的合适启动子选择6。尽管表达模式可能存在差异，只要使用有效的载体（如 AAV9）并给予足够高的剂量，广泛、均匀且分布广泛的表达将是普遍存在的。

使用组织学分析来确认腰椎鞘内注射成功的主要局限性在于漫长的等待时间——需要等到研究结束、动物尸检完成并采集组织后才能进行——以及在大规模基因治疗研究中处理所有小鼠组织所需的大量资源。遗憾的是，我们的经验表明，即时且直接的注射成功或失败的指标往往不可靠；然而，当针头进入鞘内腔隙时引发的尾巴甩动反射，是实时判断穿刺到位的良好指标，通常提示注射成功。需注意不要将针头刺穿未麻醉小鼠/大鼠皮肤时引起的肌肉抽搐，与针头进入鞘内腔隙所诱发的尾巴甩动反应相混淆。已有文献报道，在培训过程中或在实验性注射液中加入药理学试剂（如NMDA、P物质和利多卡因），可更快速地提示注射是否成功9,11,24。若考虑使用这些试剂，必须评估其与基因治疗载体的相容性。

讨论

腰椎鞘内注射是一种快速且微创的手术方法，可将基因治疗载体可靠地递送至脑脊液（CSF），用于治疗中枢神经系统疾病5,6。该操作具有转化应用价值，本文所述方案详细介绍了如何在小鼠和大鼠（从新生个体到成年个体）中实施该给药途径。为帮助研究人员推广应用这一基因治疗给药方法，有必要针对所有年龄段的小鼠和大鼠明确该操作方案，并提供配套的视频支持。本实验室的经验表明，该方案在不同操作人员和长期研究中均能实现稳定一致的实施效果18,25,26,27,28,29,30。

在幼龄与成年小鼠/大鼠中进行腰椎鞘内注射时存在重要差异，最显著的是针头插入脊柱的角度以及推荐的注射体积。文献报道的腰椎鞘内注射体积在不同研究和不同物种间差异较大31。注射体积的选择至关重要，以避免颅内压（ICP）持续升高，后者可能影响脑脊液（CSF）和脑血流，引起不适，并导致慢性神经系统并发症，包括脑积水、缺血、细胞损伤甚至死亡32,33。ICP由脑脊液量、脑血容量和中枢神经系统（CNS）组织体积共同决定，无法直接与体重相关联。在正常生理状态下，ICP受多种因素自动调节，包括脑脊液量、脑血容量、呼吸、体位、脑脊液生成速率以及脑脊液向血液中的引流速率33,34。因此，鞘内注射体积应依据脑脊液特性（表1）而非体重来确定25,27,28,30。各物种在不同年龄阶段推荐的注射体积已在文中以粗体标出。

IT 注射体积成年脑脊液参考值
P0-1 (µL)P5-7 (µL)P10 (µL)>P21 (µL)总体积 (µL)生成速率 (µL/min)更新时间 (h)颅内压 (mm Hg)
小鼠355-105-2030-4025,300.32-0.3525,301.7-225,305.0 +/- 0.528
大鼠55-1010-3010-200 (20-75)150251.7-2.8252-2.66258.6 +/- 1.7,27

表1：不同年龄小鼠和大鼠腰段鞘内注射体积汇总。 加粗数值为推荐用量，已证实可安全给药。最大可能注射体积尚未经过系统评估。表中还列出了小鼠和大鼠脑脊液相关参数（包括总量、生成速率、更新率和颅内压）的已知信息，以供参考。

目前该领域对于一次性脑池内注射（IT注射）体积的上限仍缺乏明确的认识。在脑脊液（CSF）容积已知的成年人类、大鼠和小鼠中，总脑脊液容积增加30%似乎不会引起慢性损伤或疾病31,33,35,36。然而，由于幼年或新生小鼠的脑脊液容积尚不明确，无法进行类似的推算。一些研究团队正开始关注年轻动物的脑脊液容积及其生成情况37。在相关领域的进一步研究获得充分验证之前，注射体积仍需依据研究者报告的数值来确定。

小鼠和大鼠，尤其是在较年轻时接受处理或注射体积较大时，可能会出现肌肉屈曲、肢体伸展、呼吸急促或暂时性后肢瘫痪，这些症状通常应在数分钟内自行缓解。在极端情况下，急性颅内压升高可导致心血管和呼吸系统异常，可能致命32,33。如果任何术后异常持续超过24小时，应将小鼠/大鼠退出实验并实施人道安乐死。若针头插入过深，影响脊髓，可能导致持续性后肢瘫痪。这通常是由于执行腰段鞘内注射时的一个常见错误所致：在尾部弹跳反应出现后，继续推动注射器活塞的同时移动了注射器。应避免注射器和针头的移动。如果初次穿刺未能达到正确位置，可在同一位置再次尝试一次。若第二次尝试仍不成功，可调整针头位置，对准下一个椎间隙进行穿刺。需注意，多次针刺可能导致后续成功注射的药液外漏。

掌握腰段鞘内注射技术需要一定时间。为将注射操作作为终末性实验步骤进行练习，可按照上述方案使用经批准的染料溶液，例如伊文思蓝或0.2微米滤过的McCormick绿染料（图3），也可使用代表性结果部分所述的药理学试剂。建议使用染料进行练习，以便排查问题并熟练掌握注射技术，因为注射成功或失败可在1分钟内明确判断。染料练习仅适用于非存活性实验，因为当染料直接注入中枢神经系统时，动物可能出现不良反应。该反应可在成功注射后1分钟内发生，表现为剧烈搔痒和扭动。一旦观察到此类反应，应立即对动物实施安乐死，以尽量减少其不适。成功注射染料后，染料将局限在脊柱内（周围邻近外周组织无染料扩散），并沿脊髓上行至小脑、大脑和嗅球。在出生后第1天（P1），皮肤足够透明，可在尾部观察到染料沿脊柱下行。若数分钟内染料未到达脑部，则视为注射失败。

脑形态学分析，比较解剖学，绿色染色的脑标本，实验室研究。
图 3：成功实施腰椎鞘内注射后脑组织中的 McCormick 绿色染料。所有脑组织均来自 P21 小鼠，每只小鼠注射 5 µL 染料，图像显示为腹侧面观。请点击此处查看该图的高清版本。

有关临床前试验设计中相关参数（如病毒滴度和剂量）的更多信息，请参见先前发表的综述3,6,31。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢德克萨斯大学西南医学中心AAV病毒载体核心设施提供了AAV9载体，并感谢Gray实验室的研究科学家Yuhui Hu对图2中所示组织进行处理和染色。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 微米滤膜电子显微镜科学公司67005用于过滤染料溶液
0.5 到 10 µL 移液管EppendorfTI13690026用于测量注射溶液
1.5 mL 微量离心管Eppendorf22364111用于储存注射溶液
10 µL型注射器Hamilton7635-01注射体积不应小于注射器容量的10%
10 到 100 µL 移液管EppendorfTI13690029用于测量注射溶液
10µ移液器吸头USA Scientific 公司11203810用于测量注射溶液
100 µL 型注射器Hamilton7638-01对于大鼠 >仅限21号。注射体积不应小于注射器容量的10%
100 µL 吸头USA Scientific 公司11231840用于测量注射溶液
25 µL型注射器Hamilton7636-01适合5-10人 µL 注射。注射体积不应小于注射器容量的10%
27 号针头Hamilton7803-01大鼠 >仅限21号。27G，小柄RN针头，1英寸，4型针尖，12支装°，6/丙酮酸激酶
30 号针头Hamilton7803-1730 号，小针座 RN 针头，0.5 英寸，4 型针尖，每包 12 个°，6/丙酮酸激酶
50 µL型注射器Hamilton7637-01对于大鼠 >仅限21号。注射体积不应小于注射器容量的10%
70% 乙醇Pharmco111000140用于消毒工作区域和设备
70%异丙醇消毒垫PDIB60307用于准备注射部位
镇痛剂对于大鼠 >仅限21。
麻醉剂（异氟烷）Piramal Critical Care66794001725对于大鼠 >仅限21。
聚维酮碘普渡产品6906606对于大鼠 >仅限21号。用于皮肤准备
对照溶液注射液
染料溶液（绿色）麦科伊密克仅用于练习，不涉及存活实验
手套Kimberly-Clark19-149-863B个人防护装备
装有冰块的冰桶Fisher Scientific03-395-150将病毒载体溶液置于冰上保存 
蚊式止血钳（弯型或直型）Fine Science Tools13009-12对于大鼠 >仅用于触诊椎间隙。
持针器精细科学工具12002-12对于大鼠 >仅用于皮肤缝合。
纸巾伯克希尔18-998-123用于在注射过程中固定成年小鼠
ParafilmStatLabPM996用于将溶液吸入注射器
牵开器斯托尔廷52124P对于大鼠 >仅用于保持皮肤切口开放
手术刀片Fine Science Tools10015-00对于大鼠 >仅用于切口
手术刀片刀柄Fine Science Tools10003-12对于大鼠 >仅用于切口
无菌注射器Fisher Scientific14-955-459用于过滤染料溶液
外科洗手（皮肤准备）Medline Industries Inc.MDS098720对于大鼠 >仅限21号。用于皮肤准备
缝合线或伤口夹斯托尔廷50483对于大鼠 >仅用于皮肤缝合。
注射器/针头清洗液Hamilton18311可使用替代清洗液
镊子Fine Science Tools11019-12对于大鼠 >仅限21号。手术入路及关闭全程使用
载体溶液注射液

参考文献

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects. Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  3. Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders. Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).
  4. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).
  5. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
  6. Chen, X., et al. Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration. Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).
  7. Corning, J. L. Spinal anesthesia and local medication of the cord. NY Med. J. , 483-485 (1885).
  8. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: A new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  9. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  10. Choi, S. E., et al. High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery. J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).
  11. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. 144, e58565(2019).
  12. Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice. J Vis Exp. 85, e51229(2014).
  13. Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31(2010).
  14. Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).
  15. Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).
  16. Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. 205, e66463(2024).
  17. Lu, X., Jiang, Y. H. Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery. J Vis Exp. 205, e65761(2024).
  18. Chen, X., et al. Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies. J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).
  19. Deschenes, N. M., et al. Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis. Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).
  20. Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice. Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).
  21. Kagiava, A., et al. Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).
  22. Wong, H., et al. CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice. JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).
  23. Laoharawee, K., et al. Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer. Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).
  24. Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice. Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).
  25. Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).
  26. Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies. Brain Res. 1739, 146832(2020).
  27. Chen, X., et al. AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease. J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).
  28. Karumuthil-Melethil, S., et al. Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant. J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).
  29. Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).
  30. Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice. Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).
  31. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application. Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).
  32. Allen, C. H., Ward, J. D. An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure. Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).
  33. Belov, V., et al. Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications. Front Neurosci. 15, 604197(2021).
  34. Moazen, M., et al. Intracranial pressure changes during mouse development. J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).
  35. Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection. N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).
  36. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).
  37. Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation. Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).

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