利用 Thermal Shift 分析探测底物与 Selenoprotein O 的结合

摘要

在这里，我们介绍了热位移测定，这是一种基于荧光的高通量技术，用于研究小分子与目标蛋白质的结合。

摘要

定义功能未知的蛋白质的生物学重要性对理解细胞过程构成了重大障碍。尽管生物信息学和结构预测有助于未知蛋白质的研究，但 体外 实验验证经常受到生化活性所需的最佳条件和辅因子的阻碍。辅因子结合不仅对某些酶的活性至关重要，而且还可能增强蛋白质的热稳定性。这种现象的一个实际应用在于利用热稳定性的变化（通过蛋白质熔解温度的变化来衡量）来探测配体结合。

热位移测定 （TSA） 可用于分析不同配体与目标蛋白质的结合，或找到稳定条件以进行 X 射线晶体学等实验。在这里，我们将描述一种利用假激酶硒蛋白 O （SelO） 的 TSA 方案，用于一种用于测试金属和核苷酸结合的简单且高通量的方法。与经典激酶相反，SelO 以倒置方向结合 ATP，以催化 AMP 在称为蛋白质 AMPylation 的翻译后修饰中将 AMP 转移到蛋白质的羟基侧链。通过利用熔解温度的变化，我们提供了对 SelO 功能背后的分子相互作用的重要见解。

引言

许多人类蛋白质组的表征仍然很差。Dunham 和 Kustatscher 等人描述的"路灯效应"是指广泛研究的蛋白质受到更多关注而忽视研究不足的蛋白质的现象 ^1,2。导致这种效果的因素包括某些蛋白质的生物学重要性和疾病相关性。此外，提供基础知识的先前研究以及功能分析工具的可用性进一步刺激了对高度研究的蛋白质的研究 ^1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium 和 Enzyme Function Initiative 等项目旨在使用结构和功能蛋白质组学来表征研究不足的蛋白质 ^2,3,4。鉴定研究不足的蛋白质的分子功能的补充方法是检查这些蛋白质与小分子的相互作用，以获得对调节和底物特异性的宝贵见解。

小分子的结合可以增加蛋白质的热稳定性⁵.这种现象称为配体诱导的构象稳定，通常会导致蛋白质的熔解温度升高，从而提供配体结合的可测量指示⁶。蛋白质的热稳定性可以使用差示扫描荧光法 （DSF）（也称为 Thermofluor）或热位移法 （TSA）7,8,9,10 进行测量。在 TSA 中，蛋白质样品在环境敏感染料存在下经受升高的温度⁶。随着蛋白质的展开和变性，染料与蛋白质暴露的疏水区域结合并发出荧光。外源性荧光染料或环境敏感染料缺乏内源荧光，而是在与目标分子相互作用时发出荧光 ^9,11,12。最常用的染料 SYPRO Orange 具有多种优势，例如增强的稳定性和最小的背景荧光 ^8,9,12。值得注意的是，SYPRO Orange 的激发波长和发射波长分别约为 470 nm 和 570 nm，因此与实时聚合酶链反应 （RT-PCR） 系统兼容。这一独特功能可实现高通量、准确和灵敏的测量，与 RT-PCR 系统中常用的荧光检测系统兼容⁸。

TSA 是一种多功能工具，用于研究蛋白质与潜在辅因子或药物的相互作用，以及确定晶体学的稳定条件。与其他筛选方法相比，它的一些优点是设置相对简单，并且 96 或 384 孔板的通量高 13,14,15。该技术的发展对药物发现研究具有变革性作用，为离子、配体和药物等各种添加剂的研究提供了便利 ^6,16。此外，TSA 的适应性鼓励科学家扩大其用途，促进结合亲和力的测量以及筛选测定^17,18。TSA 是结构生物学研究中的一种有效工具，用于确定促进目标蛋白质稳定以结晶的条件¹⁹。因此，它的灵活性和相对简便性使 TSA 成为表征蛋白质的基础技术。在这里，我们将使用 TSA 来分析金属和核苷酸与研究不足的假激酶硒蛋白 O （SelO） 的结合，例如。

激酶是药物发现中最具靶向性的蛋白质家族之一²⁰。预计大约 10% 的人类激酶是无活性的，并被命名为假激酶，因为它们缺乏催化所需的关键催化残基^21,22。硒蛋白 O （SelO） 是一种进化上保守的假激酶，在催化 HRD 基序中缺乏保守的天冬氨酸²³。在真核生物中，SelO 定位于线粒体并保护细胞免受氧化应激^24,25。结构和生化分析表明，SelO 通过称为 AMPylation 的翻译后修饰将单磷酸腺苷 （AMP） 从 ATP 转移到蛋白质底物²⁵。最近的研究表明，催化 AMPylation 的酶可能在体外结合替代核苷酸，例如 UTP ^26,27。值得注意的是，研究表明，来自鼠伤寒沙门氏菌的 SelO 同源物以锰依赖性方式催化蛋白质 UMPylation 或 UMP 的转移²⁸。鉴于这些有趣的观察结果，我们在镁和锰存在下测试 SelO 与 ATP 和 UTP 的结合，作为 TSA 应用的代表性示例。以下方案可以很容易地进行调整，以优化和检查其他目标蛋白质和添加剂的相互作用。

方案

1. 实验设置

1. 使用可以检测荧光的热循环仪（例如 RT-PCR 仪器）执行所述方案。如果使用 SYPRO Orange，如本协议所述，请使用允许 470 nm 左右激发和 570 nm 附近发射检测的扫描模式。对热循环仪进行编程，使样品在 20 °C 下保持 2 分钟，然后将温度升高 0.5 °C/1 分钟至 95 °C;每 1 °C 测量一次荧光强度。
   注:我们建议在循环结束时执行一个可选步骤，将样品块返回到 20 °C（图 1）。
2. 每个反应包含四个组分:缓冲液、目标蛋白、添加剂和外源性荧光染料。设计实验以包括对照，例如无蛋白质、无染料、无添加剂的蛋白质和单独的添加剂，以确定可能影响结果解释的任何背景荧光。如果可用，包括阳性对照，例如已知可结合和稳定目标蛋白质的添加剂。
3. 使用纯化的蛋白质进行检测。为了遵循这个例子，使用大肠杆菌 SelO，如前所述表达和纯化^25,29。简而言之，在 Rosetta DE3 细胞中表达 His 相扑标记的 SelO （大肠杆菌 SelO ppSumo），并使用 Ni²⁺-NTA 亲和力对其进行纯化。使用 Ulp 蛋白酶切割 His-sumo 标签，并通过凝胶过滤色谱进一步纯化 SelO。
4. SYPRO Orange 的荧光将取决于其与目标蛋白的相互作用。由于这些相互作用会因蛋白质而异，因此优化蛋白质和染料浓度以获得荧光信号的最大信噪比。
   注:SYPRO Orange 与某些蛋白质和添加剂（如去污剂^11,30）不兼容。如有必要，可以筛选 ¹² 中列出的其他外源性染料。

2. 确定最佳染料浓度（图 2A）

1. 从储备溶液中制备 20 μL 50x、40x、30x、20x 和 10x SYPRO Orange 稀释液，该储备液在 DMSO 中以 5,000x 提供。
2. 将 8 μL 在 TSA 缓冲液中稀释的 6.25 μM 蛋白质分配到 384 孔 PCR 板的六个独立孔中。
   注:在我们的示例中，我们使用以下 TSA 缓冲液进行稀释:10 mM Tris pH 8、150 mM NaCl 和 1 mM DTT。样本可以一式三份运行，以提高结果的可靠性。
3. 向每个孔中加入 1 μL TSA 缓冲液。
   注:在优化染料和蛋白质浓度后，该体积的缓冲液将被添加的小分子代替。
4. 向每个孔中加入 1 μL SYPRO Orange 染料溶液的每种系列稀释液。向最终孔中加入 1 μL 不含染料的缓冲液，用于无染料对照。
5. 用光学透明胶膜覆盖板。
6. 在配备 PCR 板适配器的离心机中以 1,000 × g 的离心机短暂旋转板 1 分钟。
7. 将板放入 RT-PCR 机器中，然后开始步骤 1.1 中描述的热循环方案。

3. 最佳蛋白质浓度的测定（图 2B）

1. 使用 TSA 缓冲液（10 mM Tris pH 8、150 mM NaCl 和 1 mM DTT）制备 20 μL 25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM 和 1.56 μM 蛋白质的连续稀释液。
2. 将 8 μL 连续稀释的蛋白质分配到 384 孔板的 5 个独立孔中。
3. 仅在^{第 6 个} 孔中分配缓冲液作为无蛋白对照。
4. 向每个孔中加入 1 μL TSA 缓冲液。
   注:在优化染料和蛋白质浓度后，该体积的缓冲液将被添加的小分子代替。
5. 向每个孔中加入 1 μL 每种 50x SYPRO Orange 染料溶液。
6. 用光学透明胶膜覆盖板。
7. 在配备 PCR 板适配器的离心机中以 1,000 × g 的离心机短暂旋转板 1 分钟。
8. 将板放入 RT-PCR 机器中，然后开始步骤 1.1 中描述的热循环方案。

4. 设置 TSA 实验（图 3A）

注:优化蛋白质和 SYPRO Orange 染料浓度后，可以通过添加所需的小分子来进行测定以分析结合。

1. 通过考虑仿行和适当的控制来定义条件的数量。
   注意:例如，我们将一式三份测试 SelO 与 8 个条件的结合。包括对照（无添加剂、无蛋白质和无染料），我们有 11 个反应 x 3（一式三份）= 总共 33 个反应。
2. 根据观察到的 SelO 蛋白质和染料的最佳浓度，确保每个反应含有 8 μL 的 6.25 μM 蛋白质、1 μL 添加剂和 1 μL 的 50x SYPRO Orange 染料，总反应体积为 10 μL。因此，使用的最终浓度为 5 μM 蛋白质和 5x SYPRO Orange 染料。
3. 使用 TSA 缓冲液制备 288 μL 的 6.25 μM 蛋白质溶液。该体积的蛋白质工作溶液占 36 个反应（33 个反应，另外 10% 用于移液变化）。
4. 将 8 μL 6.25 μM 蛋白质分配到 384 孔板的单独孔中。仅为无蛋白对照分配缓冲液。
5. 加入 1 μL 10 倍浓度的小分子，以达到最终的 1 倍浓度。要遵循本例，添加 1 μL 20 mM MgCl₂ ，使终浓度达到 2 mM。仅针对无添加剂控制分配缓冲液。
6. 向每个孔中加入 1 μL 每种 50x SYPRO Orange 染料溶液。
7. 用光学透明胶膜覆盖板。
8. 在配备 PCR 板适配器的离心机中以 1,000 × g 的离心机短暂旋转板 1 分钟。
9. 将板放入 RT-PCR 机器中，然后开始步骤 1.1 中描述的热循环方案。

5. 数据分析

1. 从 RT-PCR 机器导出相对于温度 （°C） 的相对荧光单位 （RFU） 的数据。
2. 使用所选软件提取和绘制数据点，直至每条熔解曲线测得的最高强度。重要的是，确认无蛋白和无染料对照表现出低背景荧光，而荧光没有温度依赖性增加（图 3A、B 和 补充表 S1）。使用可免费访问的软件（如 MoltenProt³¹ 或 DSFWorld³²）进行数据分析。
3. 使用数据的 Boltzmann Sigmoidal Fit 确定熔解温度。熔解温度 （T_m） 定义为观察到 50% 变性或一半最大强度的温度（图 3C）。
4. 熔融曲线的热变化可能表明添加剂稳定或不稳定。要计算熔融温度 （T_m） 的变化，请使用以下公式: T_m = T_m 添加剂 _- T_m 缓冲液。正值描述稳定条件或相互作用的添加剂;负值描述不稳定的情况（图 3D）。

结果

真核生物 SelO 由一个 N 末端线粒体靶向序列、一个激酶样结构域和位于蛋白质 C 端的高度保守的硒代半胱氨酸组成²³。这种线粒体驻留酶编码一个假激酶结构域，该结构域从细菌到人类都是保守的²³。来自丁香假单胞菌的 SelO 同源物的结构分析揭示了活性位点的氨基酸改变，与经典激酶相比，这些改变促进了 ATP 以倒置方向结合²⁵。因此，SelO 催化参与抗氧化信号转导的多种蛋白的 AMPylation，而不是磷酸化，以保护细胞免受氧化损伤和细胞死亡²⁵。除 AMPylation 外，一些原核和真核 AMPylase 已被证明可催化 UMPylation^27,28。

我们在 TSA 中使用纯化的重组大肠杆菌 SelO 来检测在二价阳离子存在下 ATP 和 UTP 核苷酸与 SelO 的结合。与经典激酶类似，SelO 含有 DFG 基序，其中天冬氨酸结合金属离子以协调活性位点中的核苷酸。首先，我们优化了蛋白质和染料的浓度，以便在 TSA 中进行稳健的荧光测量，确定 5 μM 至 10 μM 大肠杆菌 SelO 与 5x SYPRO Orange 一起是最佳选择（图 2）。此外，我们表明无蛋白以及无染料对照具有低荧光信号，对温度升高没有反应。我们检测到在 ATP-Mg²⁺ 和 ATP-Mn²⁺ 存在下，大肠杆菌 SelO 的热稳定性分别增加了大约 +4 °C 和 +12 °C（图 3）。然而，在与 UTP 孵育后，我们没有观察到热稳定性的变化，这表明大肠杆菌 SelO 可能不会表现出与 UTP 的可检测结合。

图 1:热循环仪设置。 在使用 FRET 通道测量 SYPRO Orange 荧光时，用于将样品温度提高 +0.5 °C/min 的热循环仪程序示例。该建议还包括在方案开始和结束时进行环境温度孵育。缩写:FRET = Förster 共振能量转移。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:蛋白质和染料浓度的优化。（A） 使用 5 μM 大肠杆菌 SelO 优化 SYPRO Orange 染料浓度的代表性结果。 （B） 使用 5x SYPRO Orange 染料优化 大肠杆菌 SelO 浓度的代表性结果。热变性曲线描述了相对于温度（x 轴）的相对荧光单位（y 轴）。结果表示一式三份孔的平均 SD ± （n = 3）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:在核苷酸和二价阳离子存在下 SelO 的热变性曲线和 ΔT_m 分析。（A） 从 RT-PCR 机器导出并绘制的样品（在 200 μM ATP 或 UTP 和 2 mM 二价阳离子、5x SYPRO Orange 存在下，5 μM 大肠杆菌 SelO）的热变性曲线的原始数据。SelO ATP-Mg 代表含有 SelO、ATP 和 MgCl₂ 的样品，SelO ATP-Mn 代表含有 SelO、ATP 和 MnCl₂ 的样品，SelO UTP-Mg 代表含有 SelO、UTP 和 MnCl₂ 的样品，SelO UTP-Mn 代表含有 SelO、UTP 和 MnCl₂ 的样品。请注意，无染料和无蛋白对照表现出低荧光。结果表示一式三份孔的平均 SD ± （n = 3）。（B） 绘制到最高强度的热变性曲线，并与玻尔兹曼 S 形方程拟合。尽管 SelO 的热变性不受 UTP 的影响，但我们观察到在 ATP 存在下热变性发生显着变化（紫色曲线）。结果表示一式三份孔的平均 SD ± （n = 3）。（C） 描述从图 3B 中表示的数据的玻尔兹曼 S 形拟合得出的 T_m 值的直方图。结果表示一式三份孔的平均 SD ± （n = 3）。SelO 39.2 °C ± 0.085，SelO ATP-Mg 43.3 °C ± 0.133，SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085，SelO UTP-Mg 39.1 °C ± 0.056，SelO UTP-Mn 39.9 °C ± 0.087。（D） 描述熔解温度 ΔT_m 变化的直方图（T_m 添加剂 _- T_m 缓冲液）。请单击此处查看此图的较大版本。

补充表 S1:在金属和核苷酸存在下 SelO 的 TSA 示例数据。 从 RT-PCR 机器导出的原始数据的电子表格，以及按照协议步骤 5.1 和 5.2 中所述在最大 RFU 强度后删除值的数据处理。 请点击此处下载此文件。

讨论

热位移测定 （TSA） 是筛选蛋白质-配体相互作用的有效方法，包括与辅因子和抑制剂的相互作用。在该方案中，我们使用 TSA 来测量假激酶 SelO 与核苷酸和二价阳离子的结合。我们的研究结果表明，SelO 在 ATP 和 Mg²⁺/Mn²⁺ 存在下表现出更高的热稳定性。这一观察结果与之前的报告一致，表明来自大肠杆菌、酿酒酵母和智人的 SelO 同源物催化 AMP 从 ATP 转移到蛋白质底物的羟基侧链^25,29。尽管 TSA 为核苷酸结合提供了有价值的见解，但它可能无法识别体内底物。其他分子，不仅仅是底物，也会影响蛋白质的热稳定性。为了准确鉴定底物，必须考虑细胞浓度和结合亲和力等因素。尽管如此，TSA 是使用热稳定作为读数来筛选大量条件（例如小分子结合）的出色工具。

TSA 的用途不仅限于分析小分子与蛋白质活性或调节位点结合的应用。TSA 通过提供稳定条件使蛋白质更有利于晶体学实验，为蛋白质的生物物理表征做出了重大贡献。值得注意的是，TSA 具有多项优势，包括使用常用实验室材料（如 PCR 板和 RT-PCR 机）的简单设置和高通量能力。这些优势允许测试许多条件，这些条件可能无法使用其他技术进行，或者无法直接使用。多项研究使用 TSA 测量重组蛋白的热稳定性和化合物库，以确定蛋白质结晶的最佳条件^19,33。

包括适当的对照是必要的，以避免对熔解曲线的误解，因为板或添加剂的自发荧光是一个常见的问题。TSA 可能不适用于表现出自发荧光或淬灭 SYPRO 橙色荧光的化合物。一种潜在的解决方案是筛选 ¹² 中描述的替代染料。此处概述的 TSA 方案可以很容易地适用于其他感兴趣的蛋白质和添加剂。添加剂不仅限于水溶性化合物，正如我们的核苷酸和二价阳离子实验方案所证明的那样。相反，添加剂可以涵盖多种条件，例如不同的 pH 值、配体或溶解在 DMSO⁸ 中的药物。此外，配体与蛋白质的预孵育可以通过减少染料的干扰和伪影来提供更可重复的结果。脂质和去污剂等添加剂由于与 SYPRO Orange 相互作用，可能会导致高荧光。 图 3A 显示了变性曲线的一个例子，它描述了蛋白质热变性后低背景荧光与荧光的显着增加配对。染料和蛋白质的最佳浓度将产生最大的信噪比，同时在重复中保持一致的荧光信号。

TSA 具有组件最少、简单性的优势，从而减少了用于优化的变量数量。关键步骤包括确定染料和蛋白质的最佳浓度。需要注意的是，TSA 需要纯化的、"表现良好"的蛋白质。蛋白质和添加剂在缓冲液中必须以 TSA 中使用的浓度保持稳定。容易聚集或寡聚化的蛋白质或条件可能会导致错误的荧光读数。聚集或未折叠的蛋白质最初可能表现出高荧光，变性后仅略有增加。蛋白质的寡聚化也会导致多种过渡状态，使分析复杂化¹⁰。可以微调蛋白质的浓度以防止聚集。

TSA 与多种缓冲液和盐兼容，可优化蛋白质和添加剂的稳定条件¹¹。可以调整蛋白质和添加剂溶液的体积，以克服蛋白质和添加剂浓度的限制。例如，可以使用较低浓度的添加剂（如 5x）来代替代表性结果中使用的 10x 溶液。值得注意的是，由于 384 孔 PCR 板可容纳低至 10 μL 的总样品体积，因此进行检测所需的蛋白质和添加剂的相对量较低。

鉴于 TSA 的优势，它是研究未充分研究的蛋白质（如假激酶）的理想选择。假酶是催化性无活性蛋白，在结构上与活性酶同源³⁴。最近的结构和生化研究表明，一些假酶是活性酶，而大多数具有非催化功能^35,36。虽然催化无活性，但假酶与各种疾病有关，并发挥重要作用，包括支架和变构调节³⁷。然而，许多假酶的作用机制和功能意义尚不清楚。一些假酶的活性受配体结合的调节，这导致与蛋白质构象变化相关的热稳定性增加¹⁴。我们提出 TSA 是一种有价值的工具，用于检查配体与假酶的结合以确定功能活性的最佳配体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷 5′-三磷酸二钠盐水合	Sigma Aldrich	A2383-10G	用于代表性结果，但不需要执行 TSA
Avanti J-15R，带微孔板载体组件	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 实时荧光定量 PCR 系统	Bio-Rad	12011452
硬壳 384 孔 PCR 板，薄壁，裙边，透明/白色	Bio-Rad	HSP3805
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266-100G	用于代表性结果，但不需要执行 TSA
氯化锰 （II） 四水合物	Sigma Aldrich	M3634-500G	用于代表性结果，但不需要执行 TSA
Microseal 'B' PCR 板密封膜、粘合剂、光学	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO 橙色蛋白质凝胶染色	Sigma Aldrich	S5692-500UL
尿苷 5′-三磷酸三钠盐水合	Sigma Aldrich	U6625-100MG	用于代表性结果，但不需要执行 TSA