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体内可视化受精及早期发育过程中的钙瞬变 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/67141

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2024年7月12日

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1Florida Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了利用在模式线虫C. elegans生殖系中表达的遗传编码钙离子探针，对受精过程及早期胚胎发育中钙离子动态进行可视化观测的实验方案与工具。

摘要

钙是卵母细胞向胚胎转换（OET）及早期胚胎发育过程中的重要信号分子。这种雌雄同体的线虫 秀丽隐杆线虫 为研究卵子发生过程（OET）提供了若干独特优势，因其具有透明性且拥有结构有序的性腺，可在20 °C下每约23分钟产生一个成熟卵母细胞。我们对基因编码的钙离子指示剂jGCaMP7s进行了改造，使其能够在活体生物中通过荧光信号标示受精发生的瞬间。我们将该报告系统命名为 "CaFE" 受精过程中钙的变化 秀丽隐杆线虫CaFE 报告基因 单拷贝整合到安全港位点，对生理和繁殖力无显著影响，并在受精后产生强烈的信号。本文介绍了一系列利用CaFE报告系统作为 体内 用于研究卵子排出和胚胎发生的工具。我们提供了同步线虫、检测RNA干扰敲低效应、制备线虫用于成像以及可视化卵母细胞和胚胎中钙信号的方法。此外，我们还介绍了构建额外线虫品系的方法，以辅助此类分析。通过展示CaFE报告系统在可视化受精时间中的应用价值，我们报道了双排卵现象发生在 ipp-5 被RNAi靶向，且只有第一个卵细胞会立即受精。此外，本文报道了在早期胚胎发育过程中存在单细胞钙瞬变，表明CaFE报告系统可持续至早期发育阶段。重要的是，线虫中的CaFE报告系统操作简便，可适用于本科课程整合型科研实验（CURE）教学。结合线虫有序的生殖腺结构及其易于进行RNAi的特点，CaFE报告系统有助于探究调控体内受精及早期胚胎发育所需的细胞间动态相互作用。

引言

受精标志着新生命周期的开始，但要准确定义受精的精确时刻却具有挑战性。受精的一个保守特征是精子与卵细胞融合后，卵细胞内立即出现一次钙离子波动1。尽管钙离子波动的特性（如频率和速度）在不同物种间存在差异，几乎所有生物在受精后都会表现出细胞内钙离子浓度的短暂升高。钙离子波动在阻止多精入卵、卵细胞激活以及其他重要细胞事件中发挥关键作用2。由于钙离子波动起始于精子融合的位点，因此钙离子可作为受精发生的标志3。

Caenorhabditis elegans 是研究早期发育的理想模式生物。这种线虫为透明的雌雄同体，具有良好的遗传可操作性4。对于受精研究而言，最重要的是，C. elegans 成虫利用结构高度有序的性腺持续产生卵母细胞5。事实上，在成虫期，体细胞已退出有丝分裂，因此卵母细胞是唯一新生成的细胞6。图1 展示了性腺结构，其由两条对称的U形管状结构组成，内含处于不同发育阶段的卵母细胞。最靠近受精囊（精子储存器官）的卵母细胞称为-1期卵母细胞。这种类似流水线的性腺结构在20 °C条件下，每隔约23分钟就会将一个成熟卵母细胞排入受精囊7。新受精的胚胎随后进入共用的子宫，最终通过单一的阴门产出体外。

以往在C. elegans中观察受精过程中钙信号的技术依赖于显微注射钙离子敏感性染料3,8。为了更方便地观察精卵融合时的钙波，研究人员利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，将基于jGCaMP7s的遗传编码钙离子探针以单拷贝形式插入到基因组安全位点7,9。该报告系统被命名为CaFE，即秀丽隐杆线虫（C. elegans）受精过程中的钙信号检测系统。该报告系统在生理功能或繁殖力方面均未表现出显著缺陷。

本文介绍了利用CaFE报告系统对秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵母细胞和胚胎中的钙波进行可视化观察的实验方案。结合线虫研究领域已有的多种工具，如RNA干扰（RNAi）技术和mCherry标记的性腺示踪剂，CaFE报告系统有助于深入研究体内受精过程的调控机制，特别是受精能力的获得以及受精时机的控制。此外，CaFE报告系统在早期胚胎发育阶段仍可持续表达，是研究胚胎发生的独特工具。

方案

1. C. elegans 的培养与维持

  1. 线虫生长培养基（NGM）平板制备
    1. 将3 g氯化钠（NaCl）、2.5 g蛋白胨（Bacto-Peptone）、20 g琼脂与1 L去离子水加入4 L烧瓶中（见 材料表）。在高压灭菌前用铝箔覆盖烧瓶口。
    2. 高压灭菌，采用液体灭菌循环程序进行灭菌。灭菌循环设定为 121 °C 建议持续30分钟。
    3. 让混合物冷却至约~50 °C室温下约20分钟。
    4. 加入 25 mL 无菌的 1 M KH2PO4 （溶于水，pH = 6），1 mL 无菌 1 M CaCl₂2 （溶于水），1 mL 无菌 1 M MgSO₄4 （溶于水），以及1 mL 5 mg/mL胆固醇（溶于100%乙醇），每次加入后轻轻涡旋混匀（参见 材料表).
    5. 采用无菌操作技术，将部分混合物转移至无菌的 300 mL 烧杯中，以便倾倒。将温热的培养基倒入培养皿，覆盖皿底即可。
      注意：每个 60 mm × 15 mm 无菌培养皿中加入约 10 mL（参见 材料清单）可制备100个培养皿。或者可使用35 mm × 10 mm无菌培养皿，每皿约4 mL，可制备约250个培养皿。
    6. 让NGM平板在室温下干燥至少1天，然后接种细菌。将平板倒置存放于 4 °C 以备将来使用。
  2. OP50 细菌菌苔制备
    1. 在2 L的烧瓶中，将5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、5 g NaCl与1 L去离子水混合，制备LB培养基（见 材料表使用磁力搅拌器和搅拌子搅拌，直至完全溶解。
    2. 将LB培养基分装至瓶子中，使用液体灭菌循环程序进行高压灭菌。灭菌程序设定为 121 °C 建议持续 30 分钟。若使用带螺旋盖的容器，应在灭菌循环期间将螺旋盖松开四分之一圈，以确保适当通风。
    3. 待使用前，使肉汤冷却至室温。
    4. 使用 无菌操作，取50 mL LB培养基加入250 mL锥形瓶中，接种OP50细菌，37℃过夜培养 37 °C 振荡条件下。
    5. 使用 无菌技术，转移 300 μL 将饱和培养物点样于60 mm × 15 mm NGM平板中央。对于35 mm × 10 mm平板， 100 μL 建议使用饱和培养物。
    6. 让培养皿在室温下干燥1-3天，直至OP50细菌菌斑不再呈液态。使用前确保培养皿完全干燥且无污染。将培养皿储存于 4 °C 以备后续使用。将培养皿倒置存放可减少皿表面的冷凝现象。
  3. 线虫挑取工具的制作
    1. 松开蠕虫挑取器手柄头部的银色卡箍（参见 材料表通过轻轻拧开，使四个部分分离。
    2. 剪取约1.5英寸（约拇指长度）的铂丝（参见 材料清单用剪刀剪下一段，并将其放置在四个部分的中央；约一英寸的部分将从手柄中伸出。
    3. 在拧紧套环时，用手固定导线的中心位置；四个部分将在中间聚拢，从而将铂丝固定到位。
    4. 使用平口钳仔细将金属丝弯成彩虹形或弧形，这种形状通常最适合用于挑取。
    5. 创建约2-3 mm "足" 用平口钳反复夹紧导线末端。使用此方法 "足" 挑取线虫并保持 "足" 与培养板表面保持平齐。
      注意：夹持过紧会切断铂丝。使用平口镊子（或类似工具）时，避免产生尖锐边缘，以防刺破线虫或培养板。
  4. 线虫操作
    1. 像握铅笔一样握住线虫接种针，并进行灭菌处理 "足" 将金属丝置于95%乙醇灯火焰中灼烧，直至呈现亮橙色。
    2. 将一块接种了OP50的平板放置在解剖显微镜的载物台上，并打开皿盖。轻轻触碰 "足" 将接种针的尖端移至细菌菌苔区域，用轻柔的涂抹动作将细菌收集到针尖底部。粘附在接种针上的细菌（称为 "goo"）将起到粘合剂的作用，用于粘取线虫。
    3. 将一皿线虫移至解剖显微镜载物台上，打开皿盖，同时避免接种针接触其他表面。迅速而轻柔地触碰 "足" 用挑虫针轻触线虫以将其挑起。该技术可实现多个线虫在培养板之间同时转移。
    4. 轻轻接触 "足" 将挑虫针转移至新培养皿的未接种区域以传递线虫；通常，此培养皿即为1.4.2节中取用细菌的同一培养皿。
    5. 在每块培养板和/或每个线虫品系之间使用前，需对挑取工具进行灭菌，以避免污染，并在灭菌后等待挑取工具冷却。
      注意：高温的挑虫针接触线虫会使其受到应激或死亡。挑虫针在接触细菌菌苔以拾取线虫后会冷却 "goo" 用于线虫转移。
  5. 维持线虫培养于 20 °C 在接种了OP50的大肠杆菌NGM平板上（步骤1.1） Escherichia coli 细菌（步骤1.2）。为避免饥饿，每周使用线虫挑取工具将数条成虫转移至新鲜培养皿（60 mm × 15 mm）传代2-3次（步骤1.3–1.4），以维持线虫种群 改变 生理学
    注意： 秀丽隐杆线虫 菌株和OP50细菌可通过秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）获得。

2. C. elegans 发育同步化

  1. 通过定时产卵法使线虫年龄同步（此处已描述）。若因教学或其他用途需要大量线虫，可按照 Golden 等人10所述方法进行次氯酸钠同步处理。
  2. 使用铂金丝挑针将成年线虫转移至新的接种 OP50 培养皿中（见第 1 节描述）。线虫数量应根据实验需求确定。第 1 天成虫每小时大约产下 3 颗卵，因此 10 条线虫在 1 小时内可产生约 30 颗卵。建议使用成虫第一天（Day 1）的线虫。
  3. 约 1 小时后，将成年线虫从培养皿中移除，仅保留卵。
    注意：意外遗留成虫是常见错误。残留的线虫会继续产卵，从而破坏同步性。在 20°C 条件下培养时，线虫从卵孵化后约 72 小时发育为第 1 天成虫。

3. 用于成像的线虫固定

  1. 成像受精事件时，应使用第1天的成虫以最大化观察机会。
    注意：在第1天的成虫中，大约每23分钟发生一次卵细胞受精。然而，随着年龄增长，排卵频率逐渐减慢，典型的雌雄同体个体通常在第4天后停止产卵。
  2. 将3 g琼脂糖加入100 mL水中，配制3%琼脂糖水溶液。使用微波炉加热琼脂糖溶液，直至琼脂糖完全溶解。若需重复使用已凝固的溶液，可加热至完全溶解后继续使用。经过数次使用后，应重新配制新鲜溶液。
  3. 将一张用于成像的空白载玻片放置在另外两张载玻片之间，这两张载玻片沿长轴方向均贴有一层实验室胶带（参见 材料清单）。胶带可作为琼脂糖垫片的间隔物，有助于实现均匀分布和一致的宽度。确保三张载玻片长边相接并排成一行：两侧为带胶带的载玻片，中间为一张空白显微镜载玻片。
    1. 滴加加热后的3%琼脂糖溶液（约100-150 μL) 使用1 mL移液器将样品滴加到用胶带固定的载玻片之间的中心位置。
    2. 迅速将一张新的载玻片放置在琼脂糖液滴上，确保新载玻片与带有琼脂糖液滴的载玻片垂直，并横跨在相邻的用胶带固定的载玻片上。
    3. 轻轻分离载玻片，避免撕裂垫片。
    4. 每天成像前需新鲜制备琼脂糖垫。建议在准备成像时制备多个琼脂糖垫，但避免同时暴露多个垫。暴露的琼脂糖垫会迅速干燥。
  4. 使用一个 20 μL 移液器，加入一小滴（~7 μL在琼脂糖垫中央加入1 mM 左旋咪唑的M9缓冲液以麻痹线虫。使用经滤膜灭菌的100 mM 左旋咪唑储备液配制1 mM 工作液。
    1. 配制 M9 缓冲液，加入 6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，1 g NH4Cl 和 1 L 去离子水置于合适的容器中（参见 材料表).
    2. 使用液体灭菌循环程序对溶液进行高压灭菌，并在使用前让溶液冷却至室温。若使用带螺口盖的容器，应将螺口盖松开约四分之一圈，以确保适当通风。灭菌循环设置为 121 °C 建议孵育30分钟。
  5. 挑选至少5条同步发育的线虫，并轻轻触碰 "足" 将所有线虫转移至左旋咪唑液滴中。每次制片至少使用5条线虫，因为线虫体位的方向可能导致肠道遮挡生殖系，从而阻碍卵母细胞中钙波的观察。
    注意：转移线虫时需迅速操作，因为若在琼脂糖垫上放置超过 5 分钟，左旋咪唑会挥发。
  6. 小心地用盖玻片覆盖琼脂糖垫。检查线虫的位置，因为盖玻片可能导致线虫从初始放置位置散开。在显微镜载玻片上标注相关信息，例如线虫品系名称（参见 材料清单).
    注意：确保在样本处理后尽快进行成像 固定线虫，因为长时间暴露于左旋咪唑中会 有毒的。

4. 受精过程中钙成像  秀丽隐杆线虫

  1. 使用显微镜的低倍物镜（如 4x）定位线虫。采用明场照明。
  2. 为清晰观察卵母细胞中的钙波，应使用至少 20x 的干式物镜。建议使用 40x 或更高倍数的浸油物镜。
  3. 根据所用系统的不同，激发光强度通常为固定值。为实现荧光报告分子的最佳可视化效果，可调节增益或曝光时间。
    注意：持续高强度光照会损伤样品，并对线虫健康产生不利影响。如需要，可在等待受精事件发生时关闭激光，以避免持续的 GFP 照明。参见第 4.8–4.9 节中受精事件的标志性特征 。
  4. 确保将 488 nm GFP 通道的激光功率设置为可清晰观察到 CaFE 报告分子信号的水平。
    1. 对于 Nikon ECLIPSE Ti2 激光扫描共聚焦显微镜，建议在 GFP 通道中以 30% 激光功率和 75 增益检测 CaFE 报告分子。 Nikon ECLIPSE Ti2 激光扫描共聚焦显微镜的针孔大小为 30 μm。
    2. 对于使用 Zyla 相机的 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜，建议在 GFP 通道中以 30% 激光功率检测 CaFE 报告分子。 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜的针孔大小为 40 μm。
    3. 针对每个检测的样品，均需调整激光设置和曝光时间。
  5. 若使用 EAG28（CaFE; PH-mCherry）或 EAG25（CaFE; H2B-mCherry）品系，除 GFP 通道外，还需确保红色 通道的激光功率设置为可清晰观察到 mCherry 信号的水平。
    1. 对于 Nikon ECLIPSE Ti2 激光扫描共聚焦显微镜，建议在 RFP 通道中以 15 激光功率和 130 增益检测 mCherry 报告分子。
    2. 对于使用 Zyla 相机的 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜，建议在 RFP 通道中以 30% 激光功率检测 mCherry 报告分子。
    3. 针对每个检测的样品，均需调整激光设置和曝光时间。
  6. 将帧率或每秒帧数（fps）设置为系统允许的最高速度。
    注意：在 Nikon ECLIPSE Ti2 激光扫描共聚焦显微镜上，CaFE 报告分子通常以约 1 fps 进行观察；而在配备 Zyla 相机的 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜上，通常以 10 fps 进行观察。
  7. 选择延时或时间序列采集模式，并调整至所需参数。采集时程不超过 30 分钟的延时图像，重复次数设置为“1”。
    注意：若在设定时间间隔结束前已发生受精事件，则应立即停止录像，以节省文件大小。
  8. 在载玻片上定位线虫，选择一个近端性腺可见的个体。线虫体内肠道与性腺相互缠绕，因此性腺臂常被肠道遮挡，导致无法观察受精过程。若 -1 卵母细胞被遮挡，应另选其他线虫进行观察。为提高所选线虫性腺臂可见的概率，建议每张载玻片至少固定 5 条线虫。使用早期第 1 天成虫以观察受精过程。
  9. 检查线虫性腺臂中的每个 -1 卵母细胞，判断是否即将发生受精事件。
    注意：在受精前的减数成熟过程中，-1 卵母细胞的细胞核将迁移至卵母细胞后部，核膜随之解体。这些事件在微分干涉相差（Nomarski）和 GFP 通道中均可通过 CaFE 报告分子观察到，提示排卵将在约 10 分钟内发生。
  10. 核膜破裂后，最靠近近端的 -1 卵母细胞的细胞骨架将发生重排，呈现圆形外观，并与 -2 卵母细胞分离。此时排卵即将发生。一旦观察到上述现象，应立即开始录像。录像应在宽场模式下进行。
    注意：若在 20 分钟内未观察到细胞核移动或卵母细胞变圆，则排卵事件可能不会发生。此时应更换其他线虫观察，或制备新的样品载片。

5. 钙瞬变的定量分析 C. elegans 受精

  1. 使用显微镜系统软件（如 Nikon NIS Elements，本文所述）对受精视频中的钙瞬变进行定量分析。ImageJ/FIJI 同样适用于图像分析。11.
  2. 为量化受精视频中荧光信号的变化，使用以下信号值：时间0时的信号、目标帧的信号以及基线信号。
  3. 确定捕捉到首次爆发的时间和帧 -1 卵母细胞中出现荧光。将此帧定义为 时间 0
  4. 为了获取目标帧的信号，绘制感兴趣区域（ROI）以包含以下部位：受精前的-1卵母细胞、受精囊以及子宫中 newly fertilized oocyte。ROI 中显示的信号称为 F1.
    注意：确保ROI覆盖卵母细胞移动经过的整个区域。在分析的时间序列记录的每一帧中，ROI应保持一致。
  5. 使用与步骤 5.4 中定义的 ROI 相同的尺寸，在图像中定义一个无荧光的空白区域，以计算每帧中的背景信号。从每一帧中减去背景信号。
  6. 为获得基线信号（F0)，在时间0之前的至少15帧处定位该帧。使用与步骤5.4相同的ROI，记录从该帧至时间0每一帧的信号值。对从起始帧到时间0的所有信号值（扣除背景）取平均，以计算基线信号。
  7. 计算荧光强度的变化（ΔF）使用以下公式： figure-protocol-1. F1 定义为每个图像帧中感兴趣区域（ROI）的信号减去背景信号。F0 是至少15帧的平均基线荧光信号 在第5.6节中计算得出的0时刻之前 
  8. 通过减去两帧之间的荧光变化量并除以时间，计算帧间变化速率。

6. RNAi 实验 秀丽隐杆线虫

  1. 制备RNAi平板
    1. 根据步骤1.1准备平板，并添加以下额外试剂，以便在步骤6.1.4中通过RNAi实现基因敲低。
    2. 加入 1 mL 经无菌过滤的 1 M 异丙基 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）（溶于去离子水）至培养基中IPTG终浓度为1 mM（参见 材料表).
    3. 加入1 mL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素溶液（溶于去离子水，经无菌滤膜过滤），使终浓度达到 100 μg/mL 培养基中的氨苄青霉素（参见 材料清单）。或者，使用 40 μg/mL 羧苄青霉素12.
    4. 轻轻但充分混匀，然后按照步骤 1.1.4 - 1.1.5 所述倒平板。
  2. RNAi饱和培养物的制备
    1. 计算饱和培养物的量 通过将所需接种的RNAi平板数量相乘 由 300 μL 当使用 60 mm × 15 mm 培养皿时，或通过 100 μL 使用35 mm × 10 mm培养皿时。
    2. 使用无菌技术，在含有以下成分的 LB 培养基中培养目标 RNAi 细菌（见步骤 1.2.1–1.2.3 所述） 100 μg/mL 氨苄青霉素 过夜于 37 °C 直至饱和。以含有L4440空载体的菌株作为阴性对照，以含有RNAi阳性对照（例如， egg-5）以验证RNAi是否有效。此外，应包含一个 "空白" 仅含LB的条件用于验证LB储备液中无污染。
    3. 向过夜培养的饱和菌液中加入经无菌过滤的IPTG，使终浓度为1 mM，以诱导dsRNA表达，随后在指定温度下孵育至少2小时30分钟 37 °C 在接种前进行稀释。或者，在用IPTG诱导前，将过夜培养的饱和菌液稀释至对数生长期。
      注意：为实现最佳的dsRNA表达，IPTG需添加至平板和饱和培养物中。
    4. 使用无菌技术，转移 300 μL 将诱导培养物转移至一个60 mm × 15 mm RNAi平板（已凝固）的中心。或者，使用 100 μL 35 mm × 10 mm 培养皿的饱和培养物量。
    5. 让平板在室温下干燥1-3天，直至RNAi细菌菌斑不再呈液态。使用前确保平板完全干燥且无污染。将平板储存于 4 °C 倒置以备将来使用。
      注意：为获得最佳基因敲低效果，应尽快使用RNAi平板，因为RNAi效果会随时间推移而降低。若出现以下情况，请丢弃使用 >1个月大
  3. 如第2节所述，将线虫同步至RNAi平板上。
    1. 在卵产下后同步的1-2天内检查线虫是否存在发育延迟。
    2. 某些RNAi在基因敲低从产卵阶段开始时可能会导致发育缺陷。如有需要，可将线虫在较晚阶段（如L3期）转移至RNAi平板。
  4. 如第3和第4节所述，固定线虫并准备成像，使用任何具备GFP荧光检测功能的显微镜系统进行观察。

7. 早期胚胎发生过程中钙成像 C. elegans

  1. 按照第2节所述同步线虫。使用EAG28品系，该品系结合了CaFE报告基因和标记质膜边界的pleckstrin同源结构域-mCherry标记。或者，为观察受精胚胎 子宫外，沿子宫轻轻剪开虫体 使用无菌注射器针头释放胚胎。
  2. 按照第3节所述方法准备用于成像的线虫或胚胎，并依照第4节中所述相同步骤设置成像参数。
  3. 将目标区域对准蠕虫的子宫部位，以观察胚胎或已产出的卵。
    1. 对于胚胎 在子宫内 确保子宫不在肠管后方，子宫无拥挤，并且胚胎中的单个细胞在焦平面上清晰可见。
    2. 用于卵子 子宫外确保细胞所处的阶段未超过线虫生命周期的逗号期。
  4. 选择延时或时间序列实验方案，并调整至所需设置。
    1. 为获得胚胎钙瞬变的最佳可视化效果，应延长长时间录像的时间设置。需注意，激光的持续照射在较长时间内会对胚胎造成损伤。
  5. 通过聚焦于处于目标细胞阶段的胚胎中的细胞来捕获视频或图像。
  6. 使用40倍油镜或更高倍数的物镜进行成像，尽管使用20倍干镜物镜也可清晰检测到瞬时信号。

结果

利用本论文所述的方案，观察了秀丽隐杆线虫（C. elegans）受精和胚胎发生过程中钙信号的动态模式。

含有 CaFE 报告基因的线虫中典型的受精过程如图2所示。为便于分析，使用了EAG28品系，该品系将CaFE报告基因与pleckstrin同源结构域（PH-mCherry）转基因相结合13。PH-mCherry标记定位于细胞膜，有助于更清晰地观察细胞边界，尤其是在性腺臂中。EAG28品系是通过将含有CaFE报告基因的EAG16品系与OD70 PH-mCherry报告基因品系杂交而获得的13。在C. elegans中，排卵与受精同时发生。受精的0时间点定义为排卵卵细胞中首次检测到荧光信号的帧（图2）。当卵细胞前端进入精子储存器官——受精囊时，精子融合位点立即出现强烈的荧光爆发信号7。该信号在排卵完成之前即已出现。钙信号呈双相性，先出现快速的初始爆发，随后荧光信号从融合位点向卵细胞对极方向传播。整个卵细胞在<30 s内变为荧光可见。

需要注意的是，CaFE 报告基因位于单拷贝位置，因此其信号亮度不如其他转基因强。除非具备且已优化了转盘共聚焦显微镜，否则不建议在排卵期间进行Z-stack时间序列成像。可在录制视频前后获取Z-stack图像，以捕捉性腺形态的三维变化。尽管此处图像采用共聚焦显微镜采集，但这些瞬时现象也已在更常见且经济的宽场荧光显微镜下观察到。使用激光扫描共聚焦显微镜时，帧率约为1帧/秒；而使用转盘共聚焦显微镜时，帧率可达10帧/秒或更高。CaFE报告基因的背景信号足以照亮性腺臂中正在成熟的卵母细胞。受精后，通常可观察到GFP信号强度增加1.5至2倍。

定量分析存在多种替代方法。例如，由 Oxford Instruments（与 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜同属一家母公司）开发的 Imaris 图像分析软件，能够仅针对正在通过的卵母细胞进行逐帧信号定量，而无需使用更大的感兴趣区域（ROI）。然而，Imaris 软件并非免费。此外，Takayama、Fujita 和 Onami 已经非常详细地描述了一种使用 ImageJ 进行卵母细胞钙波测量的图像分析策略，该软件可免费获取14。或者，若要绘制单个卵母细胞中荧光信号传播的线扫图（kymograph），则需要比本文所述更复杂的图像处理步骤，相关内容已在 Takayama 和 Onami 的研究中有所描述3。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的一个显著优势在于，可通过喂食表达双链RNA（dsRNA）的细菌，触发内源性RNA干扰（RNAi），从而敲低几乎任何基因的表达15,16。为实现dsRNA的最佳表达，RNAi平板和饱和的RNAi菌液培养物中均含有IPTG。dsRNA通过在目标基因两侧带有启动子的表达系统产生。本研究中使用的是Ahringer文库，该文库利用16,256种细菌菌株，可靶向线虫基因组中的大部分基因17。此外，Vidal实验室利用Gateway系统构建了一个包含约11,000个RNAi克隆的ORFeome文库，可通过Horizon Discovery公司购买18。

为了验证CaFE报告系统与RNAi联用的实用性，我们研究了卵细胞提前排卵现象。在ipp-5基因中发生部分缺失时，会引发双卵排卵事件，即-1卵母细胞和-2卵母细胞在同一次排卵过程中同时进入输卵管19。IPP-5 是一种作用于IP3的磷酸酶，可有效降低IP3第二信使的水平。我们发现，通过RNAi敲低ipp-5可诱发与突变体相似的双卵排卵表型。

利用 CaFE 报告系统分析 ipp-5 RNAi 敲低诱导的双排卵过程，揭示了卵细胞激活事件（OET）的新特征。首先，在进入受精囊时，领先的 -1 卵细胞立即出现钙信号，而跟随的 -2 卵细胞则未观察到钙信号（图3）。尽管有两个卵细胞被排出，但只有 -1 卵细胞表现出正常成熟的迹象，特别是核膜破裂（NEBD）。这些数据表明，即使 -2 卵细胞处于精子环境中，由于尚未完成适当成熟，仍不具备受精能力。其次，-2 卵细胞表现出延迟的钙波，通常发生在卵细胞从受精囊进入子宫时。尽管卵细胞成熟通常是排卵的前提条件，但这些结果提示，卵细胞的成熟及获得受精能力仍可在排卵后发生。ipp-5 敲低过程中延迟钙波的可视化凸显了 CaFE 报告系统在探究受精能力及其时间动态方面的优势。

此外，我们发现 CaFE 报告基因在产出的卵中可被检测到，并能在 C. elegans 早期胚胎发育过程中揭示单细胞钙瞬变。使用 Andor Dragonfly 旋转盘共聚焦显微镜配合 Zyla 相机，按照第 1–5 节的方案对同步化第 1 天成虫 EAG28（CaFE；PH-mCherry）线虫的胚胎进行成像（图 4）。钙瞬变局限于单个细胞内，完成所需时间短于受精时的钙波（约 9 秒，n=11）。然而，胚胎发育过程中的钙波似乎并非双相性。在 8 细胞期之前未观察到钙瞬变。值得注意的是，在 C. elegans 中，钙信号并不定位于卵裂沟，这与包括人类和 Xenopus20,21,22 在内的许多其他生物不同。单细胞钙瞬变可在原肠胚形成后较长时间（受精后约 200 分钟）以及产出的卵中观察到。单个胚胎在不同时间点可表现出多个钙瞬变，但通常发生在不同的细胞中，且多为每次一个细胞。需注意，持续的激光刺激会对胚胎造成损伤，建议采用较低的 LED/激光功率或间断性曝光。但由于钙波持续时间相对较短（约 9 秒），不建议两次 LED/激光刺激之间的间隔超过 2 秒。

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图1：C. elegans 性腺臂。 来自EAG25线虫品系的一个性腺臂图像，显示CaFE报告基因GFP（绿色）和组蛋白2B-mCherry标记（红色），后者可标记生殖系中的细胞核。紧邻储存精子的受精囊（箭头所示）前方的近端卵细胞以-1标示。位于受精囊附近但处于子宫内的胚胎为最新产生的胚胎。图像使用Nikon ECLIPSE Ti2激光扫描共聚焦显微镜拍摄。比例尺 = 20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2受精过程中钙波的可视化 EAG28线虫品系受精过程中反映细胞内钙变化的荧光时间序列图像。EAG28品系同时含有CaFE报告基因（绿色）和pleckstrin同源结构域-mCherry融合蛋白（黄色），后者用于标记质膜。时间0表示 第一个画面显示卵母细胞中荧光信号明显增强。时间24.4 s对应显示该现象的第一个画面 卵母细胞整体荧光 使用Andor Dragonfly转盘共聚焦显微镜配合Zyla相机拍摄时间序列图像。比例尺 = 20 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：钙波在 ipp-5 RNAi诱导的双排卵事件。 EAG16品系（CaFE在GFP绿色中）的-1卵母细胞和-2卵母细胞在暴露于连续钙波时的时间推移图像 ipp-5 RNAi。-40.0 s 时相显示了-1 卵母细胞（-1）、-2 卵母细胞（-2）、受精囊（*）以及+1 胚胎（+1）的标注。0 s 时相呈现-1 卵母细胞钙波荧光信号的初始增强。4.5 s 时相显示钙波在-1 卵母细胞内向对极方向扩散。70.5 s s 显示 -1 卵母细胞中的全细胞荧光，伴随 -2 卵母细胞在基线 GFP 信号下的表现；两个卵母细胞均处于 受精的-1卵细胞和未受精的-2卵细胞在158.3 s时进入子宫。在219.3 s时，-2卵细胞 显示晚期荧光钙波。图像使用 Andor Dragonfly 转盘共聚焦显微镜配合 Zyla 相机拍摄。比例尺 = 30 µM 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4早期胚胎发育中的单细胞钙瞬变 (A胚胎 在子宫内 和（B) 子宫外 （产下的卵）在胚胎发育期间的单个细胞中显示出荧光信号。图像使用Andor Dragonfly转盘共聚焦显微镜配合Zyla相机拍摄。比例尺 = 20 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

一种结构简单且具有稳健操作流程的工具，是解决复杂科学问题的有力组合。本文介绍了利用CaFE报告系统对钙离子进行可视化检测的方法，该方法以钙信号作为受精过程的易检测指标。同一报告系统在早期胚胎发生过程中持续表达，还可用于发育后期钙瞬变的可视化观察。钙信号作为一种关键的第二信使，在细胞功能发生重大转变时发挥标志性作用，尤其在发育生物学中具有重要意义。在卵母细胞中，钙信号的首次爆发阶段标志着 钙波标记 不仅涉及受精的时间，还涉及精子的位置 融合3。在 秀丽隐杆线虫，前后轴也由精子融合位点决定23因此，对卵母细胞和胚胎中的钙进行可视化观察，有助于研究细胞生物学和发育生物学中的核心复杂问题。

本文所述使用CaFE报告基因的方法对于线虫研究新手而言应足够简便。C. elegans卵母细胞中钙波检测的先前方法依赖于染料注射3,8,14。尽管这些研究具有重要意义并提供了深刻见解，但染料注射耗时耗力，且并非每个实验室都具备注射设备。

本文所述方案已针对健康的线虫进行了优化。为最大限度提高实验成功率，应确保线虫培养基及线虫摄食的细菌菌苔中无任何污染。避免使线虫暴露于温度等应激条件下，因为这些因素会影响排卵和受精过程。此外，每次实验均应设置RNAi效率的对照，因为RNAi的效率会随时间下降。可使用如egg-5 作为RNAi效率的阳性对照，该基因干扰后会产生胚胎，但因卵壳形成受损而无法产生可存活的后代24。此外，图像采集参数需针对每种显微镜系统进行优化。本文提供的参数仅供参考，实际应用中可能存在差异。尽管该系统能够通过检测胞质钙信号来间接反映受精情况，但这并不一定代表真正发生了精子与卵细胞的融合事件。

线虫研究社区内广泛提供的各类工具和突变体增强了CaFE报告系统的实用性。该报告系统已整合至线虫基因组中，可轻松与其它突变体或报告系统进行杂交。 秀丽隐杆线虫 菌株25此处报道了构建表达CaFE报告基因并带有组蛋白H2B-mCherry标记以可视化细胞核的EAG25细胞系（图1）以及EAG28与CaFE报告基因和pleckstrin同源结构域-mCherry标记物的共表达，后者用于标记细胞周边图2)13,26两种品系均有助于观察生殖系细胞及胚胎发育过程中的细胞。此外，RNAi技术的便捷性在
秀丽隐杆线虫与CaFE报告系统联用时，揭示了新的 受精能力的见解。如通过双重排卵诱导所示 ipp-5 RNAi 基因沉默在 图3，仅存在精子和排卵后的卵母细胞不足以刺激受精事件的发生。

这些结果表明，可能存在另一种信号或抑制因子的缺失，使得卵母细胞能够被受精。提前排卵的卵母细胞在进入子宫后表现出延迟的钙瞬变。这种晚期的钙波提示，提前排卵的-2期卵母细胞随着时间推移可能逐渐获得受精能力。我们预计，关于受精时间的研究，特别是涉及细胞间信号传递与调控的研究，将得益于CaFE报告系统的应用。此外，CaFE报告系统可持续表达至胚胎发生阶段，并呈现单细胞水平的钙瞬变。在斑马鱼发育的最初24小时内也已有类似胚胎期钙信号的报道27。目前尚不清楚这些钙瞬变的具体功能，但其存在提示在发育过程中可能存在尚未被探索的细胞信号事件。值得注意的是，在新受精的合子中并未观察到钙瞬变。因此，钙并不像在其他多种生物（包括Xenopus和人类）中所报道的那样定位于卵裂沟20,21,22。

重要的是，CaFE 报告系统操作简便，经过极少培训的本科生即可使用。我们已为生物学专业学生设计并实施了一门1学分的CURE（基于课程的本科生科研实践）实验课程，采用本文所述的菌株和实验方案。在为期一学期的课程中，学生每周集中一次，每次3小时，或每周两次，每次1小时30分钟。学生可选择独立完成实验或两人一组合作进行。每位学生或每组学生从经过筛选的基因列表中选择一个不同的基因进行研究。他们在 EAG28 菌株中针对所选基因进行RNAi实验，并观察线虫在繁殖力、 受精能力及/或性腺形态方面的表型变化。根据实验结果以及基于原始文献的背景阅读，学生提出可在后续实验中验证的科学假设。这种迭代式设计对于提高学生的参与度至关重要28。学生获得了真实的科研体验，并掌握了模式生物操作、遗传筛选和荧光显微镜技术等技能。鉴于CaFE报告系统的易用性，即使没有科研经验的学生也能取得成功。课程结束后，绝大多数学生表示更倾向于CURE教学模式而非传统的实验课，许多学生表达了继续从事科研工作的意愿。综上所述，这些工具和实验方案有助于推动早期发育过程的研究与教学工作。

披露

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

致谢

KSKG 获得了尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（R15HD111986）的资助。部分菌株由秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD4010440）资助。我们感谢 WormBase。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Fisher ScientificDF0140-07-42 kg；粉末比片状更易溶解
琼脂糖MidSciBE-A125500 g
酒精灯Fisher ScientificS13475需使用95%乙醇
氯化铵（NH4Cl）Fisher ScientificAAA1500030250 g
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-55 g
AMSCO 400 系列小型蒸汽灭菌器Steris HealthcareN/A
蛋白胨（Bacto-peptone）Fisher ScientificBP1420-500500 g
胰蛋白胨（Bacto-tryptone）Fisher ScientificDF0123-17-3500 g
氯化钙（CaCl2）Fisher ScientificC69-500500 g
胆固醇Thermo ScientificA11470.1850 g
Dragonfly 200 旋转盘共聚焦显微镜Oxford Instruments AndorN/A需与Leica显微镜联用
Fisherbrand Superfrost 细胞遗传学显微镜载玻片Fisher Scientific22-035-900每包144片
平口镊子，光滑钳口Home Depot305530604确保镊子为光滑钳口
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）Fisher ScientificBP1755-1010 g；无二氧六环
实验室胶带Fisher Scientific15-901-10R使用0.5英寸胶带粘贴显微镜载玻片
左旋咪唑Fisher ScientificAC18787010010 g
硫酸镁（MgSO4）Fisher ScientificM63-500500 g
显微镜盖玻片Fisher Scientific12541016每包1盎司
Nikon ECLIPSE Ti2 激光扫描共聚焦显微镜NikonN/A
Nikon NIS Elements 软件NikonN/A共聚焦
OP50 大肠杆菌（Escherichia coli）秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）OP50
铂丝TriTechPT-9010
磷酸氢二钾（K2HPO4）Fisher ScientificP288-500500 g
磷酸二氢钾（KH2PO4）Fisher ScientificAA1159436500 g
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS271-500500 g
七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4）Fisher ScientificS471-33 kg
体视显微镜LeicaKL300 LED
无菌培养皿（35 mm × 10 mm）CellTreat229638每箱960个培养皿
无菌培养皿（60 mm × 15 mm）CellTreat229665每箱500个培养皿
菌株 EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1u秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）EAG16由 Kim Guisbert 实验室构建
菌株 EAG25 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1u; ujIs113 II.秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）EAG25由 Kim Guisbert 实验室构建
菌株 EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）EAG28由 Kim Guisbert 实验室构建
菌株 JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::pie-1 3'UTR + nhr-2p::his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）JIM113由 E. Preston - Murray 实验室构建
菌株 OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::PH(PLC1delta1) + unc-119(+)]秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）OD70由 Audhya/Oegema - Greenstein 实验室构建
Tritech 线虫挑取手柄TriTechTWPH1
酵母提取物IBI ScientificIB49160500 g

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体内可视化受精及早期发育过程中的钙瞬变 秀丽隐杆线虫
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