雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

Summary

该协议描述了雷帕霉素调节的磷酸酶的设计、创建和应用。该方法对活细胞中的磷酸酶活化具有高特异性和严格的时间控制。

Abstract

酪氨酸磷酸酶是调节关键生理功能的重要酶家族。它们在人类疾病中经常失调，使其成为生物学研究的关键目标。能够调节磷酸酶活性的工具有助于剖析其功能。传统方法（例如过表达组成型活性或显性阴性突变体或使用 siRNA 下调）缺乏时间控制。磷酸酶抑制剂的特异性通常较差，它们只允许研究人员确定哪些过程受磷酸酶抑制的影响。

我们开发了一种化学遗传学方法，即雷帕霉素调节 （RapR） 系统，该系统允许磷酸酶催化结构域的变构调节，从而实现磷酸酶激活的严格时间控制。RapR 系统由插入磷酸酶变构位点的 iFKBP 结构域组成。RapR 结构域的内在结构动力学破坏催化结构域，导致酶失活。添加雷帕霉素介导 iFKBP 和共表达的 FRB 蛋白之间复合物的形成，从而稳定 iFKBP 并恢复磷酸酶催化结构域的活性。

该系统对活细胞中的磷酸酶激活具有高度特异性和严格的时间控制。该系统的独特功能能够识别瞬时事件并询问磷酸酶下游的单个信号通路。该方案描述了 RapR-磷酸酶的开发指南、其生化表征及其对下游信号传导和细胞形态动力学调节的影响分析。它还详细描述了蛋白质工程策略、分析磷酸酶活性 的体外 测定以及识别细胞形态变化的活细胞成像实验。

Introduction

蛋白酪氨酸磷酸酶是参与大量细胞信号转导事件的关键蛋白质家族。它们已被证明在细胞增殖、迁移和细胞凋亡的调节中起关键作用 ^1,2,3。因此，蛋白酪氨酸磷酸酶的失调会导致各种使人衰弱的疾病和病症 4,5,6,7。研究酪氨酸磷酸酶的生理功能及其在这些病理发展中的作用历来受到缺乏探测磷酸酶信号转导复杂性所需的工具的阻碍⁸。

传统上，磷酸酶是使用不具有所需特异性和/或不提供对其活性的时间控制的方法进行研究的。可用工具的这些关键局限性使得剖析磷酸酶在信号通路中的特定作用变得具有挑战性。组成型活性和显性阴性突变体的过表达或磷酸酶表达的下调提供了特异性，但缺乏时间控制，并且通常会触发掩盖酶真正功能的代偿机制。

药理学抑制剂允许磷酸酶的时间调节。然而，由于酪氨酸磷酸酶中活性位点的组成非常保守，因此许多磷酸酶抑制剂是众所周知的非特异性⁹。此外，由于设计限制，靶向催化位点的抑制剂表现出较差的细胞膜通透性¹⁰。抑制剂的另一个局限性是它们只允许检查磷酸酶失活的作用¹¹。因此，需要能够实现磷酸酶特异性、时间可调激活的工具。这些工具将使研究人员能够识别磷酸酶激活的直接影响，将它们与通常由生物刺激激活的多个平行信号级联反应分开。重要的是，对活性的严格时间控制能够识别磷酸酶诱导的瞬时事件，并分离急性和长期磷酸酶活性的影响。将时间调节与突变分析相结合，可以详细剖析磷酸酶各个结构域的特定作用，并询问其下游信号转导¹²。

为了解决现有工具中缺乏所需功能的问题，Karginov 小组开发了雷帕霉素调节 （RapR） 系统 13,14,15。RapR 系统利用工程化的开关结构域 iFKBP，允许对目标蛋白 （POI） 进行变构调节。将 iFKBP 结构域插入到 POI 的催化位点变构偶联的位置使其容易受到雷帕霉素的调节。在没有雷帕霉素的情况下，由于 iFKBP 固有的高结构动力学，iFKBP 会破坏催化位点，从而使 POI 失活。添加雷帕霉素诱导 iFKBP 与共表达蛋白 FRB 的相互作用（图 1）。这会导致开关结构域的稳定，从而恢复 POI 催化结构域的结构和功能。因此，该工具允许对 POI 进行特异性和时间可调的激活。

图 1：RapR-Shp2 雷帕霉素调节系统的示意图。 RapR 允许通过添加雷帕霉素来变构激活目标蛋白。该图是从 Fauser 等人 ¹² 修改而来的。缩写： iFKBP = 可插入的 FKBP12;FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域;R = 雷帕霉素;Shp2 = 包含 Src 同源-2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶。 请单击此处查看此图的较大版本。

RapR 工具可应用于不同的蛋白质家族。它可用于调节蛋白激酶和磷酸酶^12,14。该协议将侧重于 RapR 工具控制 Shp2 磷酸酶的应用。Shp2 是一种普遍表达的蛋白酪氨酸磷酸酶，参与增殖、迁移、免疫调节和分化等信号转导过程 1,16,17,18。Shp2 失调与许多实体癌、髓系白血病和发育障碍有关 ^5,7。然而，Shp2 已成为上述相同工具缺陷的受害者。为了克服这些限制，开发了 RapR-Shp2，一种特异性和时间上可调节的 Shp2 构建体，并对其进行了表征¹²。

在 RapR-Shp2 开发之前，已知 Shp2 参与细胞迁移 19,20,21。然而，它在这一过程中涉及的信号传导中的具体作用尚不清楚。目前还不知道 Shp2 在什么时间尺度上调节细胞的迁移，以及它在其激活的不同时间点诱导哪些特定的形态动力学变化。此外，尚不清楚 Shp2 的急性和长期激活是否会引起不同的影响。使用 RapR-Shp2，发现 Shp2 的急性激活诱导瞬时细胞扩散、突起增加、细胞极化和迁移。还确定了 Shp2 下游调节不同形态动力学变化的特定途径¹²。该协议提供了 RapR-Shp2 的设计和表征的详细信息，可用于指导其他 RapR 磷酸酶的开发和应用。

Protocol

1. RapR-磷酸酶的设计

1. 规划
   注意：以 RapR-Shp2 为例，该方案详细介绍了产生雷帕霉素调节的酪氨酸磷酸酶的重要步骤。所描述的方案针对 Shp2 进行了优化，可能需要额外的修改以适应单个磷酸酶的特定特性。
   1. 为了确保 Shp2 的催化活性完全由雷帕霉素控制，而不是由内源性机制控制，将突变引入磷酸酶以使其保持组成型活性构象。在 Shp2 的情况下，引入 D61A 突变。
      注：如果未针对特定 PTP 酶引入激活突变，则其 RapR 变体将作为受内源性信号和雷帕霉素调节的 AND 门控系统发挥作用。
   2. 使用晶体结构确定磷酸酶催化结构中的 iFKBP 插入位点，以指导如前所述¹³ 的选择。如果没有结构，则与 Shp2 磷酸酶的催化结构域进行氨基酸序列比对，以识别插入位点（图 2A）。确保插入位点位于结构上与催化袋耦合但远离口袋的柔性环中，以防止 iFKBP 对底物结合的空间阻碍。
      注意：讨论中讨论了插入的更多细节。
   3. 考虑在插入的 iFKBP 结构域和目标磷酸酶之间使用的接头序列类型。选择最佳连接子序列对于 RapR 工具的成功极为重要，将在讨论中进一步讨论（图 2B）。

图 2：设计 RapR-磷酸酶时的注意事项示意图。 （A） Shp2 （紫色）、PTP1B （绿色） 和 PTP-PEST （粉红色） 的比对，突出显示了保守的插入位点。（B） Shp2 和 iFKBP 之间的连接子插入表示。（C） Shp2 的磷酸酶结构域为米色，插入位点以蓝色表示。该图是从 Fauser 等人 ¹² 修改而来的。缩写：Shp2 = Src 同源-2 结构域包含蛋白酪氨酸磷酸酶;iFKBP = 可插入 FKBP12;PTP = 蛋白酪氨酸磷酸酶;RapR = 雷帕霉素调节。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. RapR-磷酸酶的产生

1. 使用改良的定点诱变将 iFKBP 插入目标磷酸酶中
   1. 通过 PCR 生成 iFKBP 编码的“megaprimer”。
      1. 设计用于“巨引物”合成的引物，其中包含 20-25 个核苷酸退火到 iFKPB 的 5' 或 3' 末端，一个将 iFKPB 连接到目标磷酸酶的接头序列，以及对应于插入位点的 28-32 个核苷酸（图 3）。确认所得产物包含 iFKPB，两侧是目标磷酸酶插入位点前后退火的片段。
      2. 通过 PCR 合成含有“巨引物”的 iFKBP（10 μL 5x 聚合酶缓冲液、1 μL 含有 iFKBP 的 50 ng/μL 模板 DNA、2 μL 10 mM dNTP、0.5 μL 100 μM 每种“巨引物”引物原液 [正向和反向]、35 μL 水、1 μL DNA 聚合酶）。在运行 PCR 之前，将此 PCR 反应分成 2 个单独的 25 μL 反应。根据 DNA 聚合酶制造商的建议或以下标准 PCR 循环运行 PCR 循环：（i） 98 °C 2 分钟，（ii） 98 °C 30 秒，（iii） 55-70 °C 30 秒，（iv） 72 °C 30 秒，（v） 重复步骤 ii-iv 25 次，（vi） 72 °C 2 分钟。
      3. 使用琼脂糖凝胶电泳纯化“megaprimer”。将上一步的 PCR 内容物加载到 1% 琼脂糖凝胶中，并在 120 V 上施加约 30 分钟。在凝胶中寻找 400 个核苷酸长的“巨引物”，切除片段，并使用凝胶提取试剂盒进行纯化（参见 材料表）。
         注意：协议可以在此处暂停。
   2. 改良的定点诱变
      1. 使用含有目标磷酸酶基因的质粒作为模板（5 μL 5x 聚合酶缓冲液、2 μL 50 ng/μL 模板、2 μL 10 mM dNTP、10 μL 提取的“巨引物”、2.5 μL 水、2.5 μL DMSO、1 μL DNA 聚合酶）制备修饰的定点诱变反应。
         注：在反应混合物中添加 DMSO 可降低退火温度²².
      2. 运行以下PCR循环：在98°C下进行初始变性步骤3分钟，然后在98°C下连续孵育30秒，65°C持续20秒，60°C持续20秒，55°C持续20秒，50°C持续20秒，72°C持续18分钟。运行循环过夜（循环时间为 7 小时）。循环完成后，将 PCR 反应物储存在 4 °C。
         注意：协议可以在此处暂停。
      3. 循环完成后，加入 1 μL DpnI 酶并在 37 °C 下孵育 1 小时。
         注： DpnI 将消化残留的模板，从而提高新合成产物的产量。
      4. 按照制造商的说明将消化产物转化为 DH5α 感受态细胞。用适当的抗生素（用于 pcDNA RapR-Shp2 构建体的羭青霉素）将转化接种在 LB 琼脂平板上。在 37 °C 孵育过夜。一旦菌落生长，将 LB 板在 4 °C 下储存长达 1 个月。
         注意：协议可以在此处暂停。
2. 分离含有 RapR-磷酸酶的所需 DNA 构建体
   1. 对细菌菌落进行 PCR 筛选²³。由于并非所有在 LB 平板上生长的菌落都含有所需的质粒，因此请务必在分离质粒 DNA 之前进行筛选。
      注意：使用将退火到模板和 iFKBP 基因中的筛选引物。可以使用 Taq 聚合酶预混液进行筛选（参见 材料表）。
   2. 一旦鉴定出阳性菌落，将一个阳性菌落接种到 3 mL LB 肉汤中，包括适当的抗生素，孵育并在 37 °C 下摇动过夜。
   3. 按照制造商对质粒 DNA 提取试剂盒的说明，从液体培养物中提取质粒 DNA（参见 材料表）
      注：建议在继续 体外 评估之前对新创建的 RapR PTPase 构建体进行测序。

图 3：引物设计和改进的定点诱变克隆策略示意图。 第 1 步是合成含有“巨引物”的 iFKBP，其“粘性末端”退火到目标磷酸酶的插入位点，第 2 步是将“巨引物”插入目标磷酸酶。该图是从 Karginov 等人 ¹³ 修改而来的。缩写：iFKBP = 可插入的 FKBP12。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 通过体外活性测定评估 RapR-PTPase

注意：该方案用于评估工程化 RapR-PTP 酶活性的调节。下面描述了使用桩蛋白的磷酸化 N 端片段作为底物对免疫沉淀的 Shp2 的分析。可能需要为目标的特定 PTP 酶选择不同的底物。

1. 第 1 天
   1. 将 800,000 HEK293T 个细胞/孔接种在 6 孔组织培养板中，溶于补充有 L-谷氨酰胺补充剂（终浓度为 2 mM）和 10% FBS 体积的 DMEM 培养基中。置于 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中过夜。
2. 第 2 天
   1. 一旦细胞汇合 ~60–80%，根据首选的转染 Regent 制造商方案进行转染（参见 材料表）。
      1. 转染方案示例：将 1 μg 质粒 DNA（pcDNA-mCherry-FRB 和 pcDNA-flag-RapR-Shp2）添加到 200 μL 无血清 DMEM 和 6 μL 转染试剂中，并在室温下孵育混合物 15 分钟。每孔细胞加入 100 μL 转染混合物。包括用组成型活性和显性阴性 Shp2 构建体转染的样品作为对照。在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
3. 第 3 天
   1. Protein-G 琼脂糖凝胶的制备
      注：在处理 Sepharose 之前准备切割的移液器吸头。处理 Sepharose 的每个步骤都应使用切割尖端。移液前的每个步骤都需要彻底重悬琼脂糖凝胶。
      1. 重悬并将适量的 Protein-G Sepharose 加入 1.5 mL 试管中。对于 6 孔板中的每个孔，使用 10 μL Protein-G 琼脂糖凝胶。对于完整的 6 孔板，使用 60 μL Sepharose。
      2. 用 1 mL 裂解缓冲液洗涤琼脂糖凝胶（参见 材料表）。以 2,000 × g 的浓度微量离心 1 分钟，然后小心地去除裂解缓冲液。重复 2 次。
      3. 将琼脂糖凝胶重悬于 380 μL 裂解缓冲液中。添加 BSA 至终浓度为 1 mg/mL 和抗体（每个 IP 样品 0.5 μL，抗 Flag 抗体 [参见 材料表]）。在 4 °C 下在旋转器上倒置 1.5 小时。
         注：应通过实验确定所用每种抗体的最佳抗体量。
   2. 准备用于免疫沉淀的细胞。
      1. 加入适量的雷帕霉素（1 mM 乙醇储备液）至终浓度为 1 μM，或向样品中加入相同体积的乙醇（阴性对照）。在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时。
      2. 将装有细胞的 6 孔板置于冰上，然后用 3 mL 冷 PBS 轻轻洗涤细胞。吸出 PBS 并加入 300 μL 裂解缓冲液（活化磷酸酶样品中加入 1 μM 雷帕霉素，阴性对照样品中加入等体积的乙醇），然后用细胞刮刀刮擦。将样品转移到 1.5 mL 试管中，并在 4 °C 下以 1,000 × g 微量离心 10 分钟。
      3. 将 20 μL 上清液转移到新的 1.5 mL 试管中，以检查表达水平。向每管中加入 20 μL 含 5% β-巯基乙醇的 2x Laemmli 缓冲液，用于检查表达并在 95–100 °C 下孵育 5 分钟。在步骤 3.3.3.3 中使用剩余的上清液进行免疫沉淀。
   3. RapR-Shp2 的免疫沉淀
      1. 洗涤步骤 3.3.1.3 中的 Protein-G 琼脂糖凝胶。含 1 mL 裂解缓冲液。每次在 4 °C 下以 2,000 × g 微量离心 1 分钟，然后小心吸出裂解缓冲液。重复此步骤 2 次。
      2. 使用切割头，将琼脂糖凝胶重悬于裂解缓冲液中（每个样品 50 μL，因此对于 6 孔板，重悬于 300 μL 裂解缓冲液中）。对于每个样品，将 50 μL 悬浮的 Sepharose 混合物移液到单独的新 1.5 mL 试管中。
         注：由于琼脂糖凝胶的体积，剩余的裂解缓冲液中会有重悬的琼脂糖凝胶。
      3. 将步骤 3.3.2.3 中制备的细胞中剩余的上清液加入每管 Sepharose 中。在 4 °C 下旋转 1.5-2 小时。
   4. 磷酸酶活性测定
      注：Shp2 底物应按照先前描述的激酶反应方案¹²，使用组成型活性 Src 激酶磷酸化桩蛋白的纯化 N 末端片段来制备。
      1. 在步骤 3.3.3.3 结束时，制备磷酸化桩蛋白溶液。对于每个样品，将磷酸化桩蛋白溶液（终浓度为 3 μg/mL）添加到 40 μL 咪唑总缓冲液中（参见材料表）。对于活化的 RapR-Shp2 样品，将终浓度为 1 μM 的磷酸化桩蛋白溶液加入到等分试样中，对于未活化的样品，将等体积的乙醇添加到溶液中。
      2. 将加热摇床设置为 32 °C。
         注：其他磷酸酶可能需要不同的温度才能获得最佳活性。
      3. 用步骤 3.3.3.3 中的样品用 0.5 mL 裂解缓冲液洗涤琼脂糖凝胶 2 次（参见材料表）。用 0.5 mL 洗涤缓冲液洗涤样品 2 次。每种缓冲液应含有 1 μM 的雷帕霉素（对于活化样品）或等体积的乙醇（对于未活化的样品）。最后一次洗涤后，尽可能多地去除缓冲液。
         注：一旦达到此步骤，使用移液器缓慢小心地去除最终量的缓冲液可能会有所帮助，以确保没有吸出任何琼脂糖凝胶。任何剩余的缓冲液都会影响磷酸化桩蛋白的浓度，并导致读数不准确。
      4. 向每个样品中加入 40 μL 制备好的磷酸桩蛋白咪唑缓冲液混合物，含或不含雷帕霉素（样品依赖性）。轻轻轻弹混合，立即放入加热摇床中，在 32 °C 下孵育 40 分钟。 将加热摇床设置为最小 1,000 rpm，以确保样品在孵育期间完全搅拌。
      5. 通过向每个样品中加入 40 μL 2x Laemmli 缓冲液来终止反应。将样品在 95–100 °C 下孵育 5 分钟。冷却样品。
      6. 将 15 μL 每个样品（包括步骤 3.3.2.3 中的裂解物样品）加载到 4–15% 梯度的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并使用 PVDF 膜运行标准蛋白质印迹方案。
      7. 使用抗 Flag 抗体检测 RapR-Shp2 构建体，使用抗 mCherry 检测 mCherry-FRB，使用抗 pY118 或抗 pY31 桩蛋白检测桩蛋白磷酸化。
         注意：得到的蛋白质印迹应类似于 图 4。

4. 活细胞中 RapR-Shp2 活性分析

注：该方案用于确定 RapR-Shp2 使内源性底物去磷酸化并诱导下游信号传导的能力。其他 RapR-PTP 酶需要分析其特异性底物和通路。

1. 第 1 天
   1. 将 198,000 个 A431 细胞/孔接种在补充有 10% FBS 和 L-谷氨酰胺（终浓度为 2 mM）的 DMEM 培养基中的 6 孔组织培养板中。置于 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中过夜。
2. 第 2 天
   1. 通过将腺病毒直接添加到培养皿中已有的培养基中，用表达 RapR-Shp2 和 FRB 的腺病毒构建体感染细胞。将腺病毒留在细胞上，在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中过夜。仅使用 FRB 感染的细胞作为阴性对照。
      注：腺病毒的量需要根据滴度逐个确定。
3. 第 3 天
   1. 实验前通过在含 0.5% FBS 的 DMEM 中孵育 4 小时来饥饿 A431 细胞。
   2. 向细胞中加入终浓度为 1 μM 的雷帕霉素或相同体积的乙醇（阴性对照）2-4 小时。
      注：其他磷酸酶的孵育可能不同。
   3. 将装有细胞的 6 孔板置于冰上，然后用 3 mL 冷 PBS 轻轻洗涤细胞。吸出 PBS，加入 300 μL 裂解缓冲液（参见 材料表），然后用细胞刮刀用力刮擦。将样品转移至 1.5 mL 试管中，并在 4 °C 下以 2,000 × g 微量离心 5 分钟。
   4. 将每个样品的 250 μL 转移到新的 1.5 mL 试管中。加入 250 μL 含 5% β-巯基乙醇的 2x Laemmli 缓冲液，并在 95–100 °C 下孵育 5 分钟。
   5. 将 25 μL 每个样品上样到 4–15% 梯度的 SDS-PAGE 凝胶上，并使用 PVDF 膜运行标准蛋白质印迹方案。
   6. 使用抗 pY992 EGFR 和抗 pY783 PLCγ 抗体评估 RapR-Shp2 介导的 EGFR 和 PLCγ 去磷酸化。通过评估 MAP 激酶 Erk1/2 在 pT202/pY204 残基上的磷酸化来评估其下游激活。
      注意：得到的蛋白质印迹应类似于 图 5。

5. 使用活细胞成像分析 HeLa 细胞中 RapR-Shp2 激活诱导的形态动力学变化

注意：该方案用于确定 RapR-Shp2 活化对细胞突起形成、细胞扩散和迁移的影响。

1. 第 1 天
   1. 将 700,000 个 HeLa 细胞接种在 35 mm 细胞培养皿中，并置于 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中。让细胞粘附在培养皿上（~2-3 小时）。
   2. 根据首选转染试剂制造商的方案转染细胞（参见 材料表）。
      1. 转染方案示例：将 0.5 μg DNA（pcDNA-mCherry-FRB 和 pcDNA-Venus-RapR-Shp2 质粒）添加到 100 μL 无血清 DMEM 和 6 μL 转染试剂中。在室温下孵育 15 分钟。将转染混合物加入细胞中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。仅使用转染 pcDNA-mCherry-FRB 的细胞作为阴性对照。
   3. 通过在 37 °C 下孵育 1 小时，用纤连蛋白 （5 mg/L） 涂覆实时成像 #1.5 25 mm 圆形玻璃盖玻片。
2. 第 2 天
   1. 用 PBS 清洗涂层玻璃盖玻片。
   2. 在成像前 4 小时，将转染的 HeLa 细胞接种在补充有 10% FBS 和 L-谷氨酰胺（终浓度为 2 mM）的 DMEM 培养基中的涂层玻璃盖玻片上，以达到 30% 汇合。
   3. 铺板后 2 小时，轻轻地将板中的培养基换成预热的无血清 Leibovitz L-15 培养基 2 小时。
   4. 根据制造商的方案，用 CellMask Deep Red 质膜染色剂对细胞进行染色。
   5. 将盖玻片放入干净的成像池室中（参见 材料表）。加入 1 mL 预热的 L-15 培养基，并用 1 mL 预热的矿物油覆盖以防止蒸发。将腔室保持在 37 °C 直至成像。
   6. 使用加热台在 37 °C 下对细胞进行成像。
      1. 选择合适的通道进行 RapR 构建体成像，选择合适的通道进行 CellMask 进行落射荧光成像。要遵循此协议，请使用参考的 40 倍物镜（参见 材料表）和以下滤光片组：用于 Venus-RapR-Shp2 成像的 514/10 激发和 540/21 发射滤光片，用于 mCherry-FRB 成像的 561/10 激发和 595/40 发射滤光片，以及用于 CellMask Deep Red 成像的 640/20 激发和 655LP 发射滤光片。对所有荧光通道使用多波段多色镜（参见 材料表）。
      2. 每 2 分钟捕获一次图像，持续 4-4.5 小时。
         注意：更快的形态动力学变化将需要更频繁的采集。
      3. 成像 1 小时后，加入雷帕霉素至终浓度为 1 μM 以刺激 RapR-Shp2。

6. 图像分析

注意：该协议将描述基于 的细胞掩模的创建。从实时成像实验中收集的 TIF 堆栈文件。然后，它将介绍如何在 ImageJ 中创建宏来分析蒙版，这将生成一个单元格区域的电子表格，然后分析该电子表格是否随时间的变化。最后，将使用 Metamorph 分析细胞突出和回缩活性。

1. 使用 CellGeo 软件包²⁴ 中的 MovThresh 函数生成 CellMask 图像的二进制掩码。
2. 将 MovThresh 文件夹复制到图像分析文件夹中。
3. 将 CellMask 或其他膜标记通道图像复制到 MovThresh 文件夹中。
   1. 如果在单个位置对多个单元格进行成像，请在 MatLab 中创建蒙版之前裁剪图像以生成仅包含单个单元格的文件。
4. 确保目录在 MatLab 中正确设置为 MovThresh 文件夹。
5. 运行 MovThresh。
6. 一次导入一个图像堆栈。
7. 选择 Smoothed Curve（平滑曲线 ），然后运行 Rethreshold（重新阈值）。
8. 另存为 Mask_Image 编号 在标有 Masks 的新文件夹中。
9. 将所有图像堆栈转换为蒙版后，在 ImageJ 软件中打开图像堆栈²⁵.
   1. ImageJ 中的细胞面积分析
      1. 在 ImageJ 中打开所有蒙版图像堆栈。
      2. 调整 Set Measurements to Area （设置测量值到 面积）。
      3. 单击 Plugins |宏 |记录。
      4. 单击 Process |二进制 |Make Binary（设为二进制）。
         1. 选择 默认 选项。
            注意： 录制宏时不要点击任何额外的内容。如果包含其他步骤，建议从步骤 6.9.1.3 重新启动。
      5. 单击 Analyze |分析粒子。
         1. 取消选中除 Summary 之外的所有框。
      6. 完成录制并单击 创建 制作宏。
      7. 选择 Run for each image stack 后点击它并保存每个图像堆栈的结果表。默认选项将另存为 csv 文件。
      8. 保存宏并重复使用以供将来分析（可选）。
   2. 在电子表格中处理区域数据
      1. 对于分析的每个细胞，从用雷帕霉素激活之前拍摄的图像中平均细胞面积。
      2. 将所有面积值除以雷帕霉素添加之前的细胞的平均面积。
      3. 计算所有成像细胞的每个时间点的平均值并确定 90% 置信区间。绘制数据。
   3. 细胞突起活性分析
      1. 将 ProActive 文件夹复制到图像分析文件夹中。
      2. 将蒙版图像堆栈从 MovThresh 复制到新创建的 ProActive 文件夹中。
      3. 打开 MatLab 并将目录设置为 ProActive 文件夹。
      4. 运行 ProActive。
      5. 将蒙版单元格图像堆栈文件导入到 ProActive GUI 中。
      6. 定义活动的类型。突出活动分析将生成 面积增益 数据;回缩活动分析将生成 区域丢失 数据;总活动将生成 整体面积变化 数据（损失和获得）。
      7. 将 area 设置为 Define Normalization。
      8. 使用建议的阈值或使用平均值对每个时间点进行平滑曲线重新阈值。这将对特定窗口的阈值进行平均，从而最大限度地减少时间点之间阈值的不一致。
      9. 单击 File （文件） |另存为 |结果 （.mat）
         1. 如果处理所有三种类型的区域活动，请按如下方式命名已处理的数据文件： ProResultData #、RetResultData # 或 ResultData #。
            注意：在数字前包含空格，并从 1 开始对数据进行编号。
      10. 从步骤 6.9.3.6 开始重复。对于导入的所有蒙版图像堆栈。
      11. 处理完所有单元格后，关闭 ProActive GUI。
      12. 在 Matlab 编辑器中打开 DataToFileTotalArea 以处理总活动 “ResultData” 文件。
      13. 更改单元格数以匹配已生成的结果文件数。如果在步骤 6.9.3.5–6.9.3.10 中处理了 7 个单元格，请确保脚本的前三行如下所示：
          filename='结果数据 ';
          细胞=1：7;
          滞后 = 1;
      14. 点击 Run 并对 DataToFileProtArea 和 DataToFileRetArea 重复此操作，以分别处理突出和撤回数据。此分析将生成三个文本文件 “AllCells.txt”、“AllCellsPro.txt” 和 “AllCellsRet.txt”
      15. 在电子表格中打开 .txt 文件，并按照 6.9.2 节进行规范化。计算所有成像细胞的每个时间点的平均值并确定 90% 置信区间。绘制数据。
          注意：上述步骤的结果图应类似于 图 6。

Results

图 4 显示了基于桩蛋白的磷酸酶活性测定的预期结果。在本实验中，使用磷酸桩蛋白作为读数，将组成型活性和显性负 Shp2 磷酸酶活性与活性和非活性 RapR-Shp2 的活性进行比较。对 Shp2 构建体进行免疫沉淀，并按照方案中所述进行活性测定。组成型活性 Shp2 和活性 RapR-Shp2 的磷酸化桩蛋白读数相似，表明活性 RapR-Shp2 没有受到 RapR 结构域引入的负面影响，并且在激活后保持完全活性。显性阴性 Shp2 和失活的 RapR-Shp2 也相似，表明 RapR-Shp2 构建体在失活时不具有活性。这表明 RapR-磷酸酶的设计成功。用于该检测的磷酸化底物可能因目标磷酸酶而异。

图 5 与 图 4 类似，比较了组成型活性、显性阴性以及活性和非活性 RapR-Shp2。该实验是在不对构建体进行免疫沉淀的情况下进行的。相反，它旨在表征细胞内 RapR-Shp2 构建体的下游信号传导效应。在这里，Shp2 构建体在 HEK293T 细胞中表达。下游效应子 ERK1/2 在 RapR-Shp2 激活后磷酸化增加，就像在组成型活性样品中一样。失活的 RapR-Shp2 没有诱导这种变化。这表明 Shp2 的下游信号转导在掺入 RapR 结构域后得以保留。同样，已知的磷酸化底物 EGFR 和 PLCγ 在 A431 细胞中响应 RapR-Shp2 激活而被去磷酸化。

最后， 图 6 显示了 RapR-Shp2 激活对 HeLa 细胞形态动力学的结果。一旦 RapR-Shp2 被激活，细胞的突出活性和细胞面积就会增加。这表明 RapR-Shp2 激活足以诱导 HeLa 细胞的形态动力学变化，并可能允许研究人员探测导致这种效应的特定下游信号通路。

图 4：基于桩蛋白的活性测定的结果： 组成型活性、显性阴性和 RapR-Shp2 被免疫沉淀，并使用概述的方案进行活性测定。CA 和 RapR-Shp2 中 pY31 桩蛋白的水平相似，表明一旦激活，RapR-Shp2 构建体与 CA Shp2 具有相似的活性。未活化的 RapR-Shp2 样品没有活性，与 DN 样品相似，表明它没有“泄漏”。该图是从 Fauser 等人 ¹² 修改而来的。缩写：RapR = 雷帕霉素调节;Shp2 = 包含 Src 同源-2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶;DN = 显性负数;CA = 组成性活跃;FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：全细胞裂解物测定的结果： 组成型活性、显性阴性和 RapR-Shp2 在 HEK293T 细胞中表达，全细胞裂解物方案完成。当失活时，RapR-Shp2 不会通过磷酸化激活 ERK1/2，这与 DN Shp2 样品类似。这表明 RapR-Shp2 在非活性时没有活性。一旦激活，ERK1/2 磷酸化水平与 CA Shp2 样品相似，表明 Shp2 成功激活并进行下游信号转导。同样，表达 RapR-Shp2 的 A431 细胞显示 EGFR 和 PLCγ 的磷酸化降低，这两种物质都是 Shp2 的已知底物。该图是从 Fauser 等人 ¹² 修改而来的。缩写：RapR = 雷帕霉素调节;Shp2 = 包含 Src 同源-2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶;DN = 显性负数;CA = 组成性活跃;ERK = 细胞外信号调节激酶;GAPDH = 甘油醛 3-磷酸脱氢酶;EGFR = 表皮生长因子受体;PLCγ = 磷脂酶 C γ;FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：基于实时成像的细胞面积和突出活性数据分析： 用 RapR-Shp2 转染 HeLa 细胞，并按照概述的实时成像方案进行。按照数据分析方案中的概述对数据进行分析。一旦激活（由垂直灰线表示），HeLa 细胞的细胞突出活性和细胞面积均显示增加。在仅表达 FRB 的阴性样品中，不存在这种活性。这表明 RapR-Shp2 激活诱导 HeLa 细胞内的快速形态动力学变化，并促进细胞扩散和突出。该图是从 Fauser 等人 ¹² 修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

该方案为化学遗传学控制的磷酸酶的开发、表征和应用提供了详细的步骤。RapR-Shp2 工具依赖于插入 Shp2 催化结构域的雷帕霉素调节开关。该工具的优势在于磷酸酶活性的特异性和严格的时间控制。该工具适用于其他磷酸酶，并与先前描述的 RapR-TAP 技术相结合，允许重建单个下游信号通路²⁶。RapR 方法的独特功能使研究人员能够识别由 Shp2 激活诱导的瞬时事件，并剖析调节单个形态动力学过程的特定下游信号通路。

几个关键因素会影响 RapR 磷酸酶的设计。目标磷酸酶催化结构域的高分辨率晶体结构对于指导 iFKBP 插入位点的选择非常有帮助。然而，由于酪氨酸磷酸酶之间的高度结构相似性，催化结构域氨基酸序列的比对可以为插入位点的识别提供足够的信息，如 Shp2 与 PTP1B 和 PTPPest 的比对所示（图 2）。对于 RapR-Shp2，位于通过 β 链的关键催化 WPD 环偶联的位点的 Val406 被选为最佳插入位点。相同的插入位点可能导致其他 PTP 酶的成功调节，如 PTP1B 和 PTP-PEST¹² 所证明的那样（图 2A）。

如果感兴趣的磷酸酶是多结构域蛋白，则有关结构域组织的结构信息将有助于防止干扰 PTP 酶的其他功能。影响最佳 RapR-PTP 酶设计的另一个因素是插入的 iFKBP 应替换多少个氨基酸。PTPase 中更大、更灵活的插入环可能需要额外的缩短，以确保 iFKBP 对催化活性的严格调节。同样，将 iFKBP 连接到 PTPase 的连接子的长度和组成也会影响调节效率。由单个 Gly 残基组成的短接头将提供更严格的调节，但如果它们引入持续的结构扭曲，即使 iFKBP 与雷帕霉素和 FRB 结合，也可能会降低酶的最大活性。中等长度的 Gly-Ser-Gly 接头具有更大的灵活性，但对于某些 PTP 酶来说可能不够刚性。由 Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly 组成的长接头将有助于防止形成可能影响 PTPase 调节的意外二级结构。RapR-Shp2 用所有三种类型的接头进行了测试;发现 Gly-Ser-Gly 连接子是最佳的。

决定 RapR 工具成功开发的一个关键方面是建立稳健的磷酸酶测定和适当对照的存在。将 RapR 磷酸酶活性与 POI 的显性阴性和组成型活性版本的活性进行比较，可以评估 RapR 构建体的泄漏性和激活程度。此外，组成型活性磷酸酶缺乏去磷酸化或显性负突变体磷酸化降低将表明反应条件不当。

对于磷酸酶测定，反应条件需要针对每种 PTP 酶进行优化。调整温度、反应时间和缓冲液条件将取决于感兴趣的 PTP 酶。样品的剧烈搅拌对于确保琼脂糖凝胶结合的 PTP 酶及其底物充分混合至关重要。最后，如果所描述的磷酸酶测定法对于特定的目标 PTP 酶不是最佳的，则使用 对硝基苯磷酸酯作为底物的磷酸酶反应可用作替代测定法²⁷。

在活细胞成像实验中，制备样品时应考虑几个标准。概述的方案使用基于 HEPES 缓冲液的 L-15 培养基，该缓冲液对 CO₂ 浓度不敏感。如果需要使用基于碳酸氢盐的培养基，则应补充 HEPES 以维持样品的 pH 值，或者应使用补充 CO₂ 的环境成像室。该方案建议在样品顶部涂上一层矿物油，以防止蒸发并简化雷帕霉素的添加。可以使用使用环境成像室或封闭室的其他设置，但添加雷帕霉素可能更具挑战性。在成像时向细胞中添加雷帕霉素时，确保载物台不会移动并且细胞不会受到干扰。在成像过程中样品的任何额外移动都会阻碍数据收集。应保持较低的照明强度和曝光时间以减少光毒性，尤其是对于长期成像。细胞的足够转染效率也至关重要。FRB 与 RapR-Shp2 DNA 的 1：1 比例可提供足够的表达，但对于新的构建体，该比例需要调整。为确保有效激活，FRB 的表达水平应高于 RapR 磷酸酶。

基于 RapR 的工具的一个限制是无法快速停用。更换培养基会去除细胞外雷帕霉素，但由于雷帕霉素与 RapR 构建体的结合非常紧密，因此 RapR 构建体的失活可能需要数小时。通过添加 PTP 酶的活性位点抑制剂，可以实现快速灭活。然而，抑制剂的潜在脱靶效应可能使结果的解释具有挑战性。此外，即使与 PTPase 抑制剂联合使用，RapR 方法也不能用于循环激活/失活实验。RapR 系统的另一个限制是缺乏空间控制。RapR 构建体在细胞中的任何地方都表达，因此被激活。一种潜在的解决方案是笼状雷帕霉素的应用，它可以在细胞中局部通过近紫外光释放^28,29。此外，可以修改 RapR 工具，以在特定蛋白质复合物或特定亚细胞位置激活目标磷酸酶。通过将结合伴侣或亚细胞标签连接到 FRB，RapR-PTP 酶将靶向细胞中的特定蛋白质或位置。最后，雷帕霉素是一种通过 mTOR 抑制作用的明确表征的免疫抑制剂，可以影响细胞信号传导，从而可能破坏目标 PTP 酶的信号传导。为了克服这种担忧，雷帕霉素的非免疫抑制类似物（iRap 和 AP21967）是一个很好的选择。两种化合物均被证明可调节 RapR 构建体¹⁴。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL 试管	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli 缓冲液			用于 500 mL：5.18 g Tris-HCL、131.5 mL 甘油、52.5 mL 20% SDS、0.5 g 溴酚蓝，最终 pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	BioRad	4561096
5x Phusion Plus 缓冲液	Thermo Scientific	F538L
A431 细胞	ATCC	CRL-1555
琼脂糖	GoldBiotech	A-201
Attofluor 细胞室	invitrogen	A7816
基准胎牛血清 （FBS）	Gemini 生物制品	100-106	热灭活三重 0.1 & 微量;m 无菌过滤
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	发表于 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red 质膜染料	invitrogen	c10046
菌落筛选 MasterMix	Genesee	42-138
DH5a 感受态细胞	NEB	C2987H
DMEM	康宁	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA 分子量标准	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI 酶	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-二硫苏糖醇，Cleland's 试剂
EGTA	Acros	409910250
来自牛血浆的纤连蛋白	Sigma	F1141
FuGENE（R） 6 转染试剂	Promega	E2692	转染试剂
凝胶提取试剂盒	Thermo Scientific	K0692	GeneJET 凝胶提取试剂盒
凝胶绿色核酸染色	GoldBio	G-740-500
凝胶上样染料 紫色 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l （100x） 100 mL
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268
HeLa 细胞	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ 处理软件	N/A	N/A
Igepal CA-630 （NP40）	Sigma	I3021
咪唑缓冲液			25 mM 咪唑 pH 7.2、2.5 mM EDTA、50 mM NaCl、5 mM
DTT KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	康宁	10-045-CV
LB 琼脂	Fisher	BP1425-2
裂解缓冲液			20 mM Hepes-KOH，pH 7.8,50 mM KCl，1 mM EGTA，1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b 更新用于运行 CellGeo 功能
变形显微镜自动化和图像分析软件	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
矿物油	Sigma	M5310
MiniPrep 试剂盒	基因Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX 预制胶 12 孔	Bio-Rad	4561085
分子生物学级 水	康宁	46-000-CV
多波段多色镜	Chroma 技术	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
奥林巴斯 UPlanSAPO 40x 物镜	奥林巴斯	N/A
不含 Ca 和 Mg 的 PBS	康宁	21-031-CV
PCR 管	labForce	1149Z65,0.2	mL 8 联排管和盖，硬质条带，独立连接的圆顶盖，
Phusion 加 DNA 聚合酶，	Thermo Scientific	F630S
引物，	IDT
蛋白-G 琼脂糖，	Millipore	16-266
PVDF 膜	BioRad	1620219	免疫印迹 PVDF/滤纸三明治
雷帕霉素	Fisher	AAJ62473MF
0.25% 胰蛋白酶、2.21 mM EDTA、1x [-] 康	宁	25-053-CI
Tris-乙酸-EDTA （TAE） 50x	Fischer	BP1332-1	用于电泳
洗涤缓冲液			20 mM Hepes-KOH，pH 7.8,50 mM KCl，100 mM NaCl、1 mM EGTA、1% NP40
&β;-巯基乙醇	Fisher Chemical	O3446I-100
抗体
抗 EGFR 抗体	细胞信号传导	2232
抗 ERK 1/2 抗体	细胞信号传导	9102
抗 Flag 抗体	Millipore-Sigma	F3165
抗 GAPDH 抗体	抗	GFP
抗体 抗 GFP 抗体	Clontech	632380
抗 mCherry 抗体
		BDB612405
抗磷酸化 EGFR Y992 抗体	细胞信号传导	2235
抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204抗体	细胞信号传导	9101
抗磷酸桩蛋白 Y31 抗体	Millipore-Sigma	05-1143
抗磷酸化 PLC&γ;Y783 抗体	Cell Signaling	14008
Anti-PLC&γ;抗体	细胞信号转导	5690