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雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

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DOI：

10.3791/67142

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2024年9月6日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

本文内容

摘要

本方案描述了雷帕霉素调控的磷酸酶的设计、构建及应用。该方法可在活细胞中实现磷酸酶激活的高度特异性和严格的时空调控。

摘要

酪氨酸磷酸酶是一类重要的酶家族，可调控关键的生理功能。这类酶在人类疾病中常出现失调，因此成为生物学研究的关键靶点。能够调控磷酸酶活性的工具对于解析其功能至关重要。传统的研究方法，例如组成型活性或显性负性突变体的过表达，或利用siRNA进行下调，均缺乏时间上的控制。磷酸酶抑制剂通常特异性较差，且仅能帮助研究人员确定哪些过程受到磷酸酶活性抑制的影响。

我们开发了一种化学遗传学方法，即雷帕霉素调控（RapR）系统，该系统可实现对磷酸酶催化结构域的变构调控，从而对磷酸酶的激活进行严格的时间控制。RapR系统包含一个插入磷酸酶变构位点内的iFKBP结构域。RapR结构域固有的结构动力学会破坏催化结构域，导致酶失活。加入雷帕霉素后，可介导iFKBP与共表达的FRB蛋白形成复合物，从而稳定iFKBP并恢复磷酸酶催化结构域的活性。

该系统可在活细胞中实现磷酸酶激活的高特异性及严密的时间控制。该系统的独特功能使得研究人员能够识别磷酸酶下游信号通路中的瞬时事件，并对单个信号通路进行深入探究。本实验方案详细阐述了构建RapR-磷酸酶的指导原则、其生物化学表征方法，以及对其下游信号转导和细胞形态动力学调控作用的分析流程。同时，本文还提供了蛋白质工程策略的详细说明。 体外 分析磷酸酶活性的检测方法，以及通过活细胞成像实验鉴定细胞形态变化。

引言

蛋白酪氨酸磷酸酶是一类关键的蛋白质家族，参与多种细胞信号传导事件。研究表明，它们在调控细胞增殖、迁移和凋亡中发挥核心作用1,2,3。因此，蛋白酪氨酸磷酸酶的失调会导致多种严重疾病和功能紊乱4,5,6,7。由于长期以来缺乏用于探究磷酸酶信号通路复杂机制的工具，酪氨酸磷酸酶的生理功能及其在这些病理过程中的作用研究一直受到限制8。

传统上，磷酸酶的研究方法往往缺乏理想的特异性，和/或无法实现对其活性的时间控制。现有工具的这些关键局限性使得解析磷酸酶在信号通路中的特定功能变得困难。过表达组成型活性突变体或显性负性突变体，或下调磷酸酶的表达水平，虽可提供一定特异性，但缺乏时间控制，且常会引发代偿性机制，从而掩盖酶的真实功能。

药理学抑制剂可用于实现磷酸酶的时间调控。然而，由于酪氨酸磷酸酶的活性位点结构高度保守，许多磷酸酶抑制剂存在显著的非特异性问题9。此外，由于设计上的限制，靶向催化位点的抑制剂通常细胞膜通透性较差10。抑制剂的另一个局限性在于，它们仅能用于研究磷酸酶失活所产生的效应11。因此，亟需开发能够实现特异性、可时间调控的磷酸酶激活工具。这类工具将使研究人员能够识别磷酸酶激活的直接效应，并将其与生物刺激常引发的多条平行信号通路区分开来。尤为重要的是，对活性进行严密的时间控制，有助于识别磷酸酶诱导的瞬时事件，并区分急性与持续性磷酸酶活性的不同效应。将时间调控与突变分析相结合，可深入解析磷酸酶各个结构域的特定功能，并探究其下游信号通路12。

为解决现有工具在功能上的不足，Karginov 研究组开发了雷帕霉素调控（Rapamycin Regulated, RapR）系统13,14,15。RapR 系统利用一种经过工程化改造的开关结构域 iFKBP，可实现对目标蛋白（protein of interest, POI）的变构调控。将 iFKBP 结构域插入与 POI 催化位点存在变构偶联的位置，可使其对雷帕霉素产生响应。在无雷帕霉素存在时，iFKBP 因其固有的高度结构动态性而破坏 POI 的催化位点，从而使其失活。加入雷帕霉素后，iFKBP 与共表达的蛋白 FRB 发生相互作用（图 1），导致开关结构域得以稳定，进而恢复 POI 催化结构域的结构与功能。因此，该工具可实现对 POI 的特异性、时间可控的激活。

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图 1：RapR-Shp2 雷帕霉素调控系统的示意图。 RapR 可通过添加雷帕霉素实现对目标蛋白的变构激活。本图改编自 Fauser 等人12。缩写：iFKBP = 可插入的 FKBP12；FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域；R = 雷帕霉素；Shp2 = 含 Src 同源 2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶。 请点击此处查看该图的放大版本。

RapR 工具可应用于不同的蛋白质家族，可用于调控蛋白激酶以及磷酸酶12,14。本方案将重点介绍 RapR 工具在控制 Shp2 磷酸酶中的应用。Shp2 是一种广泛表达的蛋白酪氨酸磷酸酶，参与细胞增殖、迁移、免疫调节和分化等信号传导过程1,16,17,18。Shp2 的失调已与多种实体瘤、髓系白血病及发育障碍相关5,7。然而，Shp2 同样受到上述工具局限性的制约。为克服这些限制，研究人员开发并表征了一种可特异性且时间可控的 Shp2 构建体——RapR-Shp212。

在开发 RapR-Shp2 之前，已知 Shp2 参与细胞迁移过程19,20,21。然而，Shp2 在此过程中所涉及的信号通路中的具体作用尚不清楚。Shp2 调控细胞迁移的时间尺度，以及在其激活的不同时间点所诱导的特定形态动力学变化，也尚未明确。此外，急性激活与持续激活 Shp2 是否会产生不同的效应仍不清楚。利用 RapR-Shp2，研究发现急性激活 Shp2 可诱导短暂的细胞铺展、突出结构增加、细胞极化以及细胞迁移。同时鉴定出 Shp2 下游调控不同形态动力学变化的特定信号通路12。本实验方案详细介绍了 RapR-Shp2 的设计与表征方法，可为其他 RapR 磷酸酶的开发与应用提供指导。

方案

1. RapR-磷酸酶的设计

  1. 规划
    注意：本方案以 RapR-Shp2 为例，详细说明了构建雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的重要步骤。该方案针对 Shp2 进行了优化，对于其他特定磷酸酶可能需要额外的调整。
    1. 为了确保 Shp2 的催化活性完全由雷帕霉素控制，而非内源性机制调控，需在磷酸酶中引入突变，使其保持持续激活的构象。对于 Shp2，应引入 D61A 突变。
      注意：如果未对特定蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）引入激活突变，则其 RapR 变体将作为“与门”系统发挥作用，同时受内源性信号和雷帕霉素的共同调控。
    2. 利用晶体结构指导选择磷酸酶催化结构域中 iFKBP 的插入位点，方法如前所述13。若无可用结构，可将目标磷酸酶的催化结构域与 Shp2 磷酸酶进行氨基酸序列比对，以确定插入位点（图 2A）。确保插入位点位于柔性环区，该区域在结构上与催化口袋耦合，但位置远离催化口袋，以避免 iFKBP 对底物结合造成空间位阻。
      注意：插入位点的更多细节在讨论部分进一步阐述。
    3. 考虑在插入的 iFKBP 结构域与目标磷酸酶之间所使用的连接序列类型。选择最优的连接序列对 RapR 工具的成功至关重要，相关内容在讨论部分进一步说明（图 2B）。

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图2：设计RapR-磷酸酶时的考虑示意图。（A）Shp2（紫色）、PTP1B（绿色）和PTP-PEST（粉红色）的比对，其中保守的插入位点已高亮显示。（B）Shp2与iFKBP之间连接子插入的示意图。（C）Shp2的磷酸酶结构域（米色），插入位点以蓝色标出。本图改编自Fauser等人的研究12。缩写：Shp2 = 含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶；iFKBP = 可插入的FKBP12；PTP = 蛋白酪氨酸磷酸酶；RapR = 雷帕霉素调控的。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. RapR 磷酸酶的构建

  1. 使用改良的定点诱变技术将iFKBP插入目标磷酸酶中
    1. 生成编码iFKBP的序列 "大引物" 通过PCR。
      1. 设计引物 "大引物" 合成片段包含20-25个核苷酸，可与iFKBP的5'或3'端退火，一段连接iFKBP与目标磷酸酶的接头序列，以及28-32个对应于插入位点的核苷酸图3）确认所得产物包含位于目标磷酸酶插入位点上下游同源片段之间的 iFKPB。
      2. 合成含iFKBP的 "大引物" 通过PCR（10 µL 5× 聚合酶缓冲液 1 µL 50 ng/µL 含有 iFKBP 的模板 DNA， 2 µL 10 mM dNTP 0.5 µL 的 100 µM 每种的储备液 "大引物" 引物 [正向与反向]， 35 µL 水 1 µL DNA聚合酶） 将该PCR反应分为2个独立的反应 25 µL 在进行PCR之前完成反应体系的配制。按照DNA聚合酶生产商的建议或以下标准PCR循环程序运行PCR：（i） 98 °C 2 分钟，（ii） 98 °C 30秒，(iii) 55-70 °C 30 秒，（iv） 72 °C 30秒，（v）重复步骤ii-iv共25次，（vi） 72 °C 2 分钟。
      3. 纯化 "巨引物" 使用琼脂糖凝胶电泳。将上一步的PCR产物加入1%琼脂糖凝胶中，以120 V电泳约30分钟。观察长度为400个核苷酸的条带 "大引物" 在凝胶中切下该片段，并使用胶回收试剂盒进行纯化（参见 材料清单).
        注意：此处可暂停本实验方案。
    2. 改良的定点诱变
      1. 使用含有目的磷酸酶基因的质粒作为模板，制备改良的定点突变反应5 µL 5x 聚合酶缓冲液 2 µL 50 ng/µL 模板 2 µL 10 mM dNTP 10 µL 提取的 "大引物", 2.5 µL 水 2.5 µL DMSO 1 µL DNA聚合酶的
        注意：在反应体系中加入DMSO会降低退火温度22.
      2. 运行以下PCR循环：初始变性步骤在 98 °C 3 分钟，随后进行 18 个循环的连续步骤，每个循环包括在指定温度下的孵育 98 °C 30 秒， 65 °C 20秒， 60 °C 20 秒 55 °C 20 秒 50 °C 20秒， 72 °C 18分钟。运行循环过夜（循环时间为7小时）。循环结束后，将PCR反应产物保存于 4 °C.
        注：此处可暂停本实验方案。
      3. 循环结束后，加入 1 µL 的 DpnI 酶和37℃孵育 37 °C 1小时。
        注意： DpnI 将消化残留的模板，从而提高新合成产物的产量。
      4. 将消化产物转化至DH5α中α 根据制造商说明处理感受态细胞。将转化产物接种于含有适当抗生素的LB琼脂平板上进行筛选（pcDNA RapR-Shp2质粒使用羧苄青霉素）。于37°C培养 37 °C 过夜。待菌落生长后，将LB平板置于 4 °C 长达1个月。
        注意：此处可暂停本实验方案。
  2. 含RapR-磷酸酶的目的DNA构建体的分离
    1. 对细菌菌落进行PCR筛选23由于LB平板上生长的菌落并非全部含有目的质粒，因此在质粒DNA提取前务必进行筛选。
      注意：使用能与模板及iFKBP基因结合的引物进行扩增。该检测可采用Taq聚合酶预混液进行（参见 材料清单).
    2. 一旦鉴定出阳性菌落，挑取一个阳性菌落接种于含有适当抗生素的3 mL LB肉汤培养基中，培养并振荡培养 37 °C 过夜。
    3. 按照质粒DNA提取试剂盒的说明书，从液体培养物中提取质粒DNA（参见 材料表)
      注意：建议在继续实验前对新构建的RapR PTPase质粒进行测序 体外 评估

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图3：引物设计及改良的定点突变克隆策略示意图。 第一步是合成含有“黏性末端”的iFKBP“大引物”，该末端可与目标磷酸酶插入位点互补配对；第二步是将该“大引物”插入至目标磷酸酶中。本图改编自Karginov等人的研究13。缩写：iFKBP = 可插入的FKBP12。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. RapR-PTPase 的评估方法 体外 活性测定

注意：本方案用于评估工程化 RapR-PTPase 活性的调控。以下描述的是使用磷酸化的 paxillin 氨基末端片段作为底物，对免疫沉淀的 Shp2 进行分析。针对特定的兴趣 PTPase，可能需要选择不同的底物。

  1. 第1天
    1. 在6孔组织培养板中，每孔接种800,000个HEK293T细胞，使用添加L-谷氨酰胺（终浓度为2 mM）和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
  2. 第2天
    1. 当细胞融合度达到约60–80%时，根据所选转染试剂生产商提供的操作说明进行转染（参见材料表）。
      1. 转染操作示例：将质粒DNA（pcDNA-mCherry-FRB和pcDNA-flag-RapR-Shp2各1 µg）加入200 µL无血清DMEM中，再加入6 µL转染试剂，室温孵育15分钟。每孔细胞加入100 µL转染混合物。设置转染组成型激活型和显性负性Shp2构建体的样本作为对照。在37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。
  3. 第3天
    1. Protein-G Sepharose的制备
      注意：在处理Sepharose前，需预先准备剪口移液枪头。所有涉及Sepharose的操作步骤均应使用剪口枪头。每次移液前，必须充分重悬Sepharose。
      1. 充分重悬Protein-G Sepharose，并取适量转移至1.5 mL离心管中。每6孔板中的每孔使用10 µL Protein-G Sepharose；完整6孔板共使用60 µL Sepharose。
      2. 用1 mL裂解缓冲液（参见材料表）洗涤Sepharose。在2,000 × g条件下微量离心1分钟，小心吸除裂解缓冲液。重复洗涤2次。
      3. 将Sepharose重悬于380 µL裂解缓冲液中。加入BSA至终浓度为1 mg/mL，并加入抗体（每个免疫沉淀样本0.5 µL，抗Flag抗体[参见材料表]）。4 °C条件下在旋转仪上翻转孵育1.5小时。
        注意：每种抗体的最佳使用量应通过实验确定。
    2. 准备用于免疫沉淀的细胞。
      1. 向样本中加入适量雷帕霉素（乙醇配制的1 mM储存液），使其终浓度为1 µM；或向阴性对照样本中加入等体积的乙醇。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。
      2. 将含细胞的 6孔板置于冰上，用3 mL预冷的PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，每孔加入300 µL裂解缓冲液（激活磷酸酶样本中含1 µM雷帕霉素，阴性对照样本中含等体积乙醇），用细胞刮刀刮取细胞。将样本转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、1,000 × g条件下微量离心10分钟。
      3. 取20 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中，用于检测表达水平。向每管用于检测表达的样本中加入20 µL含5% β-巯基乙醇的2× Laemmli缓冲液，在95–100 °C孵育5分钟。剩余上清液用于步骤3.3.3.3中的免疫沉淀。
    3. RapR-Shp2的免疫沉淀
      1. 用1 mL裂解缓冲液洗涤步骤3.3.1.3中制备的Protein-G Sepharose。每次在4 °C、2,000 × g条件下微量离心1分钟，小心吸除裂解缓冲液。重复此步骤2次。
      2. 使用剪口枪头，将Sepharose重悬于裂解缓冲液中（每样本50 µL，因此6孔板共用300 µL裂解缓冲液）。用移液器将50 µL重悬的Sepharose混合物分别加入各新1.5 mL离心管中。
        注意：由于Sepharose本身占据体积，裂解缓冲液中重悬的Sepharose会有剩余。
      3. 将步骤3.3.2.3中制备细胞后剩余的上清液分别加入各Sepharose管中。4 °C条件下旋转孵育1.5–2小时。
    4. 磷酸酶活性检测
      注意：Shp2底物应通过使用组成型活性Src激酶对纯化的paxillin N端片段进行磷酸化来制备，具体操作参照先前描述的激酶反应方案12。
      1. 在步骤3.3.3.3接近结束时，准备磷酸化paxillin溶液。每样本向40 µL总咪唑缓冲液（参见 材料表）中加入磷酸化paxillin溶液（终浓度为3 µg/mL）。向激活RapR-Shp2样本的磷酸化paxillin溶液中加入雷帕霉素至终浓度1 µM，向非激活样本中加入等体积乙醇。
      2. 将加热振荡仪设定为32 °C。
        注意：其他磷酸酶可能需要不同温度以达到最佳活性。
      3. 用0.5 mL裂解缓冲液（参见 材料表）洗涤步骤3.3.3.3中的Sepharose样本2次，再用0.5 mL洗涤缓冲液洗涤2次。每种缓冲液中均应含有1 µM雷帕霉素（激活样本）或等体积乙醇（非激活样本）。 最后一次洗涤后，尽可能彻底去除缓冲液。
        注意：进行此步骤时，建议使用移液器缓慢而小心地吸除最后残留的缓冲液，以避免吸走Sepharose颗粒。残留缓冲液会影响磷酸化paxillin的浓度，导致检测结果不准确。
      4. 向每个样本中加入40 µL已配制的磷酸化paxillin咪唑缓冲液混合物（根据样本决定是否含雷帕霉素）。轻轻弹动混匀后立即放入加热振荡仪中，在32 °C孵育40分钟。将振荡速度设为至少1,000 rpm，确保孵育期间样本充分混匀。
      5. 通过向每个样本中加入40 µL 2× Laemmli缓冲液终止反应。将样本在95–100 °C孵育5分钟，随后冷却样本。
      6. 取每个样本15 µL（包括步骤3.3.2.3中的裂解液样本）上样至4–15%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，使用PVDF膜进行标准Western blot操作。
      7. 使用抗Flag抗体检测RapR-Shp2构建体，抗mCherry抗体检测mCherry-FRB，抗pY118或抗pY31 paxillin抗体检测paxillin的磷酸化水平。
        注意：所得Western blot结果应与图4相似。

4. 活细胞中 RapR-Shp2 活性的分析

注意：本方案用于确定 RapR-Shp2 去磷酸化内源性底物并诱导下游信号传导的能力。其他 RapR-PTP 酶则需要对其特异性底物和通路进行分析。

  1. 第1天
    1. 在6孔组织培养板中，每孔接种198,000个A431细胞，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和L-谷氨酰胺（终浓度为2 mM）的DMEM。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
  2. 第2天
    1. 通过将腺病毒直接加入培养皿中的培养基，感染表达RapR-Shp2和FRB的腺病毒载体。将腺病毒与细胞共孵育，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜。以仅感染FRB的细胞作为阴性对照。
      注：腺病毒用量需根据滴度情况逐案确定。
  3. 第3天
    1. 实验前，将A431细胞在含0.5% FBS的DMEM中饥饿培养4小时。
    2. 向细胞中加入雷帕霉素至终浓度为1 µM，或加入等体积乙醇（阴性对照），孵育2–4小时。
      注：其他磷酸酶的孵育时间可能有所不同。
    3. 将 含细胞的6孔板 置于冰上，用3 mL预冷的PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS，每孔加入300 µL裂解缓冲液（见材料表），用力刮取细胞。将样品转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、2,000 × g条件下离心5分钟。
    4. 将各250 µL样品转移至新的1.5 mL离心管中，加入250 µL含5% β-巯基乙醇的2× Laemmli缓冲液，于95–100 °C孵育5分钟。
    5. 每样取25 µL上样至4–15%梯度SDS-PAGE凝胶，使用PVDF膜进行标准Western blot操作。
    6. 使用抗pY992 EGFR抗体和抗pY783 PLCγ抗体检测RapR-Shp2介导的EGFR和PLCγ去磷酸化；通过检测pT202/pY204位点的磷酸化水平评估MAP激酶Erk1/2的下游激活情况。
      注：所得Western blot结果应与图5相似。

5. 使用活细胞成像分析RapR-Shp2激活在HeLa细胞中诱导的形态动力学变化

注意：本方案用于确定激活 RapR-Shp2 对细胞突起形成、细胞铺展和迁移的影响。

  1. 第1天
    1. 在35 mm细胞培养皿中接种700,000个HeLa细胞，并置于37 °C、5% CO2的培养箱中。使细胞贴壁（约2–3 h）。
    2. 根据所选转染试剂生产商的说明书进行细胞转染（参见材料表）。
      1. 示例转染方案：将0.5 µg DNA（pcDNA-mCherry-FRB和pcDNA-Venus-RapR-Shp2质粒各0.5 µg）加入100 µL无血清DMEM中，再加入6 µL转染试剂。室温孵育15 min。将转染混合物加入细胞中，在37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。使用仅转染pcDNA-mCherry-FRB的细胞作为阴性对照。
    3. 将一张活细胞成像用#1.5规格25 mm圆形玻璃盖玻片用纤连蛋白（5 mg/L）包被，在37 °C孵育1 h。
  2. 第2天
    1. 用PBS洗涤包被好的玻璃盖玻片。
    2. 将转染后的HeLa细胞接种至包被的玻璃盖玻片上，使用含10% FBS和L-谷氨酰胺（终浓度2 mM）的DMEM培养基，使成像前4 h达到30%汇合度。
    3. 接种后2 h，轻柔更换培养皿中的培养基为预温的无血清Leibovitz L-15培养基，继续孵育2 h。
    4. 根据试剂说明书，用CellMask Deep Red质膜染料对细胞进行染色。
    5. 将盖玻片放入洁净的成像细胞腔室中（参见材料表）。加入1 mL预温的L-15培养基，并覆盖1 mL预温的矿物油以防止蒸发。将腔室保持在37 °C直至成像。
    6. 使用加热载物台在37 °C下对细胞进行成像。 
      1. 选择合适的荧光通道用于RapR构建体和CellMask的落射荧光成像。为遵循本方案，使用指定的40倍物镜（参见材料表）及以下滤光片组合：Venus-RapR-Shp2成像使用514/10激发滤光片和540/21发射滤光片；mCherry-FRB成像使用561/10激发滤光片和595/40发射滤光片；CellMask Deep Red成像使用640/20激发滤光片和655LP发射滤光片。所有荧光通道使用多通带二向色镜（参见材料表）。
      2. 每2 min采集一次图像，持续4–4.5 h。
        注：更快的形态动力学变化需要更频繁的图像采集。
      3. 成像1 h后，加入雷帕霉素至终浓度1 µM，以激活RapR-Shp2。

6. 图像分析

注意：本方案将描述如何基于活体成像实验中采集的 .TIF 图像序列文件创建细胞掩膜。随后将介绍如何在 ImageJ 中创建宏以分析这些掩膜，从而生成随时间变化的细胞面积数据表格。最后，将使用 Metamorph 软件分析细胞的突出与回缩活动。

  1. 通过使用 CellMask 图像生成二值掩膜 MovThresh 来自 CellGeo 软件包的功能24.
  2. 将 MovThresh 文件夹复制到图像分析文件夹中。
  3. 将CellMask或其他膜标记通道图像复制到MovThresh文件夹中。
    1. 若在同一位置拍摄了多个细胞，应在使用 MatLab 创建掩膜前，对图像进行裁剪，生成仅包含单个细胞的文件。
  4. 确保在 MatLab 中将目录正确设置为 MovThresh 文件夹。
  5. 运行 MovThresh.
  6. 逐个导入图像堆栈。
  7. 选择 平滑曲线 然后运行 重新设定阈值.
  8. 保存为 掩膜图像编号 在一个标记为新文件夹的文件夹中 口罩.
  9. 将所有图像序列转换为掩膜后，在 ImageJ 软件中打开这些图像序列25.
    1. 在 ImageJ 中进行细胞面积分析
      1. 在 ImageJ 中打开所有掩膜图像堆栈。
      2. 调节 设置测量参数 至 面积.
      3. 点击 插件｜宏｜记录
      4. 点击 流程 | 二进制 | 生成二进制.
        1. 选择 默认 选项
          注意：录制宏时不要点击任何多余的内容。如果包含了额外步骤，建议从步骤 6.9.1.3 重新开始。
      5. 点击 分析 | 分析颗粒.
        1. 取消勾选所有复选框，但 摘要.
      6. 结束记录并单击 创建 制作宏。
      7. 命中 运行 为每个图像堆栈选择后保存结果表格。默认选项将保存为 csv 文件。
      8. 保存宏并用于未来的分析（可选）。
    2. 在电子表格中处理区域数据
      1. 对每个待分析的细胞，取雷帕霉素激活前拍摄的图像中该细胞面积的平均值。
      2. 将所有区域值除以雷帕霉素添加前细胞的平均区域值。
      3. 计算所有成像细胞在每个时间点的平均值，并确定90%置信区间。绘制数据图。
    3. 细胞突出活性分析
      1. 将 ProActive 文件夹复制到图像分析文件夹中。
      2. 将MovThresh中的掩膜图像堆栈复制到新创建的ProActive文件夹中。
      3. 打开 MATLAB 并将目录设置为 ProActive 文件夹。
      4. 运行 ProActive.
      5. 将带掩膜的细胞图像堆栈文件导入 ProActive GUI。
      6. 定义活动类型。前伸活动分析将生成 面积增加 数据；回缩活性分析将生成 面积丢失 数据；总活性将生成 总体面积变化 数据（包括丢失和获得的数据）。
      7. 设定区域为 定义归一化.
      8. 使用建议的阈值或每次对各时间点进行均值重阈值化来获得平滑曲线。该方法在特定时间窗内对阈值进行平均，以最小化不同时间点间阈值分割的不一致性。
      9. 点击 文件 | 另存为 | 结果 (.mat)
        1. 若处理全部三种类型的区域活动，将处理后的数据文件按如下方式命名： ProResultData #，RetResultData #，或 结果数据 #.
          注意：在数字前保留空格，并从该数字开始对数据进行编号 1.
      10. 对所有导入的掩膜图像堆栈，重复执行第 6.9.3.6 步。
      11. 所有细胞处理完毕后，关闭 ProActive 图形用户界面。
      12. 打开 数据保存至文件总面积 在Matlab编辑器中处理总活动“ResultData”文件。
      13. 根据生成的结果文件数量，调整细胞的数量。如果在步骤 6.9.3.5–6.9.3.10 中处理了 7 个细胞，请确保脚本的前三行为以下内容：
        文件名=‘Result Data ‘;
        细胞=1:7
        延迟=1；
      14. 命中 运行 分别对 DataToFileProtArea 和 DataToFileRetArea 执行相同操作，以处理突出和收缩数据。该分析将生成三个文本文件：“AllCells.txt”、“AllCellsPro.txt”和“AllCellsRet.txt”。
      15. 在电子表格中打开 .txt 文件，并按照第 6.9.2 节进行归一化处理。计算所有成像细胞各时间点的平均值，并确定 90% 置信区间。绘制数据图表。
        注意：上述步骤生成的图表应与以下结果相似 图6.

结果

图4 展示了基于paxillin的磷酸酶活性检测中可预期的实验结果。在本实验中，以磷酸化paxillin为检测指标，比较了组成型活性与显性失活型Shp2磷酸酶的活性，以及活性与失活型RapR-Shp2的活性。Shp2表达构建体经免疫沉淀后，按本方案所述进行活性检测。组成型活性Shp2与活性RapR-Shp2的磷酸化paxillin检测信号相似，表明引入RapR结构域未对活性RapR-Shp2产生负面影响，且其在激活后仍保持完全的酶活性。显性失活型Shp2与失活型RapR-Shp2的结果也相似，表明RapR-Shp2构建体在未激活状态下无酶活性。上述结果表明RapR-磷酸酶的设计成功。本检测所使用的磷酸化底物可根据目标磷酸酶的不同而调整。

图5与图4类似，比较了组成型激活、显性失活以及激活和失活状态的RapR-Shp2。本实验未对构建体进行免疫沉淀，而是旨在表征RapR-Shp2构建体在细胞内的下游信号效应。在此实验中，Shp2构建体在HEK293T细胞中表达。结果显示，与组成型激活样本一致，RapR-Shp2激活后可导致下游效应分子ERK1/2的磷酸化水平升高，而失活的RapR-Shp2则未引起该变化。这表明Shp2的下游信号通路在融合RapR结构域后仍得以保留。类似地，在A431细胞中，已知的磷酸化底物EGFR和PLCγ在RapR-Shp2激活后发生去磷酸化。

最后，图6展示了RapR-Shp2激活对HeLa细胞形态动力学的影响结果。RapR-Shp2激活后，细胞的突出活动以及细胞面积均有所增加。这表明RapR-Shp2的激活足以诱导HeLa细胞发生形态动力学变化，并可能使研究人员能够探究介导此效应的特定下游信号通路。

figure-results-1
图4： 基于paxillin的活性检测结果： 将组成型激活型、显性失活型以及RapR-Shp2进行免疫沉淀，并按照所述方案进行活性检测。CA和RapR-Shp2样品中pY31 paxillin的水平相似，表明RapR-Shp2构建体在激活后与CA Shp2具有相似的活性。未激活的RapR-Shp2样品无活性，与DN样品相似，表明该构建体无“渗漏”活性。本图改编自Fauser等12。缩写：RapR = 雷帕霉素调控型；Shp2 = 含Src同源2区的蛋白酪氨酸磷酸酶；DN = 显性失活型；CA = 组成型激活型；FRB = FKBP-雷帕霉素结合域。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图 5： 全细胞裂解物实验结果：在 HEK293T 细胞中表达组成型活性、显性负性以及 RapR-Shp2 蛋白，并完成全细胞裂解物实验流程。当 RapR-Shp2 处于非活性状态时，不能通过磷酸化激活 ERK1/2，与 DN Shp2 样品结果相似，表明 RapR-Shp2 在非活性状态下无活性。激活后，ERK1/2 的磷酸化水平与 CA Shp2 样品相当，表明 Shp2 成功激活并实现了下游信号传导。类似地，表达 RapR-Shp2 的 A431 细胞中，EGFR 和 PLCγ 的磷酸化水平均下降，这两种蛋白均为已知的 Shp2 底物。本图改编自 Fauser 等人12。缩略语：RapR = 雷帕霉素调控型；Shp2 = 含 Src 同源 2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶；DN = 显性负性；CA = 组成型活性；ERK = 细胞外信号调节激酶；GAPDH = 3-磷酸甘油醛脱氢酶；EGFR = 表皮生长因子受体；PLCγ = 磷脂酶 C 伽马；FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域。 请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-3
图6: 基于活细胞成像的细胞面积与突出活动数据分析： HeLa 细胞转染 RapR-Shp2 后，按照所述活细胞成像方案进行处理。数据按照数据处理方案进行分析。激活后（以垂直灰色线表示），HeLa 细胞表现出细胞突出活性及细胞面积的增加。而在仅表达 FRB 的阴性对照样本中，未观察到此类活性。这表明 RapR-Shp2 的激活可诱导 HeLa 细胞内快速的形态动力学变化，并促进细胞铺展与突起形成。该图改编自 Fauser 等人。12. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本方案详细介绍了化学遗传学控制的磷酸酶的开发、表征及应用步骤。RapR-Shp2工具依赖于在Shp2催化结构域中插入的雷帕霉素调控开关。该工具的优势在于对磷酸酶活性具有高度特异性和严格的时间控制。该工具可适用于其他磷酸酶，并可与先前描述的RapR-TAP技术联用，实现对特定下游信号通路的重建26。RapR方法的独特功能使研究人员能够识别由Shp2激活诱导的瞬时事件，并解析调控特定形态动力学过程的下游信号通路。

RapR磷酸酶的设计受到多个关键因素的影响。目标磷酸酶催化结构域的高分辨率晶体结构对于指导iFKBP插入位点的选择非常有帮助。然而，由于酪氨酸磷酸酶之间具有高度的结构相似性，通过比对催化结构域的氨基酸序列即可获得足够的信息来确定插入位点，这一点可通过Shp2与PTP1B及PTP-PEST的序列比对结果加以说明（图2）。对于RapR-Shp2，选择位于通过β-链与关键催化WPD环相偶联位点的Val406作为最优插入位点。相同的插入位点可能也适用于其他蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPases）的有效调控，这一点已在PTP1B和PTP-PEST中得到验证12（图2A）。

如果目标磷酸酶是一种多结构域蛋白，则有关其结构域排列的结构信息将有助于避免干扰该蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）的其他功能。影响最优RapR-PTPase设计的另一个因素是应替换多少个氨基酸以插入iFKBP。在PTPase中较大且更灵活的插入环可能需要进一步缩短，以确保iFKBP对催化活性的紧密调控。同样，连接iFKBP与PTPase的接头长度和组成也会影响调控效率。由单个甘氨酸（Gly）残基组成的短接头可提供更紧密的调控，但如果即使在iFKBP与雷帕霉素和FRB结合时仍引入持续的结构畸变，则可能降低酶的最大活性。中等长度的Gly-Ser-Gly接头提供了更大的灵活性，但对某些PTPase而言可能刚性不足。由Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly组成的长接头有助于防止形成可能影响PTPase调控的非预期二级结构。RapR-Shp2已测试了这三种类型的接头，结果发现Gly-Ser-Gly接头最为理想。

决定 RapR 工具成功开发的一个关键因素是建立一个稳健的磷酸酶检测方法，并设置适当的对照。将 RapR-磷酸酶活性与靶蛋白（POI）的显性负性突变体和组成型活性突变体的活性进行比较，可评估 RapR 构建体的渗漏程度以及激活程度。此外，若组成型活性磷酸酶未引起去磷酸化，或显性负性突变体导致磷酸化水平降低，则提示反应条件不当。

对于磷酸酶活性检测，每种蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）都需要优化反应条件。温度、反应时间及缓冲液条件的调整取决于特定的PTPase。剧烈振荡样品至关重要，以确保Sepharose结合的PTPase与其底物充分混合。最后，如果上述磷酸酶检测方法对特定的PTPase并非最优，则可采用以对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate）为底物的磷酸酶反应作为替代检测方法27。

在活细胞成像实验中，制备样品时应考虑多个因素。本方案采用基于 HEPES 缓冲液的 L-15 培养基，其对 CO2 浓度不敏感。如果希望使用基于碳酸氢盐的培养基，则应添加 HEPES 以维持样品的 pH 值，或使用可补充 CO2 的环境控制成像室。本方案建议在样品上方覆盖一层矿物油，以防止蒸发并便于添加雷帕霉素。也可采用其他配置，如使用环境控制成像室或封闭式培养室，但在此类系统中添加雷帕霉素可能更具挑战性。在成像过程中向细胞添加雷帕霉素时，需确保载物台不发生位移，且细胞不受扰动。成像过程中样品的任何额外移动都将阻碍数据采集。应保持较低的光照强度和曝光时间，以减少光毒性，尤其是在长时间成像时。细胞的转染效率也至关重要。FRB 与 RapR-Shp2 DNA 以 1:1 的比例共转染可实现足够的表达水平，但对于新构建的质粒，该比例需进行优化调整。为确保有效激活，FRB 的表达水平应高于 RapR 磷酸酶。

基于RapR的工具的一个局限性是无法快速失活。更换培养基可去除细胞外的雷帕霉素，但由于雷帕霉素与RapR结构之间的结合极为紧密，RapR构建体的失活可能需要数小时。通过添加PTP酶活性位点抑制剂可实现快速失活，但该抑制剂潜在的脱靶效应可能使实验结果的解释变得困难。此外，即使与PTP酶抑制剂联用，RapR方法也无法用于周期性激活/失活实验。RapR系统的另一个局限性是缺乏空间控制能力。RapR构建体在细胞内广泛表达，因此会在细胞内的所有位置被激活。一种可能的解决方案是使用笼状雷帕霉素，其可在细胞内特定区域通过近紫外光局部释放28,29。此外，可通过改造RapR工具，使其在特定蛋白质复合物中或特定亚细胞位置激活目标磷酸酶。通过将结合伴侣或亚细胞定位标签连接至FRB结构域，RapR-PTP酶将被靶向至细胞内的特定蛋白质或特定位置。最后，雷帕霉素是一种通过抑制mTOR而被充分表征的免疫抑制剂，可能影响细胞信号通路，进而干扰目标PTP酶的信号传导。为解决这一问题，非免疫抑制性雷帕霉素类似物（iRap和AP21967）是良好的替代选择。已有研究表明，这两种化合物均可有效调控RapR构建体14。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Jordan Fauser 博士在 RapR-Shp2 及相关实验方案开发中的贡献。本工作获得了 NIGMS 颁发的 5R35GM145318 项目资助、NCI 颁发的 R33CA258012 项目资助以及 NHLBI 颁发的 P01HL151327 项目资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形Warner Instruments64-0715
1.5 mL 离心管USA Scientificcc7682-3394
2x Laemmli 缓冲液配制 500 mL：5.18 g Tris-HCl，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，终 pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶Biorad4561096
5x Phusion Plus 缓冲液Thermo ScientificF538L
A431 细胞ATCCCRL-1555
琼脂糖GoldBiotechA-201
Attofluor 细胞培养腔室invitrogenA7816
Benchmark 胎牛血清（FBS）Gemini Bio-products100-106热灭活，三重 0.1 µm 无菌过滤
Brig 35, 30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/A发表于 10.1083/jcb.201306067
CellMask 深红色细胞膜染料invitrogenc10046
菌落筛选 MasterMixGenesee42-138
DH5α 感受态细胞NEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
DNA MarkerGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI 酶NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-二硫苏糖醇，Cleland 试剂
EGTAAcros409910250
牛血浆纤维连接蛋白SigmaF1141
FuGENE(R) 6 转染试剂PromegaE2692转染试剂
凝胶回收试剂盒Thermo ScientificK0692GeneJET 凝胶回收试剂盒
Gel Green 核酸染料GoldBioG-740-500
6x 紫色上样缓冲液NEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T 细胞ATCCCRL-11268
HeLa 细胞ATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ 图像处理软件N/AN/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
咪唑缓冲液25 mM 咪唑 pH 7.2，2.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB 琼脂FisherBP1425-2
裂解缓冲液20 mM Hepes-KOH，pH 7.8，50 mM KCl，1 mM EGTA，1% NP40
MATLABMathWorksN/A使用 R 2022b 版本运行 CellGeo 函数
Metamorph 显微镜自动化与图像分析软件N/AN/A
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
矿物油SigmaM5310
质粒小提试剂盒Gene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX 预制胶 12 孔Bio-Rad4561085
分子生物学级水Corning46-000-CV
多波段多色镜Chroma Technology89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x 物镜OlympusN/A
不含 Ca 和 Mg 的 PBSCorning21-031-CV
PCR 管labForce1149Z650.2 mL 8 联管及盖子，刚性条带，独立连接圆顶盖
Phusion Plus DNA 聚合酶Thermo ScientificF630S
引物IDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
PVDF 膜BioRad1620219Immun-Blot PVDF/滤纸夹心结构
雷帕霉素FisherAAJ62473MF
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1x [-] 钠Corning25-053-CI
Tris-乙酸-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1用于电泳
洗涤缓冲液20 mM Hepes-KOH，pH 7.8，50 mM KCl，100 mM NaCl，1 mM EGTA，1% NP40
β-巯基乙醇Fisher ChemicalO3446I-100
抗体
抗 EGFR 抗体Cell Signaling2232
抗 Erk 1/2 抗体Cell Signaling9102
抗 Flag 抗体Millipore-SigmaF3165
抗 GAPDH 抗体invitrogenAM4300
抗 GFP 抗体Clontech632380
抗 mCherry 抗体invitrogenM11217
抗 Paxillin 抗体Thermo FischerBDB612405
抗磷酸化 EGFR Y992 抗体Cell Signaling2235
抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体Cell Signaling9101
抗磷酸化 Paxillin Y31 抗体Millipore-Sigma05-1143
抗磷酸化 PLCγ Y783 抗体Cell Signaling14008
抗 PLCγ 抗体Cell Signaling5690

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SHIP 2 HEK 293T

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