方法文章

基于结构指导的新型亲环素A抑制剂与灵芝醇-F衍生物的设计与开发：一种计算机模拟方法

DOI：

10.3791/67145

⸱

2026年6月23日

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种基于结构指导的蛋白-配体结合相互作用设计方法，该相互作用涉及 Sanglifehrin A 与亲环素 A/灵芝醇-F，对于新药发现至关重要。通过分子动力学模拟评估了配体-受体复合物的稳定性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyclin Ds-CDKs 轴（亲环素 A（Cyp/灵芝醇 F））通过调控增殖和抑制癌细胞等多种过程在癌症中发挥关键作用。灵芝醇 F 衍生物可作为多种癌症类型的致癌靶点。本研究证明，基于结构设计和开发新型 Cyp A 抑制剂及灵芝醇 F 衍生物可用于选择计算位置，以提高化学抑制剂的有效性及其与选定受体的相互作用。为此，采用了多种软件程序以实现最佳分子相互作用。总体而言，使用 Chemsketch 软件构建了 117 种新型亲环素抑制剂配体分子。将新型 Cyp A 抑制剂配体转换为 PDB 文件格式，用于导入 Sanglifehrin A 酶受体。采用 AutoDock 4.2.6 软件进行配体-蛋白对接相互作用，以揭示最佳的几何构型匹配。对接结果通过 PyMOL 2.5 软件进行确认。最后，使用 Chimera 和 Maestro 软件检测氢键。所选配体-受体对接复合物进一步进行分子动力学模拟。分子动力学（MD）模拟结果表明该复合物具有良好的稳定性，提示所选配体可用作癌细胞的药物抑制剂。结果中，结合位点内的活性氨基酸被鉴定为精氨酸 55（运动幅度为 1.53 Å）、天冬酰胺（Asn）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Iso）、组氨酸（Hid）、苯丙氨酸（Phe）和半胱氨酸（Cys），其中氢键数量最多的配体为 45-羟基芒果酸，其与 1nmk 受体在格点盒坐标 X 38.86、Y 10.987、Z 40.734 处结合。在 Gromacs 软件中采用 CHARMM 36 力场对 1nmk 受体-配体复合物进行分子动力学（MD）模拟评估，结果显示其具有最优的构象稳定性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

亲环素A是人源Cyp A的强效抑制剂。亲环素是一类不会损害免疫系统、具有更优药理学特性并能降低转运体抑制作用的强效抑制剂。亲环素蛋白家族具有肽基-脯氨酰异构酶活性，其过表达与不良预后相关1。已有报道表明，亲环素在多种癌症中过表达，包括肝细胞癌。在肝细胞癌（HCC）中，亲环素对肿瘤耐药性和增殖均起着关键作用2。通过采用原子水平的分子对接和分子动力学模拟，确定DC838与Cyp A的精确结合位点，该抑制作用为基于喹喔啉衍生物的新免疫抑制剂的发现提供了重要信息3。

此外，体内研究表明，环孢素结合蛋白DC838可抑制刀豆蛋白诱导的小鼠脾细胞增殖。已有多个研究报道了一系列基于天然物质Sanglifehrin A（SFA）合成的大环类环孢素结合蛋白抑制剂4。初步的化合物优化发现，Sanglifehrin核心结构中m5酪氨酸残基的羟基、C14和C15位的立体中心，以及缬氨酸5m5酪氨酸5哌嗪酸三肽是影响化合物活性的关键因素5。SFA中的C185C21二烯单元可被苯乙烯基团取代，从而获得具有新型结合模式的高活性化合物，其中苯乙烯部分通过堆积作用与Cyp A的精氨酸（Arg）55发生相互作用6。非免疫抑制性环孢素结合蛋白抑制剂在治疗丙型肝炎病毒方面具有疗效。环孢素A1、阿利孢罗韦（alisporivir）以及大多数其他环孢素类化合物均为MRP2、MDR1、OATP1B1及其他重要药物转运体的强效抑制剂7,8。

另一方面，从Ganoderma leucocontextum中纯化的灵芝醇F通过抑制CDK4/CDK69周期蛋白以及依赖周期蛋白的激酶（CDKs）来延缓细胞周期进程，而CDKs在调控哺乳动物细胞周期中起着关键作用。Cyclin D-CDK4/CDK6和Cyclin E-CDK2是灵芝醇F调控细胞周期进程的关键因子。因此，灵芝醇F可作为潜在的CDK4/CDK6抑制剂用于乳腺癌的治疗10,11。FA抑制细胞周期的G1期，从而在不影响细胞活力的情况下阻止M-CSF依赖性巨噬细胞的生长12。该免疫抑制剂通过失活CDK2的活性来抑制细胞增殖。在癌症背景下，Cyclin D-CDK4/6以及其他周期蛋白和CDKs的作用已得到充分证实。癌症的特征之一是周期蛋白-CDK通路的异常失调。具体而言，当细胞准备启动DNA合成时，CDK4在D型周期蛋白的协同下介导细胞通过G1期。这一过程与癌症的发生和发展密切相关9。

Cyp A 的活性位点以不变的催化性精氨酸（Arg55）为特征，并包含一组高度保守的疏水性、芳香性和极性残基，例如 Arg55、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）和苏氨酸（Thr）1,13,14。亲环蛋白家族的活性位点还包括丙氨酸（Ala）和天冬酰胺（Asn）1。与此同时，SFA 的活性位点由氨基酸 Arg5515、Gln、Gly、Thr、Ala 和 Asn 组成，这些氨基酸形成一个疏水性口袋，包裹着 SFA 的哌嗪酸部分。与未结合配体的 Cyp A 相比，SFA 中大环与自旋双环之间的连接链迫使 Trp121 重新调整其侧链构象16。

根据先前的研究，选择1nmk作为伐环素A（Sanglifehrin A）的特定PDB编码17。伐环素A（SFA）是一种免疫抑制性天然物质，最初在链霉菌（Streptomyces sp.）A92-3081中被发现5,18。SFA对亲环素A（Cyp A）具有高亲和力，其结构与环孢素A（CsA）明显不同，并通过独特机制抑制免疫系统。SFA复杂的分子结构包含一个22元大环，在23位上连接一个九碳链，末端为高度取代的螺双环结构单元。体外研究表明，在纤维化的人肺成纤维细胞及特发性肺纤维化患者样本中，SFA可增加亲环素B的生成，并抑制I型胶原的分泌19,20。总体而言，共使用了20种不同的伐环素来分离SFA（C16）。在无细胞竞争性结合实验中，其对亲环素的亲和力约为SFA家族其他成员的60倍15。例如，SFA显著减少树突状细胞释放的生物活性IL-12p70（IL-12的主要来源），从而抑制树突状细胞的活性。该研究提示，SFA是一种具有潜力的新型免疫抑制药物1。

在此方案中，使用新型配体结构生成了Ganoderiol F/Cyp A的复合物 计算机模拟 使用Chemsketch软件进行方法处理，然后通过兼容软件转换为PDB文件。蛋白质-配体结合构象在药物发现与设计过程中是一个重要问题。21,22配体-受体相互作用使用 AutoDock 4.2.6 软件进行分子对接。计算对接系统通常会生成多个潜在的蛋白质-配体复合物构象。可选择一个或少数几个与 1nmk 受体结合能最低的候选结构进入药物设计的下一阶段，以确保有效性 计算机模拟 药物设计试验中，使用Chimera软件鉴定最优的氢键结合配体。最后，对配体-受体复合物进行分子动力学（MD）模拟以评估其稳定性。该方法在以下方案中详细描述。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 计算机模拟 使用ChemSketch软件生成配体及配体的制备

注意：该软件将用于绘制配体/分子的结构，即分子编辑。

  1. 按照软件中的绘图流程绘制配体/结构，如补充文件1（截图1）所示。
  2. 绘制完整结构后，按f9键以优化结构。
  3. 点击文件，然后选择另存为。（导航至相应文件夹，例如分子1保存在文件夹1中，以此类推）。
  4. 将保存类型更改为mdl molfiles，然后点击保存（无需指定文件名，使用软件提供的默认文件名，例如noname）。
    注意：每个文件夹中将生成一个文件，每个文件均为二维结构配体的mdl格式。
  5. 对所有分子重复上述步骤。

2. 文件格式转换（Open Babel 软件）

注意：该软件可转换文件格式。此处，.mol 文件将被转换为 .pdb 格式，如补充文件 1（截图 2）所示。

  1. 在左侧的输入格式中，请选择 mol--mdl mol 格式 从下拉菜单中选择。类似地，在右侧的输出格式中，选择 pdb——蛋白质数据银行格式.
  2. 在……之下 输入格式 （在左侧），点击…… （浏览按钮）
  3. 导航至该文件夹（例如，文件夹 1），单击刚刚绘制的 Chemsketch 文件，然后 开放 它。
  4. 在……之下 输出格式 点击……
  5. 默认窗口将打开。输入 1.pdb 在此处命名文件。对于结构1，输入 1.pdb 并点击 保存重复此步骤以处理分子/结构2，输入 2.pdb 等等。
  6. 最后，从软件界面的中部点击 转化这将把坐标从mdl mol格式转换为PDB格式。
    注意：现在将向文件夹中添加另一个文件。每个文件将包含一个配体 pdb 文件，用于后续步骤。
  7. 右键单击新创建的文件，选择 打开方式， 然后选择 记事本.
  8. 对所有分子重复相同的步骤。
    注意：安装 MGL 1.5.7 工具后，AutoDock 4.2.6 将出现在桌面上。
  9. 按照下述方法准备输入文件 1nmk.pdb。
  10. 在 1nmk.pdb 文件中，通过访问 pdb.org 网站并选择 1nmk 结构来移除所有外部配体。在该结构中查找配体 小分子 1纳米结构上的标题，如图所示 补充文件 1 （截图 3）
  11. 找到名为 SFM 的配体，如图所示 补充文件 1 （截图4），打开1nmk文件。从PDB网站下载1nmk的PDB文件。找到终止残基（TER.），如图所示 补充文件 1 （截图 5）
  12. 删除1nmk结构中外部配体（SFM）的残基，范围从TER之后的第一个残基开始，到末尾之前列出的残基结束。将修改后的1nmk PDB文件保存至系统中。
    注意：1nmk PDB 文件已准备就绪，受体活性位点坐标文件的制备将在 表1.
  13. 开放 的 1nmk 文件中找到第55位氨基酸的Arg。
  14. 如图所示，找到 x、y 和 z 的坐标 补充文件 1 （截图 6）

3. 使用 AutoDock 4.2.6 软件准备对接参数。

  1. 从桌面打开 AutoDock 4.2.6 工具软件。
  2. 选择 AutoDock 4.2.6 4.0 进行 1nmk 受体准备，如 补充文件 1（截图 7）所示。
  3. 打开 文件 菜单，选择 读取分子，导航至相应文件夹，选择 1nmk，然后点击 打开。
  4. 点击 编辑，选择 氢原子，然后点击 添加。仅选择 极性氢，然后点击 确定（补充文件 1，截图 8）。
  5. 点击 编辑，选择 电荷，然后选择 Kollman 电荷。
  6. 点击 编辑，选择 原子，然后选择 分配 ad4 类型（任选其一）。
  7. 打开 文件 菜单，选择 保存，输入 pdbqt。一个窗口将弹出。浏览文件夹 1，输入文件名 1nmk.pdbqt，然后点击 保存。
  8. 从 原子 中选择，然后点击 添加，如 补充文件 1（截图 9）所示。勾选“排序节点”、“保存变换坐标”、“写入所有记录”，然后点击 确定。
  9. 打开 配体，选择 输入，然后点击 打开。导航至 文件夹 1，将文件类型更改为所有文件，选择 1.pdb，然后点击 打开。一个小窗口将出现，显示所选 配体 的信息，如 补充文件 1（截图 10）所示。
  10. 打开 配体，然后选择 旋转树，再选择 检测根节点，如 补充文件 1（截图 11）所示。
  11. 打开 配体，然后选择 输出，再选择 另存为 pdbqt。导航至文件夹 1，输入文件名 1.pdbqt，然后点击 保存，如 补充文件 1（截图 12）所示。
    注意：所有配体的 pdbqt 文件将被准备完毕。
  12. 打开 网格，选择 大分子，选择 1nmk，然后选择 分子。将出现一个警告窗口；点击 确定，如 补充文件 1（截图 13）所示。导航至文件夹 1，输入文件名 1nmk.pdbqt，点击 保存，当弹出替换窗口时，点击 是，如 补充文件 1（截图 14）所示。
  13. 打开 网格，然后选择 设置映射类型，选择 配体，点击 1，然后选择 配体，如 补充文件 1（截图 15）所示。
  14. 根据 表 1 准备 GPF 受体活性位点坐标文件。
    注意：GPF 文件代表受体的活性位点坐标（表 1）。
  15. 点击 网格，然后进入网格框，选择 中心，选取一个 原子，并输入 中心网格框（补充文件 1，截图 16）。
    1. 选择 文件，然后选择 关闭，保存 当前设置。
    2. 选择 网格，然后选择 输出，并 另存为 GPF。进入 文件夹 1，输入文件名 1nmk.gpf。
    3. 选择 对接 > 大分子 > 设置刚性文件名，导航至 文件夹 1，点击 1nmk.pdbqt，然后点击 打开，如 补充文件 1（截图 17）所示。
    4. 选择 对接，找到 1，然后 选择配体（补充文件 1，截图 18）。一个包含默认参数的窗口将打开。接受默认参数，如 补充文件 1（截图 19）所示。
    5. 然后选择 对接，进入 搜索参数，选择 遗传算法，将弹出一个包含 默认参数 的窗口，然后选择 接受，如 补充文件 1（截图 20）所示。
    6. 选择 对接，然后选择 输出，Lamarckian GA，如 补充文件 1（截图 21）所示。
    7. 进入 文件夹 1，输入文件名 "1nmk.dpf"，然后点击 保存，如 补充文件 1（截图 22）所示。
      注意：关闭 AutoDock 4.2.6 软件窗口，重新打开，并对下一个分子重复该过程。此外，1nmk.pdbqt、1nmk.gpf 和 1nmk.dpf 文件将准备就绪，用于对接步骤。

4. Cygwin-I（对接过程）

注意：要创建 GLG 和 DLG 文件，请运行该算法。该算法（AutoGrid）在此 Cygwin 终端中运行。在 Cygwin 中导航至目标文件夹。例如，若文件夹 1 位于 C 盘，则其应包含一个名为 "project," 的文件夹，其下再包含一个名为 "molecules," 的文件夹，然后是其内的所有子文件夹。请按以下步骤操作。

  1. 打开 Cygwin 末端
  2. 类型 cd c:/ 并按压 输入。然后输入 cd 项目 并按压 输入.
  3. 类型 cd 分子和 按 Enter 键，然后输入 cd 1 并按压 输入现在文件夹1位于 Cygwin 终端.
  4. 类型 ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & 并按压 输入，如图所示 补充文件 1 （截图23）
    注意：在 "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &"，-l 是小写的 L 加减号。
  5. 类型 tail -f 1nmk.glg 并按压 输入，如图所示 补充文件 1 （截图 4）
  6. 如果 AutoGrid 成功完成，请关闭此 Cygwin 窗口，打开一个新的 Cygwin 窗口，然后对分子 2 重复上述过程。
  7. 对所有分子重复此步骤，并运行算法（AutoDock 4.2.6）。
    注意：对于 AutoDock 4.2.6，重复进入文件夹的操作过程，当访问该文件夹时，输入并按 Enter 键以启动 AutoDock 4.2.6。
  8. 类型 ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & 并按压 输入，如图所示 补充文件 1 （截图 24）
    注意：在上述步骤中 "- l" 是一个小写字母 "L" 负号
  9. 类型 tail -f 1nmk.dlg
    注意：如果 AutoDock 4.2.6 运行完成，请关闭 Cygwin 窗口，并对分子 2 重复该过程。
  10. 对所有分子均遵循此 Cygwin 操作流程。
  11. 在为分子创建 DLG 文件后，进入文件夹 1，用写字板打开 DLG 文件。按下 Ctrl + F，输入， 并按压 进入 三次以到达RMSD表格，如图所示 补充文件 1 （截图 25）
  12. 打开一个 Microsoft Excel 窗口或记下页面，并创建三列：序号、 最小值 结合能，以及运行。
  13. 根据日志文件中的 RMSD 表记录数据。结合能及其对应的运行序号位于表格顶部。对所有分子均执行此操作。
    注意：结合能较低的分子被认为优于其他分子。
  14. 创建另一个电子表格，列出详细信息（序列号、最小结合能和运行前20种分子的）数量。
    注意：以下步骤仅针对排名前 20 的分子进行。

5. Cygwin-ii

  1. 打开 Cygwin 终端，输入 cd c:/，然后按 Enter。
  2. 输入 cd project 并按 Enter，再输入 cd molecules 并按 Enter。
  3. 输入 cd（所选顶部分子对应的文件夹编号），然后按 Enter。
    注意：编号应与 Cygwin 终端中的文件夹一致。
  4. 输入 grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt 并按 Enter。与 AutoGrid 和 AutoDock 不同，此操作不会显示成功完成的消息，按 Enter 后即可，如 补充文件 1（截图 26）所示。
  5. 按 Enter，文件将被创建。
  6. 输入 cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb 并按 Enter。文件将被创建，如 补充文件 1（截图 27）所示。
  7. 关闭 Cygwin 窗口。
    ​注意：为可视化对接后配体与受体的相互作用，将使用 PyMOL 2.5 软件
    1. 打开 PyMOL 2.5 软件，然后打开文件，选择受体。
    2. 打开文件，然后选择选定的配体构象，如 补充文件 1（截图 28）所示。
    3. 在 PyMOL 2.5 中，选择 Hide Molecule 和 Hide Receptor。在 Receptor 菜单中选择 Show Surface，如 图 1A 所示。
      注意：为可视化配体-1nmk 受体复合物中的氢键，将在结合能最低的 20 个配体中使用 UCSF Chimera 软件。

6. 用于可视化氢键及分析结果的 UCSF Chimera 软件

  1. 打开 UCSF Chimera，然后选择 文件，再选择 打开，导航至驱动器 c:/，然后进入 Project，Molecules)，选择 1nmk.pdb 并打开。
  2. 选择分子所在的驱动器，然后在 UCSF 程序中打开该蛋白质。
  3. 选择残基（Residue），然后选择UNL 缩放（UNL Zoom）。
  4. 选择区域（Zone），然后点击确定（OK），再选择操作（Action），然后选择标签（Label），选择残基（Residue），并选择名称 + 说明符（Name + Specifier）。
  5. 选择工具（Tools），然后选择结构分析（Structure Analysis），再选择查找氢键（Find H-Bond），如补充文件 1（截图 29）所示。
  6. 打开默认窗口，并勾选为不符合精确标准的氢键着色和仅查找与选定部分形成的氢键。
  7. 选择清除选择（Clear Selection）以开始新的分析，然后放大并查找蓝色/橙色线条，这些线条代表氢键（H-bonds），如图 3所示。
  8. 检查需要计数的氢键数量。
    注意：放大图应显示与 Arg55、Asn149、Gly150、Lys151、Thr152、Lys54、Lys155、Isoleucine 15623、Histidine 5424、Phenylalanine (Phe)53、Cysteine (Cys)52、Gly72、Asn71 和 Hid70 的氢键相互作用，并指明它们是否位于蛋白质的活性位点内，如图 3A–D 所示。
  9. 记录氢键的数量及分子编号。
  10. 将鼠标悬停在表示氢键的线上，以显示与Arg55 和 Methionine、Gln、Gly 及 Thr的相互作用。
  11. 按下Print Screen键。
  12. 打开画图（Paint）应用程序，粘贴补充图，并将其保存到指定文件夹中。
    注意：为清晰显示氢键及活性位点氨基酸，所选配体与受体的二维结构应如下所示：

7. 准备配体相互作用图以确认对接结果并显示氢键

  1. 打开 AutoDock 4.2.6 软件。
    1. 选择 Analysis 并打开 Macromolecule，然后选择 1nmk，如 补充文件 1（截图 30）所示。
    2. 选择 Analysis 并打开 Docking，然后选择 Open，导航至 dlg.pdb 文件并选中该文件，如 补充文件 1（截图 31）所示。
    3. 选择 Analysis 并打开 Docking，然后选择 Write AutoDock Virtual Screening Ligand 并将其保存为 PDB 文件，如 补充文件 1（截图 32）所示。
  2. 打开 PyMOL 2.5 软件，如 补充文件 1（截图 33）所示。
    1. 打开已保存的 dlg.pdb 文件，然后打开 1nmk.pdb 文件。
    2. 打开 File，选择 Export Molecule，然后点击 Save，如 补充文件 1（截图 34）所示。
    3. 打开 Maestro 软件，点击 File，然后选择 Import Structure，如 补充文件 1（截图 35）所示。
    4. 导入 Ligand Interaction Diagram，保存二维结构，如 补充文件 2 所示。

8. 分子动力学模拟

注意：在 Linux 系统中打开 GROMACS 请遵循以下步骤

  1. 下载 Ubuntu 20.04.6
    1. 打开 PC 上的“Windows 功能”应用程序，然后选择“适用于 Linux 的 Windows 子系统”并按 好的.
    2. 遵循以下步骤并按下 进入 安装 GROMACS：
      1. 类型 sudo apt-get update 并按压 进入，然后输入 sudo apt-get upgrade，然后按 Enter 键.
      2. 类型 sudo apt-get install gcc 并按压 输入，以及类型 sudo apt-get install cmake 并按压 输入.
      3. 类型 sudo apt-get install build-essential 并按压 输入，然后输入 sudo apt-get install liDevfftw3-d 并按压 输入.
      4. 类型 sudo apt-get install GROMACS 并按压 输入，然后按压 shift + Ctrl + T.
    3. 在个人计算机（PC）上打开文件夹，并将其命名为 GROMACS，如图所示 补充文件 1 （截图 36）
    4. 打开 GROMACS 文件夹并按下 Shift + Ctrl + 右方向键 进入 Linux。
      注意：模拟使用了水模型和 GROMACS 4.0 版本（Win64 多核版），并采用了 CHARMM 36 力场。时间步长设置为 2 fs，截断距离选择为 1.0 至 1.2 nm。

9. 使用 GROMACS pdb2gmx 模块创建配体拓扑结构（补充文件 1，截图 37）

  1. 创建 lig.gro 文件，通过在命令行输入 grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb 并按下 Enter 键，从蛋白质结构中提取配体，然后将文件中的 "UNL" 重命名为 "LIG"。
  2. 在 PyMOL 2.5 中打开 lig.pdb，通过按下 选择原子 并按下 删除原子 来移除不需要的原子。点击保存，将清理后的版本保存为 lig_clean.pdb。
  3. 在 Avogadro 中打开清理后的文件，使用 Build 工具添加氢原子，并将其保存为 lig.mol2。使用文本编辑器编辑文件顶部，确保残基名称设置为 LIG。
  4. 输入命令 perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix.mol2 并按下 Enter 键。
  5. 使用 CGenFF: 生成配体拓扑结构：上传 lig_fix.mol2 文件，处理输入并下载 lig_fix.pdb。激活 Python 环境，运行 python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix.mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff 并按下 Enter 键。
    注意：此步骤将生成四个配体文件（lig.prm、lig.itp、lig.top 和 lig_ini.pdb）。
  6. 生成 ligand.gro 文件，输入命令 gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro 并按下 Enter 键。
  7. 通过仅将非配体原子保存为 prot_clean.pdb 的方式分离蛋白质，并确保 UNL 原子位于复合物文件的顶部。

10. 使用 GROMACS pdb2gmx 模块创建蛋白质拓扑结构（补充文件 1，截图 38）。

  1. 准备蛋白质拓扑结构，输入 gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter 并按 Enter 键。
  2. 将 lig.gro 文件添加到 pro.gro 文件末尾，构建蛋白质与配体的复合物。然后输入 gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic 并按 Enter 键。
  3. 使用特定点电荷水模型生成溶剂化体系以维持平衡，输入 gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top 并按 Enter 键。
  4. 创建离子文件，输入 gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr 并按 Enter 键。然后输入 gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral 并按 Enter 键，随后选择第 15 组以添加离子。
  5. 生成能量最小化的 em.gro 文件。
  6. 输入 gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr 并按 Enter 键，然后输入 gmx mdrun -v -deffnm em 并按 Enter 键。
    注：该溶剂化体系将进行最多 50,000 步的能量最小化，力收敛标准为 1,000.0 kJ/mol/nm。
  7. 创建索引文件，输入 gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx，然后按 Enter 键。
  8. 输入 gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 并按 Enter 键。
  9. 生成 index.ndx 文件，输入 gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx 并按 Enter 键。
  10. 生成 NVT 平衡 nvt.gro 文件，输入 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr 并按 Enter 键。然后输入 gmx mdrun -deffnm nvt 并按 Enter 键。
    注：系统平衡在原子数（N）、体积（V）和温度（T）恒定的系综（NVT）条件下进行，温度为 27.35 °C（300.5 K），持续时间为 100 ps。
  11. 更新拓扑文件 topol.top，加入配体的拓扑结构和参数，以进行 NPT 平衡。
  12. 生成 NPT 平衡。
  13. 进行第二阶段 NPT 平衡，输入 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr 并按 Enter 键，然后输入 gmx mdrun -deffnm npt 并按 Enter 键。
    注：平衡后的 NVT 指粒子数、体积和温度保持恒定，而平衡后的 NPT 指粒子数、压力和温度达到稳定。NVT.mdp 和 NPT.mdp 文件对于生成分子动力学（MD）模拟结果至关重要。

11. 释放位置限制并运行生产阶段分子动力学模拟以收集数据

  1. 输入 gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr，然后按 Enter。接着输入 gmx mdrun -deffnm md_0_10，再按 Enter。
  2. 对体系进行 1 ns 的分子动力学（MD）模拟，以检验复合物的稳定性。
    注意：均方根偏差（RMSD）用于量化原子相对于参考结构的平均构象偏差，而涨落均方偏差（FMSD）用于衡量原子在其平均位置周围的时间平均涨落。这两个数值是确定分子动力学模拟运行是否完成所必需的。
  3. 进行结构分析，包括 RMSD、FMSD、氢键和自由能分析。
  4. 使用 qtgrace_v026_win7 软件绘制分析图表，并利用 VMD 软件和 md_0_10.gro 文件显示轨迹框。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如引言中所述，体内和体外研究表明，环孢素抑制剂在简化桑格灵菌素结构方面具有重要作用，从而通过干扰小鼠细胞周期抑制小鼠脾脏细胞增殖5。此外，环孢素A与灵芝醇F衍生物一起，通过其PPIASE活性在蛋白质折叠、免疫应答和细胞信号传导中发挥关键作用。其在多种癌症中的上调表达提示其可能作为治疗性靶点的潜力2,25。了解配体-受体相互作用对于认识特定疾病并开发更有效的药物至关重要。实现这一层次的细节需要快速且改进的分子可视化技术26,27。计算分子对接技术被用于配体研究，以预测小分子（如配体）与受体的结合方式。AutoDock 4.2.6软件使研究人员能够控制两个生物分子的对接，使其进入结合位点。当结合位点已知时，该方法尤为有用，并被认为适用于基于结构的药物设计（SBDD）。SBDD可在药物（配体）设计过程中整合专业知识与直觉判断

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讨论

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一种名为SFA或1nmk分子受体的新型免疫抑制天然物质从Streptomyces中提取出来。采用分子对接分析方法，确定了所构建配体与靶标蛋白之间的结合能。结果表明，在所有设计的配体中，SFA在结构上不同于CsA，并对Cyp A16表现出较强的亲和力。Cyp A具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性，通过与其外部受体CD147结合16，调控多种细胞过程。本研究计算了配体对新型Cyp A抑制剂及SFA 1nmk受体的亲和电荷。AutoDock 4.2.6的早期应用集中在分析蛋白质与核酸复合物的结合机制及催化特性。

尽管 AutoDock 4.2.6 软件的准确率约为 68%37该软件被认为是预测配体与蛋白质结合构象的理想工具。其性能已得到提升，且高速计算机和计算机集群的可及性增加，使得更大规模的筛选试验成为可能，从而能够将整个药物分子库针对制药行业相关靶点进行筛选。38,

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin终端 Cygwin终端 v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs教程Gromacs教程v25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL工具 MGL工具 v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open BabelOpen Babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF ChimeraUCSF Chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

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