本方案描述了松材线虫对Pinus pinaster的活体（in vivo）和离体（in vitro）感染，以及通过气相色谱法（GC）和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对其进行挥发性代谢物组分析。
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摘要
摘要
松材线虫（PWN）是一种植物寄生性线虫，可导致针叶树种发生松材线虫病（PWD）。这种植物寄生线虫已对亚洲多个国家的松林造成严重破坏，例如日本、中国和韩国。在过去二十年中，欧洲的葡萄牙和西班牙也受到严重影响。目前针对PWN感染机制及PWD在易感寄主物种中发展过程的研究，主要依赖于在温室条件下对松树幼苗进行人工接种感染。该技术耗时耗力，且需要投入大量经济和人力资源。此外，由于部分松树物种本身存在的遗传多样性，以及外界环境因素的干扰，实验结果容易出现变异性。作为一种替代方案， 体外 松树与松材线虫的共培养体系在研究生化变化方面具有更显著的优势，因为该体系 a) 可以控制单一的环境或营养变量，b) 占用空间较小，c) 所需获取时间较短，且 d) 是 无污染且无宿主遗传变异。以下方案详细说明了标准操作流程 体内 PWN 感染 Pinus pinaster，海岸松，以及新物种的建立 体外 松树嫩枝与松材线虫共培养作为一种改进的方法，用于研究该植物寄生虫对松树挥发物的影响。从共培养体系中提取由松材线虫诱导产生的挥发物。 体内 和 体外 通过水蒸馏法和蒸馏-萃取法从受感染的松树中提取挥发物，并采用固相微萃取（SPME）技术，利用纤维或填充柱方法捕获所释放的挥发性物质。
引言
松材线虫（PWN），Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970，是一种植物寄生性线虫，主要寄生于松属（Pinus）植物。该植物寄生线虫通过墨天牛属（Monochamus）昆虫在成虫成熟期取食过程中传播至易感松树体内。松材线虫通过侵袭树木的树脂道、减少树脂流动以及破坏其维管组织，导致水分运输中断，从而杀死树木。树冠部位缺水会引发松材萎蔫病（PWD）的最初可见症状，即松针在光合作用停止后出现黄化，并因失水而萎蔫下垂。松树通常通过产生树脂和挥发性化合物来响应生物和非生物胁迫1。因此，了解松树防御机制对于明确松材线虫侵袭的具体效应以及寻找害虫防治的替代方法具有重要意义2。
目前，野外条件下的实验依赖于感病松树的可获得性、松材线虫感染的确认以及多变的环境条件。在温室条件下，这些参数更易于控制，但寄主的遗传多样性会成为导致变异的重要来源3例如，在一项关于抗性反应的研究中 Pinus pinaster，萜烯类物质柠檬烯和树脂酸的产生与松材线虫感染相关4然而，由于样本数量较少且自然条件存在变异性，仅在一半的样本中检测到显著变化。在另一项利用温室培养的松树幼苗开展的研究中，尽管环境条件更易于控制，但天然松树的遗传多样性仍导致所提取挥发性物质具有较大差异。5由于疾病引起的松树挥发物可能受到环境和遗传变异的显著影响，因此依赖于 体外 茎尖培养物是研究松树组织对松材线虫感染的化学和生物化学反应的良好替代方法5,6通过扩增一种植物基因型 体外，其遗传组成可被长期维持并无限克隆，从而在更小的空间和更短的时间内建立数量更多的遗传一致个体，相较于 体内 条件。这些培养体系在易于调控的营养和环境条件下运作，是一种简单的实验系统，因此在评估挥发性物质的产生和释放方面比传统系统更具优势。7,8这些系统在木本植物研究中具有显著优势，因为这类研究通常需要大量资源，例如目标树木有时位于难以到达的地点，需要昂贵的设备、专门的工作人员以及更长的分析时间8. 体外 松树与松材线虫的共培养体系可用于评估线虫与植物在不同阶段的代谢相互作用9对于挥发性物质的分析而言，这一点极为重要，因为目前的轮廓分析技术已具有很高的准确性，采样过程中微小的差异都可能导致挥发性成分轮廓发生显著变化。气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是一种强大的挥发性物质分析方法，可实现对挥发性成分的快速、高效的轮廓分析。10. 本文所述方案介绍了感染技术 体内 温室条件下松树幼苗 体外 用于提取和分析诱导性挥发物的遗传一致的松树苗培养体系。
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方案
1. 培养 体外 松材线虫
注意：松材线虫通过取食非致病性真菌的菌丝进行培养-产孢菌株 灰葡萄孢菌 （德巴里）韦策尔11.
- 常规继代培养时，从真菌菌落最外缘转移一个直径为0.5 cm的菌块至无菌马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，于25℃培养 ± 1 °在25°C下培养7至10天，或直至真菌菌落生长至培养皿边缘。
注意：也可使用其他类型的通用真菌培养基进行真菌培养。 - 为获得更多的松材线虫，使用 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea） 培养的 体外 在经蒸汽灭菌的湿润认证有机大麦颗粒上大麦 L.)。在带盖的宽口250 mL锥形瓶中，将15 g谷物加入15 mL超纯水中并灭菌。随后，接种 灰葡萄孢菌 培养物插块，置于25℃培养 ± 1 °C 培养 7 至 10 天，或直至谷物表面完全被菌覆盖12.
注意：用于研究的线虫可向国家植物寄生线虫参考实验室申请获取。 - 通过接种启动PWN培养 B. cinerea 体外培养 用含有至少20条雄虫和30条雌虫的松材线虫水悬浮液接种培养物，并在前述条件下避光培养7至10天，或直至真菌菌落被完全消耗且线虫群体开始沿培养皿或烧瓶壁爬升图1用塑料膜密封培养皿或烧瓶，以防止干燥。
注意：雌虫可通过阴门瓣、较长的子宫后囊以及通常呈圆形的尾端来区分；雄虫尾端腹面弯曲且尖细，具有特征性的交合刺。13移液线虫悬浮液时，应划线接种真菌菌落，使移液的悬浮液不会在真菌表面形成液滴，从而避免线虫因表面张力而被滞留在液滴中。 - 用自来水冲洗烧瓶内壁，将冲洗液倒入装有滤纸的贝尔曼漏斗或托盘中，并加水浸没14。24 至 48 小时后，活体线虫将从感染材料转移到水中。使用 38 μm 筛网过滤回收。 µm 网筛15用自来水将收集的PWN冲洗至容器中。
注意：任何与松材线虫（PWN）接触过的材料都必须进行适当去污染处理，因其为检疫性生物；通常浸入乙醇中10至20分钟即可。废弃的水悬浮液必须灭菌或加热至60℃ °至少 35 分钟，4 °C - 立即使用含有PWN的水悬浮液，或将其置于11 °C，用于长期保存（长达2个月）。
2. 混合生活阶段松材线虫的灭菌
- 在超净工作台中，用移液器吸取含有约 5000 条松材线虫的线虫悬浮液，加入无菌的 38 µm 网筛中，并用无菌水冲洗。
注：在双目显微镜（40×）下对线虫进行计数。 - 将装有线虫的网筛下半部分浸入 20% 过氧化氢（H2O2）溶液中，手动混合 15 分钟。
- 通过网筛用无菌水冲洗无菌线虫，重复此步骤 3 次。最后一次冲洗时倾斜网筛，使线虫聚集在网筛边缘。用移液器吸取 1 mL 无菌水至网筛边缘，回收无菌线虫悬浮液，置于 11 °C 保存或立即使用。
注：可通过将 100 µL 线虫悬浮液接种于 PDA 培养基中并定期观察约 1 周，以评估灭菌效果是否存在污染。
3. 活体Pinus pinaster幼苗的接种
注意：接种试验应在至少两年生的 P. pinaster 幼苗上进行。树木可从经认证的商业供应商处购买，也可使用经认证的种子在温室中培育。
- 按照步骤1所述获取PWN接种物，通过向悬浮液中加水或将悬浮液静置（约60分钟）后倾去上层清水，调节混合虫态PWN悬浮液浓度至1000条/mL。在室温下，使用40倍体视显微镜在凹面载玻片上进行计数。
- 开始接种时，手动移除松树茎干顶部5 cm以下区域的针叶，并用灭菌解剖刀进行表皮纵向切口（长度0.5至1 cm）。16.
注意：进行切口的目的是使线虫能够进入松树内部组织。 - 在伤口区域放置一块无菌棉，用于承载移液的0.5 mL松材线虫悬浮液，并用透明胶带固定以保持湿度。
注意：每次接种之间需充分混匀松材线虫悬浮液，因为线虫会迅速沉降。若接种部位的悬浮液干燥，可能导致线虫侵染失败，因此应充分覆盖湿润的棉球。 - 对照组松树用无菌水代替松材线虫悬浮液。
- 定期观察松树萎蔫病（PWD）的发展进程，并通过量化针叶变色和萎蔫的百分比来评估症状。评分标准如下：0分表示无外部症状，1分表示针叶变色比例不超过25%，2分表示针叶变色比例在25%至50%之间，3分表示针叶变色比例在50%至75%之间，4分表示针叶完全变为褐色的松树。图2).
- 将温室保持在湿润环境（60%–80%），并频繁浇水（维持土壤最大持水量的70%），避免温度极端，因为线虫在低于10℃时会进入代谢失活状态 °C 和发育在 30 以上可能受到影响 °C.
- 接种后20天，通过在茎基部剪断幼苗并冷冻（-20 ℃）来收获植物材料，用于挥发性物质的提取。 °C）放入牛皮纸袋中。对于释放的挥发物（SPME纤维或填充管），在室温下立即取样松树幼苗5,17.
4. 建立与感染 体外 松树苗培养物
- 在表面灭菌前，用认证的 P. pinaster 用流动的自来水冲洗种子以去除较大的碎屑，然后用普通洗涤剂溶液（每40 mL水加1滴）剧烈振荡清洗，以去除较细的碎屑。
- 在超净工作台中，开始种子表面灭菌：加入商用漂白剂溶液（1:4，商用漂白剂与自来水配比），直至完全浸没清洗过的种子，剧烈搅拌15分钟。弃去漂白剂溶液，用灭菌的自来水将种子冲洗3次。
- 将种子浸入80%（v/v）乙醇溶液中，剧烈振荡处理15分钟，弃去乙醇，用灭菌超纯水洗涤3次。
- 进行松树种子萌发时，在超净工作台中使用无菌机械车床破除已消毒的种皮，分离出松子，然后将其置于含无菌湿润滤纸的密闭容器中，浸泡过夜以充分吸水6.
- 将湿润的松子在4℃下进行层积处理 °C 下培养 7 天以打破休眠并同步萌发，随后在 25 ℃ 黑暗条件下继续培养 °C直至发芽。
注：分层步骤为可选步骤。 - 将无菌萌发的松苗连同密闭容器转移至16小时光照光周期条件下，置于24℃培养 °C/ 18 °C 的光周期，持续 2 周或直至主茎开始发育。
- 在超净工作台中，用解剖刀将幼苗根部以上的地上部分切下，并转移至灭菌的Schenk和Hildebrandt（SH）培养基中18 添加30 g/L蔗糖、8 g/L琼脂、0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（BAP，一种细胞分裂素）和0.1 mg/L吲哚-3-丁酸（IBA，一种生长素）的培养基（pH = 5.8）6，以诱导微小植株的增殖。将培养物置于上述条件下培养 体外 培养生长室。
- 在超净工作台中，定期（约4周）通过切割进行继代培养 愈伤组织 用无菌手术刀切取茎段基部（与培养基接触的部分）的组织，并用无菌镊子将茎段簇转移至新鲜的增殖培养基中。
- 进行微茎伸长时，将微芽转移到上述描述的SH培养基中，但用3 g/L的活性炭替代植物激素。
注意：活性炭可吸附有毒物质，并防止切割组织中植物激素过度积累19. - 进行PWN侵染时，将伸长的嫩枝转移至不含植物激素和活性炭的SH培养基中，并在微枝底部加入100–150条混合生活阶段的灭菌PWN。在上述条件下培养，直至松树萎蔫病（PWD）症状开始明显出现（图3)6.
- 用于挥发物提取的植物材料采收，使用 体外 外植体立即使用或冷冻（-20 °C）直至分析。对于释放的挥发物（SPME纤维或填充管），应立即分析微植株盒。
5. 挥发性化合物的分离
注意：挥发性物质的提取可通过多种技术进行。此处采用Clevenger装置进行水蒸馏法提取挥发物。20蒸馏-使用 Likens-Nickerson 装置进行提取21，以及通过固相微萃取（SPME）使用涂膜纤维或填充管（多孔聚合物吸附剂）捕获顶空挥发物22.
- 水蒸馏
- 使用Clevenger装置分离精油。蒸馏系统由以下部分组成：a）Clevenger装置，b）用于盛装水和松树材料的圆底烧瓶或锥形瓶，c）合适的加热设备，以及d）用于固定整个系统的支撑架。图4A).
- 使用前彻底清洁玻璃器皿。使用实验室框架夹将克列文格装置固定在格栅架上。通过循环水冷却系统冷凝器，或在有条件时使用制冷循环器。
- 记录松树嫩枝的重量，并将其放入圆底烧瓶或锥形瓶中。调整加水量，确保容器内液体不超过容器容积的一半。
- 将加热设备置于烧瓶下方，检查是否存在泄漏，并确保系统各部件位置正确且已固定在支撑架上。
注意：使用前应彻底清洁、去脂并干燥Clevenger装置和烧瓶的磨口连接部件。为此，可使用经丙酮略微润湿的滤纸擦拭。这些部件中不得使用油脂。 - 通过位于Clevenger装置中部回流斜管处的加水漏斗加水。调节三通活塞的位置，使水流在两条管（斜管和量管）中均匀分配，直至加水至刚好不从回流斜管流入烧瓶为止（参见 图4).
- 打开热源，调节至使水沸腾，蒸馏速率为 2 - 3 mL/min。
- 当Clevenger装置右侧刻度管中出现第一滴蒸馏水时，开始计算蒸馏时间。平均蒸馏时间为3 h。23，但可根据具体需求采用更短或更长的蒸馏时间。精油通常位于上清液中，因其密度通常小于下方的芳香蒸馏水（花水）。
警告：蒸馏进行时，克文格装置会很烫。 - 蒸馏时间结束后，停止加热，静置约10分钟，使蒸馏和沸腾完全停止。10分钟后，顺时针打开活塞，使馏出液流出，直至精油到达刻度部分。读取所分离精油的体积。按每克鲜重或干重样品获得的毫升数（mL/g）计算得率，并以百分比（%，v/w）表示。
- 对于体积低于0.05 mL的精油，由于低于量筒的最小刻度，无法测定得率。为回收精油，使用蒸馏水 n-用戊烷冲洗Clevenger装置。
- 采用蒸馏法回收精油 n- 正戊烷，蒸馏结束后，等待约10至15分钟，逆时针打开三通旋塞，使馏出液从回流斜接管流出，直至液面降至填充漏斗下方。用洁净的滴管加入蒸馏水 n- 将戊烷加入填充漏斗，直至回流斜管的左上侧。避免触碰填充漏斗，以防交叉污染。
- 使用蒸馏水洗瓶向填充漏斗中加入水。 n-戊烷将流入蒸馏烧瓶，并利用煎煮水的余热蒸发。通过这种方式，它将流经系统，溶解并携带挥发性物质进入分液漏斗中的水相表面。顺时针旋转三通活塞至其正常位置。
- 按照 5.1.8 的步骤操作，收集溶解在其中的精油 n-戊烷
- 浓缩精油与水的混合物 n-戊烷浓缩至约100微升的最小体积 µ在室温下，使用吹扫浓缩仪系统，在氮气流中将溶液浓缩。浓缩后于-20℃保存 °直至分析前均置于 C 条件下。
注意：切勿蒸干，以免挥发性化合物损失。
- 蒸馏-提取
- 使用 Likens-Nickerson 装置从植物中提取挥发性物质。蒸馏-提取系统由以下部分组成：a) Likens-Nickerson 装置，b) 用于盛装水和松树材料的圆底烧瓶（蒸馏装置的右侧支臂），以及另一个用于盛装不混溶有机溶剂（如蒸馏水）的圆底烧瓶 n-戊烷（蒸馏装置的左侧支臂），c）两个合适的加热装置，d）一个冷凝管，以及 e）用于固定系统的支撑架（图4B).
注意：使用在-实验室蒸馏 n-戊烷，以避免样品被溶剂中添加的稳定剂污染。 - 首先在已固定的冷凝器中通入循环水，如有条件，可使用制冷循环器。
- 使用实验室框架夹固定蒸馏装置-将提取装置连接至格架。将待提取的松树材料装入圆底烧瓶，并加入蒸馏水至烧瓶半满。较小的100 mL圆底烧瓶应装入半满的蒸馏水 n-戊烷
注意：连接前，玻璃组件的磨口连接部分需彻底清洁、去油并干燥。可用浸有丙酮的滤纸短暂擦拭以进行清洁。 - 将加热套置于每个烧瓶下方。检查是否存在泄漏，并确保系统各部件均正确放置并牢固固定在实验架上。打开热源，调节至各自的沸点。水的蒸馏速率应控制在2-3 mL/min。
注意：在蒸馏过程中-提取过程中，Likens-Nickerson装置会发烫。 - 蒸馏时间结束后，停止对装有松树材料的烧瓶加热，并让其冷却 n-戊烷单独蒸馏10分钟。之后 n-戊烷变为透明液体后，停止加热并静置约10分钟。颜色变化表明馏出物现已进入烧瓶中 n-戊烷
- 浓缩 n在室温下，使用旋转蒸发仪在减压（70 - 73 mmHg）条件下将戊烷提取液部分浓缩。将部分浓缩的提取液转移至样品瓶中，并进一步浓缩至 ≈100 µ在室温下，使用吹扫蒸发器在氮气流中将溶剂蒸发至1 L。提取后，将样品于-20 ℃保存 °C，直至分析。
注意：提取物不应浓缩至干燥，否则会导致挥发性化合物的损失。
- 使用 Likens-Nickerson 装置从植物中提取挥发性物质。蒸馏-提取系统由以下部分组成：a) Likens-Nickerson 装置，b) 用于盛装水和松树材料的圆底烧瓶（蒸馏装置的右侧支臂），以及另一个用于盛装不混溶有机溶剂（如蒸馏水）的圆底烧瓶 n-戊烷（蒸馏装置的左侧支臂），c）两个合适的加热装置，d）一个冷凝管，以及 e）用于固定系统的支撑架（图4B).
- 使用涂层纤维进行顶空采样
- 固相微萃取（SPME）装置包括：a）手动操作的SPME手柄，b）涂覆型纤维，以及c）用于支撑SPME手柄的合适支架图4C）。对于本方案，使用手动的-100 微米 SPME-顶空系统小瓶 µM 聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层纤维用于捕获挥发物。
注意：其他市售纤维具有不同化学特性的涂层，应根据所需效果进行选择。 - 将每根 SPME 纤维在 250 ℃ 下进行热预处理，时间不超过 20 分钟 °使用前按照制造商的建议进行C。
- 将松树材料或松树部分放入透明玻璃小瓶中，用带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫（隔垫）的开孔螺旋盖密封。材料应置于距瓶口至少2至3 cm处，以确保纤维不接触样品。
- 同时使用SPME纤维对空瓶进行采样，开展对照实验，以鉴定系统污染物，或确认SPME纤维重复使用后无残留干扰。
- 将松树材料置于小瓶中静置1小时，以达到大气平衡后再进行挥发物采集。
注意：SPME 分析可在室温下或通过将样品瓶置于支架中并放入水浴锅内调节温度的条件下进行。 - 调整SPME持针器上隔垫穿刺针的深度，使其能够刺穿隔垫，但在纤维暴露时不会接触到样品材料。
- 收回纤维后，将支架针穿过聚四氟乙烯衬垫。下推推杆以伸出纤维。顺时针旋转推杆，并将Z形槽水平左侧的固定螺钉固定。24暴露纤维1小时。
- 通过逆时针旋转推杆直至其到达Z形槽顶部，将纤维缩回。收集的挥发性物质现可直接用于气相色谱和/或气相色谱-质谱分析。
注意：如有需要，纤维可在室温下保存以待分析，但不得超过一周。
- 固相微萃取（SPME）装置包括：a）手动操作的SPME手柄，b）涂覆型纤维，以及c）用于支撑SPME手柄的合适支架图4C）。对于本方案，使用手动的-100 微米 SPME-顶空系统小瓶 µM 聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层纤维用于捕获挥发物。
- 使用填充管进行顶空捕集
- 准备用于捕获顶空挥发物的装置，该装置由装填不锈钢阱组成，包括：a) 质量流量泵送系统，b) 聚四氟乙烯（PTFE）管，c) 活性炭空气过滤器，d) 填充多孔树脂聚合物的阱管，以及 e) 玻璃器皿或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）袋（烹饪袋）图 4D)25.
- 将松树材料置于带盖玻璃器皿或PET袋内，以积累顶空挥发物。
注意：需注意常见塑料释放的挥发性物质含量丰富，可通过气相色谱-质谱法（GC-MS）大量检测到。 - 对于封闭循环系统，按如下方式连接回路：a）将泵的出口连接至PTFE管路，b）将PTFE管路连接至活性炭空气过滤器，c）从空气过滤器引出额外的管路，连接至玻璃器皿或PET 装有松树材料的袋子，d) 将填充柱连接至玻璃器皿或PET 袋装出口，e) 从不锈钢管出口到质量流量泵入口的额外聚四氟乙烯管22.
注意：多孔聚合物填充的不锈钢管应根据制造商的建议在热脱附单元中进行热处理，例如，在100℃下处理不超过15分钟。 °使用前请置于 C。注意，管子具有应遵守的流向。 - 使用质量流量泵控制过滤空气的流量和速率，以每分钟0.6升的速度将100升过滤空气泵入松树系统，收集挥发物。
注意：流经色谱柱的顶空空气的量和/或流速会影响捕获的挥发性物质的数量，进而影响所获得的色谱图。 - 挥发物收集后，用密封储存盖将填充管两端封闭。室温下保存（最多1周），并尽快分析，因为挥发物可能降解或逸出。
- 清洗时，用70%乙醇冲洗所有聚四氟乙烯（PTFE）管路和玻璃器皿，并在230 °C烘箱中加热 °至少 2 小时，4 °C25.
6. 挥发性物质谱的分析
- 通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析挥发性物质谱图，或常规使用火焰离子化检测器的气相色谱法（GC-FID）对已鉴定的挥发性物质进行定量分析。
注意：采用GC-FID和GC-MS进行分析的方法描述较为广泛，超出本研究的目标范围。建议读者参考相关文献以获取详细信息。-实验室操作规程或标准，例如 ISO 760926，提供了各组分定量分析的相关操作条件，以及两种分析方法比较的文献数据27. - 使用高纯度或溶剂携带的分析物，例如 n-戊烷或 n-正己烷，可直接进样，或吸附至纤维（如SPME）后直接注入色谱进样口，或通过与气相色谱仪联用的热脱附（TD）装置进行脱附。
注意：尽管毛细管柱具有更高的灵敏度、更高的分辨率和更短的分析时间，但其样品承载能力较低。因此，尽管几乎所有操作条件都可以相似，但分析物的类型（纯品、溶于溶剂、SPME 等）可能需要采用不同的分流/不分流进样程序。 - 通过将挥发性成分的保留指数（依据 ISO 7609 测定）与实验室利用参考样品建立的质谱库中的气相色谱-质谱（GC-MS）谱图进行比对，完成对挥发性成分的鉴定。参考样品中各组分的身份已通过保留指数、气相色谱-质谱法（GC-MS）以及 13C-NMR、实验室合成与分离得到的化合物、市售标准品，或在缺乏上述条件时，采用市售的质谱图库。
- 使用图形表示法（色谱图）和色谱图谱来呈现结果，其中列出样品中所有已鉴定化合物的相对含量，并以所用合适色谱柱上的保留指数标明其洗脱顺序。
- 对于大量样本，应根据化学成分进行适当的统计分析评估，以解释样本的分布情况（聚类和/或分离）。
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结果
在适宜条件下，松材线虫（PWN）可快速繁殖，其世代周期最短可达4天，每头雌虫一生可产卵约80枚28。采用上述方法，可获得大量PWN，具体数量取决于真菌的生长情况。在8天的培养周期内，PWN种群数量可增长至原来的100倍（图1）。为提高PWN收获量的一致性，建议使用经过灭菌处理的PWN，因为未知细菌或真菌的污染会对PWN种群产生不利影响。
成功接种松材线虫后，松树幼苗约在接种后20天出现松材线虫病症状（图2）。然而，已知P. pinaster对松材线虫病的感病性具有较高的遗传变异性，症状出现时间的差异十分常见3。
体外 松树嫩枝不具备这种遗传变异性，且其环境和营养条件可根据用户需求进行控制和设定。 体外 海岸松嫩梢培养物在SH伸长培养基中生长良好，每周生长速率约为...
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讨论
本文所述方案介绍了一种改进的方法，用于分析受松材线虫（PWN）感染的海岸松中挥发性化合物，该方法通过使用纯系材料降低了环境和遗传变异的影响，从而避免其对结果的干扰。 体外 可分析来自海岸松基因型的提取和释放的挥发物，作为松林对最具破坏性生物威胁之一的寄主响应。
通过在实验室中培养，可轻松实现参考菌株的保藏或大量松材线虫（PWNs）的繁殖。 体外灰葡萄孢菌 （非-产孢菌株），并将其用作线虫的食物来源。在适宜条件下，该方法通常易于操作；但在移取松材线虫（PWN）悬浮液时，务必破坏真菌菌落表面，否则线虫将滞留在水滴中。若操作成功，真菌菌丝将被完全消耗，松材线虫数量将显著增加。线虫的无菌化是关键步骤，一旦获得无菌的松材线虫，即可将培养物维持在 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），随后成为仅被该真菌污染的单菌培养物，或在 体外 松树嫩梢6,29.
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本研究部分由欧盟通过PurPest项目（资助协议编号101060634）以及葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过以下项目资助：NemACT（DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002）；NemaWAARS（DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021）；CESAM（UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+LA/P/0094/2020）；CE3C（DOI 10.54499/UIDB/00329/2020）；GREEN-IT（DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 和 10.54499/UIDP/04551/2020）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 38目试验筛 | Retsch | 60.131.000038 | |
| 6-苄氨基嘌呤（6-BAP） | Duchefa Biochemie | B0904 | |
| 活性炭 | Duchefa Biochemie | C1302 | |
| Clevenger 提取装置 | WINZER Laborglastechnik | 25-000-02 | |
| 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | |
| 吲哚-3-丁酸（IBA） | Duchefa Biochemie | I0902 | |
| Likens-Nickerson 提取装置 | VitriLab LDA. | c/IN29/32 | |
| Microbox 圆形容器 | Sac O2 | O118/80+OD118 | |
| n-戊烷 | Sigma-Aldrich | 1.00882 | |
| PARAFILM M 密封膜 | BRAND | HS234526B-1EA | |
| 植物琼脂 | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| 马铃薯葡萄糖琼脂 | BD DIFCO | 213400 | |
| 24号手术刀片 | Romed Holland | BLADE24 | |
| Schenk & Hildebrandt 基本盐培养基 | Duchefa Biochemie | S0225 | |
| Schenk & Hildebrandt 维生素混合液 | Duchefa Biochemie | S0411 | |
| 固相微萃取纤维组件 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Supelco | 57300-U | |
| 固相微萃取纤维支架 | Supelco | 57330-U | |
| 蔗糖 | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Tenax TA-不锈钢吸附管-预处理并带盖 | Markes International | C1-AAXX-5003 |
参考文献
- Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. Pine wilt disease: A global threat to forestry. Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).
- Mumm, R., Hilker, M. Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects. Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).
- Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families. Annals Forest Sci. 75 (3), 85(2018).
- Gaspar, M. C., et al. Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea. J Supercritical Fluids. 159, 104784(2020).
- Rodrigues, A. M., et al. Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Chem Biodiver. 14 (1), e1600153(2017).
- Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).
- Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 248 (1), 1-18 (2018).
- Bonga, J. M., von Aderkas, P. In Vitro Culture of Trees. , Springer. Netherlands, Dordrecht. (1992).
- Faria, J. M. S., et al. Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures. Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).
- Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).
- Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).
- Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters. Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).
- Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970. J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications. J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).
- IPPC. IPPC DP 10: Bursaphelenchus xylophilus. Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures. 27, 1-40 (2016).
- Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster. Front Plant Sci. 12, 10(2021).
- Gonçalves, E., et al. Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles. Phytochemistry. 169, September 2019 112159(2020).
- Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
- Tereso, S., et al. Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT. Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).
- Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia. , 241(2010).
- Likens, S. T., Nickerson, G. B. Detection of certain hop oil constituents in brewing products. Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).
- Karimi, A., Gross, J. Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys. Front Horti. 3, (2024).
- Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. Comparison of isolation procedures for essential oils - II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).
- Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review. Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).
- Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants. Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).
- ISO. ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method. ISO: Geneva, Switzerland. , (1985).
- Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).
- Fielding, N. J., Evans, H. F. The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position. Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).
- Faria, J. M. S., et al. First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Plants. 12 (13), 2438(2023).
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