本方案描述了EcoHIV感染与Tmem119-EGFP小鼠相结合，为研究与HIV相关的神经认知障碍啮齿类动物模型中小胶质细胞的改变及病毒储存库提供了一个有价值的生物系统。
本文内容
摘要
摘要
联合抗逆转录病毒治疗（cART）已显著改善了艾滋病病毒感染者（PLWH）的生活质量。然而，目前有超过400万的PLWH年龄超过五十岁，并伴有相应的HIV相关神经认知障碍（HAND）。为了理解HIV对中枢神经系统的影响，迫切需要一个可靠且可行的HIV模型。此前，研究人员开发了一种使用嵌合HIV（EcoHIV）接种的新型生物系统，在大鼠模型中用于研究神经认知功能障碍和突触功能异常。尽管如此，阐明EcoHIV在神经解剖学上的分布，尤其是其在脑内不同细胞类型中的差异性表达，仍是一个重大挑战。在本研究中，我们对携带mScarlet荧光标记的EcoHIV进行了改造，并通过眼眶后注射方式注入Tmem119-EGFP基因敲入小鼠（该小鼠主要在小胶质细胞中表达增强型绿色荧光蛋白）体内，以确定小胶质细胞是否是脑内HIV表达和病毒储存库的主要细胞类型。当前数据显示：（1）体外实验中，EcoHIV-mScarlet荧光信号主要定位于原代啮齿类脑细胞中的小胶质细胞样细胞；（2）体内实验中，将EcoHIV-mScarlet注射入Tmem119-EGFP小鼠后，在小鼠脑内诱导出显著的HIV表达。mScarlet与EGFP信号的共定位表明，小胶质细胞是脑内携带HIV的主要细胞类型。总体而言，啮齿类动物中的EcoHIV提供了一个有价值的生物系统，可用于研究小胶质细胞的改变、脑内病毒储存库以及HIV相关神经认知障碍的神经机制。
引言
尽管抗逆转录病毒治疗带来了显著益处，但艾滋病病毒感染者（PLWH）仍会出现神经认知障碍。为了更深入地理解艾滋病相关神经认知障碍（HAND）的神经元机制，迫切需要建立HIV模型，以进一步阐明神经艾滋病（NeuroHIV）中特定细胞类型的参与情况。
HIV-1 转基因大鼠持续暴露于 HIV-1 病毒蛋白，是研究与 HIV 相关神经认知功能障碍（HAND）相关的神经认知障碍1,2,3,4及神经解剖学改变的常用啮齿类动物模型5,6,7。由于 gag 和 pol 结构域的功能性缺失，病毒无法复制，因此 HIV-1 转基因大鼠不具有传染性8,9。最近，Potash 等人首次报道了小鼠中的嵌合型 HIV（EcoHIV）感染模型10，随后该模型被扩展至大鼠，可能有利于进一步研究 HAND 及物质使用障碍11。在此新型生物系统中，观察到全身性 HIV-1 感染以及多种人类 HIV-1 感染的临床特征，包括淋巴细胞和巨噬细胞的参与、抗病毒免疫反应、神经侵袭性以及脑部炎症。
小胶质细胞作为特化的脑内常驻巨噬细胞，在维持脑功能和稳态中发挥关键作用。为了将小胶质细胞与密切相关细胞类型（例如血液单核细胞、血管周围巨噬细胞、脑膜巨噬细胞）区分开来，本研究采用了Tmem119-EGFP基因敲入小鼠品系。既往研究报道，跨膜蛋白119（Tmem119）在啮齿类和人类脑组织中表现出严格的小胶质细胞特异性表达模式12,13,14,15。在Tmem119-EGFP基因敲入小鼠中，EGFP信号在整个脑内均可观察到，并特异性地定位于小胶质细胞。
在本研究中，将 EcoHIV-mScarlet 病毒接种至 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠体内，并鉴定了中枢神经系统中 EcoHIV 阳性的细胞。本文介绍了一种在 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠中接种 EcoHIV-mScarlet 病毒的实验方案，为靶向治疗 HIV 相关的小胶质细胞改变提供了可靠的模型。
方案
南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会批准了所有动物实验方案（联邦保证编号：D16-00028）。所有实验均严格遵循美国国立卫生研究院制定的指南 实验动物护理和使用指南. Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠（30日龄，雄性，体重23–26 g）购自商业来源，并饲养于经AAALAC认证的设施中，采用群养方式。所有动物均置于12小时光照/12小时黑暗循环条件下，可自由获取食物和饮水。本研究中所用动物、试剂及设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 在293FT细胞中进行EcoHIV-mScarlet的包装
- 将293 FT细胞接种于明胶预包被的75 cm2培养瓶中，培养至转染时细胞融合度达到30%。
- 按照生产商说明书（见材料表），使用Lipofectamine 3000（22.5 µL）转染质粒DNA（15 µg）EcoHIV-mScarlet（补充文件1）。
- 在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 °C培养细胞3天。
- 收集含有病毒悬液的条件培养基，于4 °C以500 × g离心10分钟，用10 mL移液器将上清转移至无菌50 mL离心管中。
- 向病毒混合液中加入一定量的Lenti-X浓缩剂（体积比1:3）（例如，8 mL浓缩剂加入24 mL病毒混合液），轻轻倒置混匀管壁5次。
- 将病毒与Lenti-X浓缩剂的混合物于4 °C孵育2天，然后于4 °C以1,500 × g离心45分钟，尽可能用移液器小心吸除上清。
- 用预冷的100 mM PBS缓冲液200 µL重悬病毒沉淀，于-80 °C保存。
注意：293FT细胞中EcoHIV-mScarlet病毒包装的详细步骤已在我们先前的研究中描述16。切勿涡旋震荡或在病毒溶液中引入气泡。
2. 原代大鼠脑细胞中EcoHIV-mScarlet感染
- 按照先前发表的报告16，从大鼠胎鼠（18天）中进行原代脑细胞分离。
- 将解离的细胞转移至预先用多聚-L-赖氨酸包被并含有玻璃插片的12孔板中，每孔加入1 mL DMEM/F12培养基（含10% FBS）。次日更换为含B27添加剂的Neurobasal培养基。
- 将原代胎鼠脑细胞在5% CO2培养箱中培养3周。
- 向培养基中加入EcoHIV-mScarlet（60 µL，1.26 × 106 TU/mL），与培养的脑细胞共同孵育6天。
- 用4%多聚甲醛固定细胞，并使用特异性一抗（CD11b/c、Iba1）对感染的脑细胞进行免疫染色。
- 在共聚焦显微镜系统下使用40×物镜获取图像。
3. 成年小鼠原代胶质细胞中EcoHIV-mScarlet病毒感染
- 用5%七氟烷麻醉成年小鼠5分钟（遵循机构批准的实验方案）。用70%乙醇对头部皮肤进行消毒。
- 在确认小鼠对有害刺激不再有反应后，使用已灭菌的锋利剪刀进行断头。将头部转移至一个新的含有5 mL HBSS的培养皿中。
- 打开头皮，将脑组织转移至另一含有5 mL无菌HBSS的培养皿中。剥离脑膜，将额叶皮层转移至2 mL HBSS中。
- 加入20 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液至混合物中。室温孵育15分钟，每隔几分钟轻轻摇动试管。
- 将解离的细胞转移至预先用多聚-L-赖氨酸包被的75 cm²培养瓶中2 含10 mL DMEM/F12培养基和10% FBS的培养瓶
- 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 培养箱, 直至90%汇合度。用2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化脑细胞。
- 将脑细胞传代培养至含5 mL DMEM/F12生长培养基的35 mm玻璃底培养皿中，直至细胞融合度达到80%。
- 加入EcoHIV-mScarlet（8 µL，1.26 × 106 TU/mL）加入培养基中，将小鼠胶质细胞孵育2天。
- 每天在荧光显微镜下观察红色（mScarlet）荧光信号。
4. 将 EcoHIV-mScarlet 病毒经眶后注射至 Tmem119-EGFP 小鼠
- 使用3%七氟烷麻醉30日龄的雄性和雌性Tmem119-EGFP小鼠，直至其对有害刺激无反应。
- 将小鼠固定于侧卧位，注射侧眼睛朝上，通过连接麻醉系统的鼻罩进行呼吸。使用合适尺寸的鼻罩以维持持续麻醉。
- 将EcoHIV-mScarlet在冰上解冻。用33 G钝头针头将病毒溶液装入眼内注射器中。
- 将小鼠 置于右侧卧位，头部朝向左侧。确定内眦位置作为注射位点。
- 突出眼球后，以45度角缓慢轻柔地将针头插入眼内眦，小心向前推进至眼球后方的血管（眶后窦）。
- 向眶后窦缓慢注射6.5 µL EcoHIV-mScarlet（1.26 × 106 TU/mL，双侧眼接种）。小心将针头从眶后窦拔出，并轻压眼睑以止血。
- 在眼部涂抹润滑剂，防止角膜干燥或受损。
- 将小鼠置于带有加热垫的恢复箱中，直至其苏醒。
注意：针头斜面不宜插入过深，以免破裂动脉或造成骨损伤。病毒输注时间取决于多种因素（如注射体积、滴度、动物体型）。在EcoHIV病毒输注后，通常在眶后注射一周时可观察到显著表达11,16,17。
5. 脑组织切片的可视化
- 使用5%七氟烷对小鼠进行深度麻醉。当小鼠对有害刺激无反应且反射消失时，进入步骤5.2。
- 将小鼠仰卧位固定于化学通风橱内。
- 沿胸骨中线切开皮肤，分离膈肌并用剪刀打开胸腔。
- 将22 G1 1/2针头插入左心室，用剪刀剪开右心房。
- 灌注50 mL预冷的100 mM PBS缓冲液，随后灌注100 mL预冷的4%多聚甲醛缓冲液16。
- 完整取出小鼠脑组织16。
- 用4%多聚甲醛固定过夜。
- 使用组织粘合剂将脑组织固定在振动切片机的金属平台上，采用碳素钢刀片切割成50 µm厚的冠状切片。
- 用毛刷将脑切片转移至载玻片上，立即在每张切片上加入0.1 mL抗荧光淬灭封片剂。
- 在脑切片上覆盖22 mm × 50 mm的盖玻片，将超低温载玻片置于避光环境中干燥1天。
- 将共聚焦显微镜系统设置为60×（A/1.4，油镜），Z轴扫描间隔设为0.15 µm，针孔大小为30 µm，后投影针孔半径为167 nm。
- 使用488 nm和594 nm激发波长采集目标脑区的多通道图像。
结果
一段包含3'端“Cla1”和5'端“Not1”酶切位点的mScarlet片段（1858 bp）被插入至pNL4-3-EcoHIV慢病毒载体中图1）。为了验证EcoHIV-mScarlet的表达，从大鼠E18胚胎皮层分离的原代脑细胞用EcoHIV-mScarlet处理（60 µL, 1.26 × 106 TU/mL）培养 6 天 体外. 数据来自 图2 结果显示，基于不同的细胞形态，mScarlet的红色荧光信号主要定位于胶质细胞类型的细胞中。此外，CD11b/c和Iba1（小胶质细胞的细胞标志物）标记显示，mScarlet信号与CD11b/c+和/或Iba1+细胞共定位。这些数据表明，小胶质细胞是EcoHIV-mScarlet分布的主要细胞类型 体外培养细胞中未见明显的神经元感染补充图1).
接下来，测试了EcoHIV-mScarlet对成年小鼠原代混合胶质细胞的感染情况。为此，首先从成年小鼠（2个月大）中分离并纯化混合胶质细胞，然后用EcoHIV-mScarlet（8 µL，1.26 × 106 TU/mL）感染2天。图3中的图像显示，EcoHIV-mScarlet成功感染了成年小鼠的胶质细胞。
为了进一步研究 EcoHIV-mScarlet 在小鼠脑内的分布模式，特别是鉴定被感染的细胞类型，将 EcoHIV-mScarlet 通过眶后静脉注射至 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠品系中，该小鼠品系的小胶质细胞特异性表达 EGFP 荧光信号，且无其他类型巨噬细胞的干扰5。如图4（亦见补充图2）所示，mScarlet 红色荧光信号出现在 EGFP 阳性细胞中，表明小胶质细胞是 EcoHIV 在小鼠脑内表达的主要细胞类型。
图1：EcoHIV-NL-4-3-mScarlet 载体图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2原代大鼠脑细胞中EcoHIV-mScarlet的感染 (A，ECD11b/c 染色在原代脑细胞中的代表性图像。脑细胞取自 E18 大鼠胚胎，并用 EcoHIV-mScarlet 病毒感染 6 天。B，FmScarlet荧光信号的代表性图像 体外 脑细胞。C,G) 原代脑细胞中Iba1染色的代表性图像。D,HCD11b/c、mScarlet 和 Iba1 三重标记的合并图像。比例尺： 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3原代小鼠混合胶质细胞中EcoHIV-mScarlet感染 (A，BmScarlet 分布的代表性共聚焦图像 体外从成年C57BL/6小鼠（2月龄）中分离原代混合胶质细胞，培养2周后进行病毒感染。将EcoHIV-mScarlet加入培养基中孵育两天，随后在共聚焦显微镜60×物镜下采集图像。比例尺： 10 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：EcoHIV-mScarlet在Tmem119-EGFP基因敲入小鼠品系中的分布。（A,B）脑切片中mScarlet/EGFP/ToPro3信号的合并图像。黄色框表示（B）的目标区域。比例尺：300 µm。（C）Tmem119-EGFP基因敲入小鼠品系嗅觉区外丛状层中mScarlet分布的代表性图像。（D）EGFP分布的代表性图像。在Tmem119-EGFP基因敲入小鼠品系中，荧光信号定位于小胶质细胞。（E）TO-PRO-3细胞核染色的代表性图像。比例尺：300 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：感染EcoHIV-mScarlet病毒的原代大鼠脑细胞的MAP2和MOG染色。 比例尺：50 µm。请点击此处下载该文件。
补充图2：EcoHIV-mScarlet感染的共聚焦图像 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠品系 比例尺： 75 µm. 请点击此处下载此文件。
补充文件 1：EcoHIV-mScarlet 质粒 DNA 序列。 请点击此处下载该文件。
讨论
本研究发现：（1）新型 EcoHIV-mScarlet 能够成功感染原代大鼠脑细胞 in vitro；（2）对 mScarlet、CD11b/c 和 Iba1 的三重标记表明，在原代大鼠脑细胞 in vitro 中，小胶质细胞是 EcoHIV 表达的主要细胞类型；（3）来自成年小鼠的原代脑细胞 in vitro 进一步证实了 EcoHIV-mScarlet 的感染能力；（4）在 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠品系中，EcoHIV-mScarlet 的分布呈现出小胶质细胞特异性的感染模式。
近期研究表明，中枢神经系统（CNS）中多种类型的脑细胞（如神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞等）在HIV感染及HIV相关神经认知障碍过程中表现出功能和转录组层面的改变18,19。例如，星形胶质细胞占脑组织的30%–70%，通过监视功能维持脑内稳态20。星形胶质细胞还调节免疫功能，并调控多种细胞因子和趋化因子的分泌，尤其在HIV感染引起的脑部炎症和神经退行性病变情况下更为显著21,22。HIV感染小胶质细胞不仅导致病毒蛋白及促炎性细胞因子和趋化因子的持续释放，还构成了HIV病毒储存库的主要来源23,24,25,26。此外，活化的小胶质细胞在中枢神经系统中发挥关键的免疫学功能；然而，长期活化可能加剧HIV病程中的神经退行性病变10,27。少突胶质细胞也具有重要功能，包括释放多种神经营养因子（如神经生长因子、脑源性神经营养因子等）28。既往研究发现，艾滋病患者脑内少突胶质细胞数量显著减少，提示HIV病毒蛋白可能对少突胶质细胞造成直接损伤29。因此，建立一种特定细胞类型操控的HIV感染模型，将为识别不同脑细胞在感染后功能差异提供基础手段。本研究构建了一种生物学系统，通过嵌合型HIV（EcoHIV）接种模拟HIV-1的特征，并结合Tmem119-EGFP基因敲入小鼠品系，建立并验证一种小胶质细胞操控的HIV啮齿类动物模型。
然而，必须认识到本研究的局限性。存在少数 Iba1/CD11b/c 阴性细胞呈现出 mScarlet 荧光信号 体外. 其他类型的脑细胞，例如脑巨噬细胞或周细胞，可能参与EcoHIV感染；或者，细胞培养环境可能导致相对于体内情况出现异常的感染模式 在体 接种。未来，整体动物研究应进一步阐明mScarlet+小胶质细胞在EcoHIV感染过程中的功能，并进一步界定脑内mScarlet+EcoHIV小胶质细胞的区域分布。此外，该啮齿类动物模型还可用于研究小胶质细胞感染所引发的神经认知功能改变。综上所述，EcoHIV-mScarlet的接种为 Tmem119-EGFP 基因敲入小鼠为研究小胶质细胞介导的HIV相关神经认知障碍机制提供了新的模型和研究策略。
披露
所有作者均无利益冲突需要声明。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 DA059310、DA058586、AG082539 和 GM109091。我们感谢西奈山伊坎医学院的 Potash 博士慷慨赠送 EcoHIV-NL4-3-EGFP。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 293FT细胞 | 赛默飞世尔科技 | R70007 | |
| 33 G，小型鲁尔接头RN针头（针尖类型：3，针头长度：19.25 mm） | Hamilton | 7803-05 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Cellgro | 30004CI | 100x |
| C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J | 杰克逊实验室 | 品系编号：031823 | |
| Corning BioCoat 明胶 75 cm²² 带透气盖的矩形斜颈细胞培养瓶 | Life Technologies | 354488 | |
| 康宁 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基 | Life Technologies | 10013CV | |
| 盖玻片 | VWR | 637-137 | |
| Dumont #5 镊子 | 世界精密仪器公司 | 14095 | |
| Dumont #7 镊子 | 世界精密仪器公司 | 14097 | |
| 内毒素去除型质粒大量提取试剂盒（10） | Qiagen | 12362 | |
| Eppendorf Snap-Cap 微量离心管 Biopur Safe-Lock 管 | Life Technologies | 22600028 | |
| 双刃碳钢刀片 | Ted Pella, inc. | 121-9 | |
| Fisher BioReagents 微生物学培养基：LB 肉汤，Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| 人重组抗 CD11b 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-120-214 | 1:50 稀释度 |
| 眼内注射器注射筒（6.5 µL），可拆卸针头 | Hamilton | 6609071-01 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂 | Life Technologies | L3000015 | |
| Invitrogen One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Fisher Scientific | C404052 | |
| 虹膜镊 | 世界精密仪器公司 | 15914 | |
| 虹膜剪 | World Precision Instruments | 500216 | |
| 慢病毒相关p24 ELISA试剂盒 | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X 浓缩剂 | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Life Technologies | 11058021 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| PELCO easiSlicer 振动组织切片机 | Ted Pella, inc. | 11000 | |
| PELCO Pro CA44 组织粘合剂 | Ted Pella, inc. | 10033 | |
| PELCO Pro 标本回收器 | Ted Pella, inc. | 101-33 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| 兔单克隆抗Iba1抗体 | Abcam | ab178847 | 1:500 稀释度 |
| RN 压合接头 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| 七氟烷 | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sprague Dawley 孕鼠 | Inotiv | ||
| SuperFrost Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| To-Pro-3 | 赛默飞世尔科技 | T3605 | 细胞核染色试剂盒 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红 | 赛默飞世尔科技 | 25200-056 | |
| 万纳斯剪刀 | 世界精密仪器公司 | 500086 |
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