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方法文章

利用16α-[18F]-氟-17β-雌二醇PET显像雌性去卵巢小鼠中人乳腺癌异种移植瘤的雌激素受体α表达

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DOI：

10.3791/67151

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2025年3月7日

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1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health, 4Faculty of Medicine, The University of Melbourne

本文内容

摘要

此处，我们演示一种使用16α-[18F]-氟代-17β-雌二醇（18F-FES）正电子发射断层扫描（PET）作为可视化雌激素受体α（ERα）阳性乳腺异种移植瘤中ERα表达的工具。

摘要

为了展示如何利用16α-[18F]-氟-17β-雌二醇（18F-FES）正电子发射断层扫描（PET）在BALB/c裸鼠中可视化雌激素受体α（ERα）阳性乳腺癌异种移植瘤，我们对去卵巢的BALB/c裸鼠注射了ERα阳性乳腺癌细胞（MCF-7，3 × 106 个细胞；肩部 [n = 10] 或第4对腹股沟乳腺脂肪垫 [n = 10]）或ERα阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231，1 × 106 个细胞；乳腺脂肪垫 [n = 5]）。携带MCF-7细胞的小鼠在细胞接种前2天，于颈背部皮下注射20 µg的17β-雌二醇（20 µg/20 µL；玉米油:乙醇，9:1），之后每周注射5次，持续5周。肿瘤体积根据公式：(L×W2)/2（L：长度，W：宽度）进行测量。当肿瘤体积达到约100 mm3时，在进行18F-FES PET成像前2天停止注射17β-雌二醇，以避免其与ERα产生竞争性结合。通过尾静脉侧支给予18F-FES后，在注射后1至1.5小时期间进行为期15分钟的PET/MRI扫描。18F-FES摄取在ERα阴性的MDA-MB-231荷瘤小鼠中未被观察到。在肩部携带MCF-7肿瘤的小鼠中，18F-FES摄取最为显著。而在腹股沟乳腺脂肪垫中生长的MCF-7肿瘤，其18F-FES摄取可见度较低，因为18F-FES的肠道排泄模式掩盖了这些肿瘤中可检测到的放射性信号。为了将18F-FES PET作为可视化ERα阳性乳腺异种移植瘤中ERα表达的工具，我们证明，当肿瘤位于小鼠腹部区域以外（如肩部）时，18F-FES摄取的可视化效果更为清晰。

引言

乳腺癌（BC）可根据不同的分子亚型进行分类1。被归类为管腔亚型的乳腺肿瘤会过表达雌激素受体α（ERα）。因此，该乳腺癌亚型也被称为ERα阳性（ERα+）。幸运的是，被诊断为ERα+乳腺癌的患者具有最高的10年生存率，同时远处转移的发生率较低2,3。由于表达ERα，这类患者可接受多种激素治疗，包括选择性雌激素受体调节剂（SERMs）、抗雌激素药物以及芳香化酶抑制剂4。

为了评估乳腺癌患者是否适合接受激素治疗，必须测定其乳腺肿瘤中ERα的表达水平5,6,7。尽管检测的金标准是采用免疫组织化学（IHC）方法，但许多研究报告指出该方法在结果的可重复性和可靠性方面存在问题6,8,9。由于IHC技术本质上是半定量的，组织处理过程的差异以及后续结果判读的不同可能导致结果不一致6。为解决这一反复出现的问题，美国临床肿瘤学会于2010年制定了相关指南，并于2020年进行了更新，旨在减少观察者之间的判读差异10。目前临床验证的临界值为≥1%，即使ERα表达水平极低，内分泌治疗仍可带来具有临床意义的获益11。

在晚期乳腺癌中，ERα的表达水平在转移灶与原发肿瘤之间可能存在差异。一些研究报道，转移灶与原发肿瘤之间的ERα表达水平差异可达18%至55%，这凸显了确定乳腺癌转移灶ERα状态的重要性12。为此，相关指南强调，应确认转移灶的激素受体状态，以制定合理的治疗方案13,14。然而，这一做法的可行性尚存疑问，特别是采用免疫组化（IHC）方法时，因为转移灶可能位于难以进行活检的部位。

分子影像技术已发展成为检测和可视化癌症患者肿瘤病灶的重要工具。其中，正电子发射断层扫描（PET）成像需要使用示踪剂，更确切地说是放射性药物，这些药物被设计用于靶向肿瘤的某些特征，以实现对病灶的无创可视化。在肿瘤学中应用最广泛的PET示踪剂是18F-氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）15。在本研究中，我们探讨了一种放射性标记的雌二醇形式——18F-氟代雌二醇（18F-FES）的应用。雌二醇是ERα的配体，是一种主要由女性卵巢产生的激素16。18F-FES近期已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，商品名为CeriannaTM。该成像剂被设计用于复发性或转移性乳腺癌（BC）患者活检的辅助诊断17。使用18F-FES进行全身PET成像可作为一种无创方法，用于检测原发肿瘤以及难以获取活检样本的远端转移灶中的ERα表达水平18。利用18F-FES PET成像对ERα水平的预测与免疫组化（IHC）结果具有相关性，此外，若18F-FES PET成像显示几乎无法检测到ERα，则可可靠地预测该类肿瘤对激素治疗的反应可能性极低18。为确保18F-FES在临床中的合理使用，领域内专家已通过共识制定了相关使用指南19。在本研究中，我们评估了18F-FES PET在小鼠乳腺癌临床前模型中的应用。

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方案

所有动物实验均经奥斯汀医院动物伦理委员会批准（编号：A2023/05812），并遵循《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》进行。

1. 细胞准备

  1. 采用常规细胞培养方法，在T175组织培养瓶中用添加青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培养基维持MDA-MB-231和MCF-7细胞。在准备用于注射的细胞前，需将从液氮储存中复苏的细胞至少传代3次。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。
  2. 扩增细胞，使在准备注射细胞当天，每只小鼠每次注射需要3 × 106个MCF-7细胞，共15只小鼠（即至少45 × 106个MCF-7细胞），以及每只小鼠每次注射需要1 × 106个MDA-MB-231细胞，共5只小鼠（即至少5 × 106个MDA-MB-231细胞）。
    注意：为确保每只小鼠接种的细胞数量相等，应额外准备五次注射所需的细胞量（例如，若需为5只小鼠注射，则应准备10次注射所需的细胞）。
  3. 在细胞注射当天，移除所有培养瓶中的培养基，并向细胞中加入约5 mL含0.25%胰蛋白酶和0.05% EDTA的胰蛋白酶-EDTA溶液（溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4），以促进细胞脱落。
  4. 待细胞脱落后，向培养瓶中加入约10 mL完全培养基以抑制胰蛋白酶活性。重悬细胞后，将单细胞悬液转移至50 mL离心管中，在约300 × g条件下离心2分钟，使细胞沉淀。
  5. 用适量培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数以确定收获的总细胞数。
    注意：建议将细胞悬液调整至约1 × 106个细胞/mL（若使用计数板，则每16个方格中计数50–100个细胞）。对于每整瓶培养瓶可生长5 × 106个细胞的情况，可用5 mL培养基收获细胞；对于密度更高的细胞系，每瓶使用10 mL培养基。
  6. 此步骤应在冰上、无菌超净工作台中进行。达到所需细胞数量后，再次以300 × g离心2分钟，收集细胞沉淀。用预冷的PBS和冰冻的基底膜基质溶液重悬细胞沉淀，使每3 × 106个MCF-7细胞中含有40 µL PBS和10 µL基底膜基质溶液。
  7. 以相同组分重悬MDA-MB-231细胞沉淀，使每1 × 106个细胞中含有40 µL PBS和10 µL基底膜基质溶液。使用预冷的移液枪头将细胞-PBS-基底膜基质混合液从50 mL离心管转移至若干1.5 mL离心管中，并在注射入小鼠前始终保持细胞混合物置于冰上。
    注意：本研究使用的基底膜基质储存于-20 °C。在需要使用基底膜基质溶液的前一天，将一份分装样品转移至4 °C冰箱中过夜解冻。次日即可在低温（冰上）条件下使用。移液时，应确保所用枪头已预冷，以防止基底膜基质溶液凝固。建议在细胞准备前一日将一盒无菌移液枪头置于冰箱中预冷。在用冰冻PBS和基底膜基质溶液重悬细胞沉淀时，应先加入PBS，再加入所需量的基底膜基质溶液。

2. 向卵巢切除小鼠注射细胞

  1. 让6至8周龄的雌性去卵巢BALB/c裸鼠在细胞注射前于动物饲养设施中适应至少1周。
    注意：本研究使用了年龄较大的12至14周龄小鼠。卵巢切除术可确保内源性雌二醇水平较低，并减少其与外源性激素的競爭 18F-FES 配体。根据所研究的模型不同，较年轻的雌性小鼠（例如 4-8 周龄）由于内源性雌二醇水平较低，可能无需进行卵巢切除术。20,21.
  2. 使用4%异氟烷和4 L/min流速的氧气，通过麻醉诱导舱对小鼠进行麻醉诱导。观察小鼠并检测其翻正反射是否消失。当小鼠不再活动时，将其转移至无菌超净工作台，将鼻部置入鼻罩，并通过将异氟烷浓度调整至2%、氧气流速调整至2 L/min来维持麻醉状态。
    注意：每次仅麻醉一只小鼠，以确保最佳护理。
  3. 对于乳腺内脂肪垫（IMF）注射，用棉签擦拭第4对th 用酒精擦拭腹股沟乳腺组织。使用预先在冰上冷却的27 G注射器吸取冷细胞悬液，并将注射器置于冰上，以防止基底膜基质溶液在注射前升温或凝固。
  4. 用非惯用手的拇指和食指轻轻提起 4th 乳腺组织，用惯用手插入27 G注射器针头，确保针头斜面朝上。将含有细胞-PBS-基底膜基质溶液混合物的50 µL细胞悬液缓慢注射至乳腺脂肪垫中。
    注意：注射细胞时，手指间应能感觉到气泡。检查注射部位是否有泄漏。
  5. 注射完成后，关闭异氟烷，使小鼠鼻部仍置于鼻罩中吸入氧气并恢复意识（此过程约需一分钟）。将小鼠放回饲养笼，并置于加热垫上以促进最佳恢复。
  6. 对于肩关节注射，采用上述针对 IMF 注射所述的步骤，唯一区别在于细胞注射的部位。
    注：也可在无麻醉的情况下完成肩关节注射（见下文步骤 2.7）。
  7. 对于无需麻醉的小鼠肩部注射，用非优势手的拇指和食指捏起并提起小鼠肩部皮肤，使皮肤形成一个“帐篷”状。使用27 G针头的注射器，缓慢注入50 µL含有细胞-PBS-基底膜基质溶液的细胞悬液。轻柔拔出针头，并检查是否有渗漏。
    注意：作为替代方案，可使用 Hamilton 注射器进行小体积注射，以确保递送体积的准确性。在使用不同细胞系之间，应以 80% v/v 乙醇冲洗注射器，注射前后则用 PBS 冲洗，以去除注射器中残留的乙醇。

3. 雌二醇溶液的制备

  1. 使用能够精确测量物质毫克量的天平，将 7 mg 雌二醇粉末称量至一个 1.5 mL 离心管中。
  2. 向含有 7 mg 雌二醇粉末的离心管中加入 700 µL 100% 乙醇。将 1.5 mL 离心管置于温和振荡器上，在室温（RT）下振荡约 1 小时，或直至雌二醇粉末完全溶解。
  3. 将溶液分装至十个 1.5 mL 离心管中，每管含 70 µL 乙醇-雌二醇溶液。将离心管置于 -20 °C 保存以备后续使用。
    注意：雌二醇-乙醇储备液在 -20 °C 下可保存约 2 周。

4. 皮下注射雌二醇溶液

  1. 在需要注射雌二醇的当天，新鲜配制以下混合液。将630 µL玉米油作为溶剂加入含有70 µL乙醇-雌二醇溶液的1.5 mL离心管中。涡旋振荡溶液至均匀，确保乙醇不会分层并在溶剂油上方形成液层。
    注意：此操作可得到700 µL的20 µg/20 µL玉米油:乙醇（9:1）溶液。每只小鼠接受20 µL该溶液。务必多配制一些溶液，因为由于混合液的黏性，部分油会黏附在注射器外壁及1.5 mL离心管内壁（例如，若需处理20只小鼠，理论上400 µL已足够，但实际配制近两倍量（700 µL）可为操作误差留出余地）。
  2. 使用连接胰岛素注射器的29 G针头，缓慢吸取20 µL雌二醇溶液。
    注意：由于该溶液中油与雌二醇-乙醇的比例为9:1，因此吸入注射器的过程需要一定时间。
  3. 需注射雌二醇溶液的小鼠为携带表达ERα肿瘤的小鼠，此类肿瘤依赖雌激素生长（本研究中为MCF-7）。携带不表达ERα肿瘤的小鼠（本研究中为MDA-MB-231）不接受雌二醇溶液。将待注射小鼠轻轻置于前方，最好放在毛巾上，以防止固定时损伤其四肢。
  4. 用非优势手固定小鼠，将尾部上段夹在无名指与小指之间，用拇指和食指提起小鼠颈部附近的松弛皮肤，形成皮肤“帐篷”，以便进行雌二醇溶液的皮下注射。
  5. 在保持小鼠固定的同时，用优势手将雌二醇溶液注入小鼠体内。针尖斜面朝上，将针头推入皮肤“帐篷”下方，直至针头可见部分少于一半。
    注意：注射过程中，皮肤应明显隆起呈气球状。
  6. 为防止溶液回流，拔针前将针头在皮下停留数秒。若发生回流，可用纸巾轻轻拍干局部，去除残留溶液。
    注意：在某些实验中曾使用芝麻油混合雌二醇进行激素给药。以芝麻油作为溶剂会导致雌二醇注射部位皮下出现局部炎症。因此，在后续实验中选用玉米油作为溶剂，此时雌二醇注射部位未见或仅有轻微炎症表现22。详见讨论部分。
  7. 拔出针头后，用棉签蘸取外用消毒剂轻轻擦拭注射部位，以预防因针头穿刺皮肤所致注射部位表面发生炎症。
  8. 对携带表达ERα肿瘤（MCF-7）的小鼠，在细胞接种前3天开始皮下注射雌二醇，之后每周注射5次，持续5周（图1）。成像前2天停止雌二醇注射，以避免其与18F-FES探针竞争结合靶点ERα。
    注意：本研究中，携带MCF-7肿瘤的小鼠从周一至周五每日注射雌二醇。若计划于下一周的周三进行成像，则周六和周日继续注射雌二醇，而在成像前的周一和周二不再给予雌二醇。

5. 卵巢切除小鼠的18F-FES PET 与 MRI 成像

警告：操作放射性物质时需使用防护设备。操作放射性物质时应遵守所有适用的监管程序。

  1. 称量小鼠并记录其体重。
  2. 本研究中， 18F-FES 是 合成并以临床级标准配制23（来自奥斯汀健康分子影像与治疗科），用于动物模型。稀释 18F-FES（放射性半衰期109分钟）溶于10% w/v乙醇-生理盐水溶液中，校正衰变后的注射浓度约为150-300 µCi/100 µL。
    注意：1000 Ci/mmol 的比活度足以满足要求 体内 ERα的PET成像24，以及 18F-FES 的放射性比活度高于该基线值。
  3. 用带有29 G针头的胰岛素注射器抽取100 µL。使用活度计测量并记录放射性活度剂量及时间。将注射器置于铅屏蔽后，直至注射时使用。
    注意：测量物质的量 18使用活度计测量每剂次 F-FES 的放射性活度。活度计应根据制造商的方案，使用标准参考物质（如铯-137）进行校准。记录测量时间至关重要，以便进行衰变校正。确保活度计显示的时间与用于 PET 采集的计算机时间一致。
  4. 为进行静脉注射而扩张尾静脉，将小鼠置于距离热源30 cm处加热2分钟。注射前用70%（w/v）乙醇擦拭尾部以消毒。
  5. 注射 100 µL 的 18通过尾侧静脉以团注方式注射F-FES（注射器中的全部体积），并记录注射时间。用纱布按压注射部位以防止尾静脉出血。
  6. 使用剂量校准仪测量注射器中剩余剂量及组织的放射性活度，记录测量值及测量时间。将小鼠分批交错注射，每批两只，以便使用多室成像系统进行成像。
    注意：部分探针会残留在注射器中。建议使用胰岛素注射器，而非通过鲁尔锁（Luer lock）连接针头的注射器，因为前者在注射后滞留在注射器/针头中的剂量体积更小。此外，需测量用于按压以止住静脉注射探针后可能发生的出血所用组织中的放射性。这是因为被组织吸收的回流血液中可能含有部分放射性物质 18F-FES。此外，加热小鼠侧尾静脉所需的时间取决于热源强度及其与小鼠的距离等因素。使用标准加热灯时，静脉扩张可能需要长达15分钟。必须密切监测小鼠是否出现过热迹象，并在必要时于注射间隙将其移离热源。
  7. 对于分配至注射后睡眠组的小鼠，将注射后的小鼠置于麻醉舱内，在加热垫上维持异氟烷（2%–2.5%）和氧气（2 L/min）麻醉1小时，使探针通过小鼠全身循环分布，随后进行PET扫描。同一组中的其他小鼠在PET扫描前自由活动于笼中1–1.5小时。
  8. 麻醉1-1.5小时后，将小鼠置于带鼻罩异氟烷麻醉系统的成像室中。开启床体加热器至32 °C，选择多腔室设置并启动呼吸监测系统。将两只待成像小鼠呈俯卧位放置。将成像室放入PET/MRI仪器中。
  9. 在整个图像采集过程中监测小鼠的呼吸。使用呼吸监测图表确保扫描期间任意时刻的呼吸频率维持在每分钟60–80次。若呼吸频率低于或高于目标范围，应根据需要调整异氟烷剂量。
    注意：由于成像室中装有传感器，可对动物的呼吸进行监测。
  10. 将一次15分钟静态PET采集与梯度回波（GRE）三维轴向MRI扫描配对。采集参数详见下文：
    1. 要设置 PET 方案，打开 放射性药物编辑器 在相关软件中设置窗口。指定所用的同位素、注射器活度（MBq）、注射时间、施用活度（MBq）以及体重。所有这些参数对于计算和量化探针在目标组织中的摄取至关重要。
    2. 为确保小鼠成像时位置正确，使用二维Scout序列（前后相）确定PET视野。随后在400–600 keV能量窗、符合模式1-5、5 ns条件下进行15分钟静态PET采集。之后进行约27分钟的GRE3D轴向MRI扫描。
  11. 使用相关软件对采集的图像进行重建。
    1. 对PET/MRI图像进行静态重建，并使用几何规划器调整重建区域，确保覆盖小鼠全身，以实现最佳重建时间。
    2. 在……之下 结果鉴定 窗口，切换 随机校正, 衰减校正（AC）+ 散射，位置范围 到 开启. 设置 衰变参考时间 到 管理员. 设置 体-气阈值 降至30%，并基于材料图进行衰减校正。
  12. 使用相关软件对多腔室图像进行分割、配准以及绘制感兴趣区域（ROIs）。进行图像配准时，将MRI重新对齐以匹配PET，并重建PET图像。
  13. 要分离多腔室图像，请单击 图像处理 > 分割 > 酒店分隔器开启 科学模式 根据需要调整阈值和体积参数，直至找到两个对象。
  14. 输入注射时的剂量，并扣除注射器中残留的剂量，以将PET数据转换为每克组织百分注射剂量（%ID/g）单位；或额外输入受试者的体重，以将PET数据转换为标准化摄取值（SUV）单位。该转换可通过右键点击PET数据集，并在%ID/g字段处进行设置完成 基本信息 输入之前记录的 %ID/g。
  15. 在肿瘤切片上绘制感兴趣区域（ROI）时，单击 测量 程序窗口左侧的选项卡。使用该选项绘制感兴趣区域（ROI） 多边形 或 徒手 工具。仔细沿肿瘤的周缘进行勾画，确保操作时正处在 PET 图像的活动窗口中（通过以下方式确认 Fn-A结果以 %ID/g 表示 ROI 的值。
    注意：ROI 分析可对 %ID/g 提供良好的估算。使用校准良好的相机，其准确度应与实际值相比在 ±5% 范围内 离体 生物分布数据

6. 用于免疫组织化学的肿瘤组织收获与固定

  1. 在实验终点，通过吸入4%-5%异氟烷或过量吸入CO2对小鼠实施安乐死。
  2. 使用手术剪和镊子，在肿瘤表面附近小心地做一小切口，并切除肿瘤组织。若皮肤与肿瘤组织粘连，可用手术刀片轻轻将皮肤与肿瘤分离。
  3. 将肿瘤组织置于含有约3 mL 10%中性缓冲福尔马林的5 mL样品瓶中。确保组织完全浸没于溶液中，以促进组织固定。将组织在福尔马林中浸泡24小时。
  4. 次日，将固定的肿瘤组织转移至含有70%乙醇的5 mL样品瓶中。标记一个专用于该肿瘤组织的组织包埋盒，以备进行石蜡包埋。
  5. 将肿瘤组织放入组织包埋盒中，并将其保存在70%乙醇溶液中，直至进行石蜡包埋。
    注：本研究中，石蜡包埋由Austin Health的解剖病理学家完成。

7. 免疫组织化学法检测雌激素受体α（ERα）

  1. 使用切片机按照标准操作程序，将用于染色的肿瘤组织切成 4 µm 厚的切片。
  2. 将带有切片肿瘤组织的载玻片放入玻片架中，并将玻片架置于 37 °C 烘箱内过夜干燥，以确保组织在染色前牢固附着于载玻片上。
  3. 次日早晨，将装有切片肿瘤组织的玻片架放入 60 °C 烘箱中加热 30 分钟，以促进脱蜡过程。
    注意：烘烤时载玻片应朝上放置。这有助于组织附着，并确保熔化的石蜡滴落在同一张载玻片上，而非邻近的玻片上。
  4. 为使切片复水，将烘烤后的切片依次浸入二甲苯中两次，每次 5 分钟（2×5 分钟），再浸入 100% 乙醇中 2×5 分钟，然后浸入 70% 乙醇中 1×5 分钟。最后用蒸馏水清洗玻片 5 分钟。
  5. 进行抗原修复时，将玻片浸入盛有 1×EDTA 缓冲液（pH 8）的容器中，在 100 °C 水浴中孵育 25–30 分钟。取出玻片后，于室温下静置至少 1 小时。待玻片冷却后，用流动自来水冲洗 2 分钟，再用 TBST（含 0.01% Tween20 的 TBS）清洗 2×5 分钟。
  6. 使用疏水屏障笔在玻片上的组织切片周围画一个圆圈。
  7. 每张切片上加入约 100 µL 的 3% H2O2 溶液（用蒸馏水稀释），室温孵育 10 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。随后用流动自来水冲洗 2 分钟，再用 TBST 清洗 2×5 分钟。
  8. 每张切片加入约 100 µL 封闭缓冲液（含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST），室温封闭 30 分钟。
  9. 轻轻甩动玻片，将多余封闭液排入孵育盘中。每张切片加入约 100 µL 一抗（兔源抗人 ERα 抗体），按 1:300 稀释（或根据所用抗体预先优化的稀释比例），用含 1% BSA 的 TBST 配制抗体稀释液，并将玻片置于 4 °C 过夜孵育。
    注意：孵育盘底部应加入适量水，以防止切片在过夜孵育过程中干燥。
  10. 次日早晨，用 TBST 清洗玻片 3×5 分钟。每张切片加入约 100 µL 抗兔二抗，室温孵育 45 分钟。再次用 TBST 清洗玻片 3×5 分钟。
  11. 在通风橱中，每张切片加入约 100 µL 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）试剂，反应时间约为每张切片 3 分钟。用流动自来水冲洗 10 分钟以终止 DAB 反应。
  12. 用苏木精对玻片进行复染 1 分钟，用流动自来水冲洗 2 分钟。将玻片浸入 Scott 水中 1 分钟，再用流动自来水冲洗 2 分钟。
  13. 为脱水，将切片依次浸入 70% 乙醇中 2 分钟，100% 乙醇中 2×2 分钟，最后浸入二甲苯中 2×2 分钟。
  14. 在通风橱中，小心使用邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯二甲苯（DPX）封片剂封片，并盖上盖玻片，确保目标组织区域无气泡产生。将玻片在通风橱中过夜干燥。
  15. 次日，使用玻片扫描仪采集图像并观察染色结果。

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结果

为了确定在何种位置可通过18F-FES PET 清晰显示 ERα 阳性肿瘤，本研究使用了三组卵巢切除小鼠（图 1）。两组小鼠分别在乳腺脂肪垫（IMF）或肩部注射 MCF-7 细胞——一种 ERα 阳性的乳腺癌细胞系。作为阴性对照，另一组小鼠注射了 MDA-MB-231 细胞，这是一种常用的三阴性乳腺癌细胞系，不表达 ERα（图 1）。本研究工作流程示意图展示了通过皮下注射雌二醇以促进雌激素依赖性肿瘤生长的策略。在所有模型中，细胞接种后 4 至 5 周内，肿瘤体积均达到约 100 mm3（图 1 和 图 2）。在卵巢切除小鼠肩部生长的 MCF-7 肿瘤比原位生长的肿瘤需要更长时间建立（分别为 30 天和 20 天）（图 2）。MDA-MB-231 肿瘤在 IMF 注射后平均需 30 天建立。

...

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讨论

在此，我们描述了其用途 18F-FES PET/MRI 在检测由 ERα 表达表征的乳腺肿瘤中的应用。例如，我们展示了一个可观察到 ERα 阳性肿瘤的位置，即小鼠肩部——这些肿瘤可通过以下方法被清晰识别 18F-FES 摄取，相较于位于 4 内的肿瘤th 腹股沟乳腺脂肪垫（图4). 18F-FES 摄取在 MDA-MB-231 肿瘤中不可见，证实其缺乏 ERα 表达，该结果与免疫组织化学检测结果一致图4 和 图5).

由于排泄模式 18F-FES 通过肝胆系统和肠道排泄，这使得准确检测其摄取变得困难 18小鼠腹股沟乳腺脂肪垫中的F-FES乳腺肿瘤25。这是因为小鼠这些腺体的解剖位置靠近其肝脏和消化道。尽管肿瘤在4th<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家乳腺癌基金会（IIRS-22-071）提供资助。我们感谢维多利亚州政府运营基础设施支持计划的支持。本研究还在固体靶材实验室开展，该实验室为澳大利亚核科学技术组织（ANSTO）、奥斯汀医院和癌症研究基金会（LICR）的合作项目，同时得到国家成像设施和维多利亚州政府的支持。作者感谢位于拉筹伯大学-ONJCRI节点的奥利维亚·纽顿-约翰癌症研究中心研究所（ONJCRI）的国家成像设施所提供的科学与技术协助，该设施属于国家协作研究基础设施战略（NCRIS）的能力平台。图1和图3使用BioRender绘制。

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材料

本文使用的材料清单
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2.5% 胰蛋白酶（10 倍浓缩液）Gibco15090-046
27 G × 13 mm 0.5 mL 胰岛素注射器TerumoSS*05M2713KA用于细胞注射
29 G × 13 mm 0.5 mL 胰岛素注射器TerumoSS*05M2913KA用于雌二醇注射
30% H2O2Chem-SupplyHA154用蒸馏水稀释成 3% 工作液
玉米油SigmaC8267
DAB 显色底物试剂盒Abcamab64238
Dako 抗兔 HRP，110 mLAligent-DakoK4003免疫组化二抗
DMEM/F-12 培养基Gibco11320033
剂量校准仪Capintec5130-3216
雌二醇 SigmaE2758
雌激素受体 α（D8H8）兔单克隆抗体Cell Signalling Technology#8644免疫组化一抗
FBSBovogenSFBS
加热装置（红外灯）Amcal12400用于尾静脉扩张
MatrigelCorning356225
多细胞四通道监测套件，用于三只或四只小鼠成像舱MedisoPR-MC900200用于监测小鼠呼吸
NanoScan PET/MRI 3T 系统MedisoPR-RD000000用于 PET/MRI 数据采集
PBS（1×）Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360免疫组化洗涤缓冲液
三只小鼠成像舱MedisoPR-MC407300用于 PET/MRI 数据采集

参考文献

  1. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  2. Ignatov, A., Eggemann, H., Burger, E., Ignatov, T. Patterns of breast cancer relapse in accordance to biological subtype. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (7), 1347-1355 (2018).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Gnant, M., Turner, N. C., Hernando, C. Managing a long and winding road: Estrogen receptor-positive breast cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 43, e390922(2023).
  5. Thomsen, C., Nielsen, S., Nielsen, B. S., Pedersen, S. H., Vyberg, M. Estrogen receptor-α quantification in breast cancer: Concordance between immunohistochemical assays and mRNA-in situ hybridization for ESR1 gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (5), 347-353 (2020).
  6. Shafi, S., et al. Integrating and validating automated digital imaging analysis of estrogen receptor immunohistochemistry in a fully digital workflow for clinical use. J Pathol Inform. 13, 100122(2022).
  7. Harvey, J. M., Clark, G. M., Osborne, C. K., Allred, D. C. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 17 (5), 1474-1474 (1999).
  8. Caruana, D., Wei, W., Martinez-Morilla, S., Rimm, D. L., Reisenbichler, E. S. Association between low estrogen receptor positive breast cancer and staining performance. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 5(2020).
  9. Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., Hastah, F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol. 120 (1), 86-92 (2003).
  10. Hammond, M. E. H., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Allison, K. H., et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: ASCO/CAP guideline update. J Clin Oncol. 38 (12), 1346-1366 (2020).
  12. Amir, E., et al. Tissue confirmation of disease recurrence in breast cancer patients: Pooled analysis of multi-centre, multi-disciplinary prospective studies. Cancer Treat Rev. 38 (6), 708-714 (2012).
  13. Cardoso, F., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L., Costa, A., Castiglione, M. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 (Suppl 5), v15-v19 (2010).
  14. Cardoso, F., et al. 5th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 5). Ann Oncol. 31 (12), 1623-1649 (2020).
  15. James, W. F., et al. Recommendations on the use of 18F-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 49 (3), 480-508 (2008).
  16. Pedersen, M. A., et al. Dynamic whole-body [18F]FES PET/CT increases lesion visibility in patients with metastatic breast cancer. EJNMMI Res. 14 (1), 24(2024).
  17. Grabher, B. J. 18F-FES whole-body imaging protocol for evaluating tumor estrogen receptor status in patients with recurrent or metastatic breast cancer. J Nucl Med Technol. 51 (3), 188-193 (2023).
  18. Van Kruchten, M., et al. PET imaging of estrogen receptors as a diagnostic tool for breast cancer patients presenting with a clinical dilemma. J Nucl Med. 53 (2), 182-190 (2012).
  19. Ulaner, G. A., et al. Summary: Appropriate use criteria for estrogen receptor-targeted pet imaging with 16α-18F-fluoro-17β-fluoroestradiol. J Nucl Med. 64 (3), 351-354 (2023).
  20. He, S., Wang, M., Zhang, Y., Luo, J., Zhang, Y. Monitoring the early response of fulvestrant plus tanshinone IIA combination therapy to estrogen receptor-positive breast cancer by longitudinal 18F-FES PET/CT. Contrast Media Mol Imaging. 2019 (1), 2374565(2019).
  21. Joseph, J. D., et al. The selective estrogen receptor downregulator GDC-0810 is efficacious in diverse models of ER+ breast cancer. eLife. 5, e15828(2016).
  22. Alsina-Sanchis, E., et al. Intraperitoneal oil application causes local inflammation with depletion of resident peritoneal macrophages. Mol Cancer Res. 19 (2), 288-300 (2021).
  23. Sluka, P., et al. Characterization of an estrogen receptor α-selective 18F-estradiol PET tracer. World J Nucl Med. 23 (03), 153-160 (2024).
  24. Katzenellenbogen, J. A. The quest for improving the management of breast cancer by functional imaging: The discovery and development of 16α-[18f]fluoroestradiol (fes), a pet radiotracer for the estrogen receptor, a historical review. Nucl Med Biol. 92, 24-37 (2021).
  25. Boers, J., et al. Image quality and interpretation of [18F]-FES-PET: Is there any effect of food intake. Diagnostics (Basel). 10 (10), 756(2020).
  26. Caceres, S., et al. Tumor growth progression in ectopic and orthotopic xenografts from inflammatory breast cancer cell lines. Vet Sci. 8 (9), 194(2021).
  27. Kumar, M., Salem, K., Jeffery, J. J., Fowler, A. M. PET Imaging of Estrogen Receptors Using 18F-Based Radioligands. Estrogen Receptors. , Springer US. New York, NY. (2022).
  28. Zhang, W., et al. Comparative study of subcutaneous and orthotopic mouse models of prostate cancer: Vascular perfusion, vasculature density, hypoxic burden and BB2r-targeting efficacy. Sci Rep. 9 (1), 11117(2019).
  29. Lee, A. V., Oesterreich, S., Davidson, N. E. MCF-7 cells-changing the course of breast cancer research and care for 45 years. J Natl Cancer Inst. 107 (7), djv073(2015).
  30. Pedram, H., et al. 18F-fluoroestradiol PET guides dosing of selective estrogen receptor degraders. J Nucl Med. 55 (supplement 1), 11(2014).
  31. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice. Gen Comp Endocrinol. 175 (1), 188-193 (2012).
  32. Luengo-Mateos, M., et al. Protocol for ovariectomy and estradiol replacement in mice. STAR Protoc. 5 (1), 102910(2024).
  33. Yang, Z., et al. High specific activity is not optimal: 18F-fluoroestradio positron emission tomography-computed tomography results in a breast cancer xenograft. J Labelled Comp Radiopharm. 59 (13), 576-581 (2016).
  34. Aliaga, A., et al. Breast cancer models to study the expression of estrogen receptors with small animal PET imaging. Nucl Med Biol. 31 (6), 761-770 (2004).
  35. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. -M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: A visual demonstration. J Vis Exp. 64, e4013(2012).
  36. Pisaneschi, F., et al. Automated, resin-based method to enhance the specific activity of fluorine-18 clicked PET radiotracers. Bioconjug Chem. 28 (2), 583-589 (2017).
  37. Johannes, N., et al. Variation of specific activities of 68Ga-aquibeprin and 68Ga-avebetrin enables selective PET imaging of different expression levels of integrins α5β1 and αvβ3. J Nucl Med. 57 (10), 1618-1624 (2016).
  38. Liu, C., Ma, G., Xu, X., Song, S., Yang, Z. Can 18F-FES PET improve the evaluation of 18F-FDG PET in patients with metastatic invasive lobular carcinoma. Clin Nucl Med. 49 (4), 301-307 (2024).
  39. Heidari, P., et al. Pharmacodynamic imaging guides dosing of a selective estrogen receptor degrader. Clin Cancer Res. 21 (6), 1340-1347 (2015).
  40. Roswall, P., et al. Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. Nat Med. 24 (4), 463-473 (2018).

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