方法文章

用于小细胞外囊泡中微小RNA的超灵敏cDNA文库构建及下一代测序

DOI：

10.3791/67154

⸱

2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外囊泡（EVs）含有可调控受体细胞的细胞特异性miRNA，鉴定这些miRNA有助于揭示其功能及作为生物标志物的作用。我们优化的cDNA文库构建方案引入了独特的条形码，可在使用双端双索引条形码以兼容Illumina测序仪的同时，实现样本多重检测以及对低起始量EVs的高效处理。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近期研究表明，存在于所有生物体液中的小型细胞外囊泡（sEVs）通过传递蛋白质、DNA和RNA，在细胞间通讯中发挥关键作用。包裹在sEVs中的微小RNA（miRNAs）已被确认为受体细胞中重要的可传递调控因子。由于正常细胞与病变细胞分泌的sEVs携带不同的miRNA cargo，近期关于sEV-miRNA谱型的研究提示，它们可能有助于发现新的循环生物标志物。然而，从多种生物体液中分离出的细胞/疾病特异性sEVs所提供的miRNA数量通常较低，使用传统的光谱学方法一般难以准确定量。小非编码RNA的下一代测序技术（NGS）可通过扩增克隆的miRNA序列，为评估sEVs中的miRNA cargo提供了有力手段。但遗憾的是，商用的cDNA文库构建流程通常所需的RNA投入量远高于从分离sEVs中所能获得的不可定量水平。

因此，考虑到我们现有的cDNA文库构建方法（即最初为低起始量、高度降解的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA分析而优化的方法）具有良好的稳健性和多重检测能力，我们旨在评估其在sEV miRNA分析中的适用性。重要的是，鉴于近期测序芯片在技术上的聚类性能提升，我们尝试将转录本条形码策略整合到一种支持双端测序且兼容双索引的cDNA文库构建流程中，以增强测序和多重检测能力。我们利用从8.4 × 109个sEV中提取的RNA进行16次重复实验，并结合sEV数量从1010个逐步降低至低至2.5 × 107个的样本，系统评估了该方法的重复性和灵敏度。结果表明，使用16种3'端腺苷酸化的DNA条形码，仅需低至3.15 pg的总小非编码RNA或1.35 pg的miRNA，即可在重复实验中实现sEV-miRNA谱的高重复性和高灵敏度检测。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小细胞外囊泡（sEVs）是一类纳米级（直径约30-200 nm）的细胞来源颗粒，由源自其母细胞的磷脂双分子层膜包裹，能够有效保护其内部的分子 cargo1,2。目前公认几乎所有细胞都会产生并释放sEVs至细胞间环境，且可在大多数生物液体（如血液、尿液、唾液等）中被检测到2,3,4。近期研究表明，sEVs内部稳定包裹的分子 cargo（如 DNA、RNA、蛋白质、脂质等）5,6,7 在与靶细胞接触或被递送至靶细胞后，可介导细胞间的通讯8。当前的研究重点在于改进从多种生物液体中分离细胞特异性sEVs的方法，以精确识别和监测这些分子 cargo9,10。鉴于sEVs含有小非编码RNA，尤其是微小RNA（miRNAs），且这些miRNAs在递送至细胞后仍保持其调控功能，大量研究致力于评估miRNAs作为生物标志物的潜力，以反映其来源细胞的状态11,12,13。

MicroRNAs (miRNAs) 是一类庞大的小分子非编码 RNA（在人类中已知约有 2,000 种），其长度介于 19 至 25 个核苷酸（nt）之间，可结合于靶 mRNA 的 3' 非翻译区中不完全互补的位点，从而引导这些靶标发生降解和/或转录后抑制14,15。 功能上，miRNAs 被证实可调控多种生物学过程，其表达失调与分子、生化及生理过程的异常相关，进而参与包括癌症在内的多种疾病的发生与发展16,17,18。重要的是，研究表明，病变细胞尤其是癌细胞不仅在 miRNA 表达上与正常细胞存在差异18，而且其将 miRNA 包装进入 sEVs 的方式也有所不同19,20。

尽管已有若干研究致力于揭示正常细胞与病变细胞中调控小细胞外囊泡（sEVs）装载的分子过程与通路19,21,22，目前生物标志物研究集中于识别由特定病变/癌细胞通过sEVs包装并分泌的可区分的小非编码RNA和/或miRNA特征。因此，从多种人体生物液体中靶向分离病变细胞特异性的sEVs，并分析其多组学分子 cargo，可能有助于开发用于无创检测多种人类疾病和癌症的诊断与预后检测方法23,24,25,26尽管sEV-miRNA是最受关注的非编码转录本，其他小非编码RNA种类（即miRNA异构体（isomiRs）、piwiRNA、转运RNA片段（tRFs）、rRNA、孤儿非编码RNA（oncRNAs）…）也正在被评估其作为循环sEV生物标志物的潜在用途，尤其侧重于不同癌症的检测27,28,29,30,31,32.

有利的是，在对小非编码RNA转录本（包括miRNA）进行条形码标记并构建cDNA文库后，采用高通量测序（NGS）分析方法，非常适合探索循环sEVs中所含的已知和/或未知的小非编码RNA种类，这些RNA可能与疾病相关27。事实上，sEV小RNA的NGS技术为发现细胞特异性的小非编码RNA转录本提供了一种高通量手段，而这些转录本若采用靶向特异性技术（如多重PCR、微阵列、定制化检测面板等）进行整体评估时可能无法被识别32,33,34。鉴于我们此前已优化了一种超灵敏且高度可重复的cDNA文库构建方案，该方案最初是为分析高度降解且浓度极低的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA而开发的35,36，我们尝试将其改进并应用于sEVs包封的小非编码RNA和miRNA的分析37,38,39,40。

随着Illumina HiSeq2500仪器的停用（该仪器曾多年为我们提供高质量的单端双索引sEV cargo miRNA分析37,40），我们着手探索在将现有方案适配于采用现行双端双索引化学方法的更新测序仪器时，其在重复性和灵敏度方面的表现。为了保留原始方案的多重分析能力，我们在将流程整合至双端双索引化学体系之前，继续沿用原有的16种条形码用于小RNA cDNA转录本的制备。仅使用一对i5和i7条形码，即可构建一个稳健的实验室cDNA文库，实现最多16个独立样本的同步处理与分析，从而提高低输入量sEV RNA分析的重复性。因此，本文介绍了利用从人血浆sEV中分离的极微量miRNA生成高重复性cDNA文库所必需的生化步骤、更新后的条形码、PCR引物与片段大小标记引物以及分离步骤。

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方案

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1. 所有试剂和寡核苷酸的制备方法如下：

注意：本方案中使用的所有核苷酸均在图1和补充文件1中详细列出，其浓度适用于本方案的实施。引物序列见补充文件2。

  1. 配制校准品混合液的储备液，该溶液将用于每个单独的连接反应中，作为不同酶促反应的对照：
    1. 使用无RNase的水将载体寡核苷酸（0.5 µM）（补充文件1）重新溶解。
    2. 将10种校准品（每种10 µL，补充文件1）混合至一个1.5 mL离心管中，得到100 µM的储备液，再用载体寡核苷酸稀释至0.0052 nM的工作浓度，并于-20 °C保存。
  2. 使用无核酸酶的水将17种不同的（16种实验用和1种测试条形码接头）腺苷化3'接头（图1A）分别重新溶解至50 µM的浓度。
    注：每种接头均分装为含2.5 µL的单次使用管，于-80 °C保存，最长可达2年，以避免大体积储备液反复冻融。
  3. 将不同的实验用RNA寡核苷酸（包括RNA提取载体（补充文件1）、RNA 3'连接载体（补充文件1）、RNA连接测试物（补充文件1）、3'连接（补充文件1；19 nt-3'接头和24 nt-3'接头）以及5'连接（补充文件1；5'接头-19 nt-3'接头和5'接头-24 nt-3'接头）的DNA大小标记物）重新溶解至250 ng/µL的浓度。
  4. 使用无核酸酶的水将HPLC纯化的5'接头稀释至100 µM（图1A）。
  5. 使用无核酸酶的水将RT及第一轮PCR的5'和3' RT/PCR引物重新溶解至100 µM（图1B）。
  6. 使用无核酸酶的水将第二轮PCR的5'和3' PCR i7和i5寡核苷酸重新溶解至100 µM（图1B）。
    注：将每种DNA引物分装为最多可供10次实验使用的量，并于-80 °C保存。
  7. 配制聚丙烯酰胺变性（PAA）凝胶上样缓冲液，混匀后分装为每管1 mL，于-80 °C保存。
    1. 通过将18.6 g Na2H2 EDTA加入50 mL无核酸酶水中配制0.5 M Na2H2 EDTA溶液。缓慢加入NaOH颗粒调节上述Na2H2 EDTA溶液的pH至8.0，再用ddH2O定容至100 mL，得到0.5 M Na2H2 EDTA（pH 8.0）储备液。
    2. 称取15 mg溴酚蓝至15 mL离心管中，用600 µL无核酸酶水重悬粉末，加入14.25 mL去离子甲酰胺。最后加入150 µL 0.5 M Na2H2 EDTA（pH 8.0）溶液。将最终的PAA溶液分装至1 mL离心管中，于-80 °C保存。
    3. 配制5×琼脂糖凝胶上样缓冲液。
      1. 称取1.86 g Na2H2-EDTA溶于50 mL无RNase水中，加入NaOH颗粒调节pH至8.0，再用无RNase水定容至100 mL，得到50 mM Na2H2 EDTA溶液。
      2. 向5 mL 50 mM Na2H2 EDTA溶液中加入20 mg溴酚蓝、20 mg二甲苯青FF和2 g Ficoll type-400。涡旋混匀含有三种染料的离心管，再加入5 mL 50 mM Na2H2 EDTA溶液。将5×琼脂糖凝胶上样缓冲液分装为每管1 mL，于-80 °C保存。

2. 外泌体RNA样本的制备

  1. 分离sEVs后，使用透射电子显微镜（TEM；图2）评估其形态，使用纳米颗粒追踪分析（NTA；图3）测定其浓度，并使用超分辨率纳米成像（图4）或等效的sEV定量技术分析其表面蛋白分布。
  2. 将等量的sEVs分装至不同的离心管中，加入RNase-A（12.5 µg/mL），37 °C孵育1小时。
  3. 使用小RNA提取试剂盒从小RNA中启动小非编码RNA（包括miRNA）的提取，并开始RNA相分离。
  4. 分离RNA裂解缓冲液的下层水相，转移至新的离心管中，随后在进行柱纯化之前，向每个RNA样本中加入4 ng的RNA载体寡核苷酸（补充文件1），并按照制造商说明书操作。
  5. 将每个RNA样本用真空离心浓缩仪浓缩至9.5 µL，以启动cDNA文库构建流程。

3. 设置16个RNA样本和1个测试样本的3'条形码接头连接反应

  1. 鉴定16个独立的sEV-RNA样本，将每份样本分装至含9.5 µL无核酸酶水的1.5 mL硅化微量离心管中，并在开始实验前至少置于冰上10分钟。
  2. 实验前新鲜配制10倍RNA连接酶缓冲液（不含ATP）。
    1. 在1.5 mL硅化管中，加入343 µL无核酸酶的双蒸水（ddH₂O）、50 µL 10×RNA提取缓冲液、10 µL 10% SDS、5 µL 2-巯基乙醇，混匀。2O)，500 µL 1 M Tris（pH 7.5），100 µL 1 M MgCl2，50 µL 20 mg/mL 牛血清白蛋白，以及 7 µL 14 M 2-巯基乙醇。
    2. 轻弹管壁混匀溶液，在2,000 × g条件下离心2秒 g 在室温（RT）下使用台式离心机离心，然后置于冰上。
      注意：所有描述以下操作的步骤均需 "离心2秒" 均在室温下使用微量离心机进行，转速不超过 2,000 × g.
  3. 将0.0052 nM校准品混合液置于冰上10分钟以解冻。
  4. 在1.8 mL硅化离心管中配制连接反应主混合液，用于18个反应，加入40 µL 10× RNA连接酶缓冲液、10 µL 0.0052 nM校准品混合液和40 µL无核酸酶的ddH₂O2O.
  5. 轻弹并旋转1.5 mL离心管，然后置于冰上。
  6. 向16个单独分装的sEV RNA样本中的每一个加入4.5 µL连接反应主混合液，以及含有100 ng RNA连接测试寡核苷酸的测试连接反应补充文件 1) 之前已分装，每份体积为9.5 µL。轻轻振荡混匀，离心后立即放回冰上。
  7. 将16个样本和测试反应液转移至预热至90 °C的金属浴中孵育1分钟，随后立即放回冰上。
  8. 将4 µL 50% PEG分别加入各管中，轻轻振荡混匀，离心后放回冰上。
  9. 从17种3'端带条形码的接头（16种实验接头（#1至#16）和1种测试接头（#17））中各取2.5 µL分装样品，解冻后置于冰上。
  10. 将17种接头各自取1 µL分别加入对应的16个含sEV-RNA的样本及1个测试样本中，每个样本同时加入连接主混合液（即4.5 µL）和50% PEG（即4 µL）。
    注意：所有溶液和反应均通过轻弹管壁并短暂离心混匀，而非反复吹打溶液，以防止样品损失。
  11. 在新的1.5 mL硅化管中，加入10 µL T4 RNA连接酶2截短型K227Q与10 µL无核酸酶的ddH2O，配制稀释的连接反应酶液。
  12. 将1 µL稀释后的T4 RNA连接酶2截短型K227Q连接酶转移至每个17个试管中（16个实验样本和1个测试RNA样本）。不要反复吹打，每更换一个试管均需更换枪头，保持试管置于冰上，轻弹混匀，离心后立即放回冰上。
  13. 将连接反应体系置于冷室中冰桶内的试管架上，放在新鲜冰上过夜，孵育时间最长可达18小时。

4. 通过PAGE分离连接了3'接头的小RNA

  1. 将17个离心管置于90 °C的加热块上1分钟，以灭活T4 RNA连接酶2，随后置于冰上冷却2分钟。
  2. 取1 µL GlycoBlue和26 µL 5 M无核酸酶的NaCl加入一个新离心管中，混匀后将1.2 µL该沉淀溶液分别加入17个离心管中。
  3. 向17个离心管中各加入63 µL 100%乙醇，盖紧管盖，轻轻弹动混匀，短暂离心2秒后放回冰上。
  4. 将16个sEV RNA样品管中的内容物合并至一个1.5 mL硅化离心管中，测试RNA连接反应管则单独保留。
  5. 将合并后的样品管轻轻颠倒3次以混匀，短暂离心2秒，置于冰上60分钟以促进沉淀。
  6. 按以下步骤制备一块大尺寸（16 × 20 cm2）的15%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）：
    1. 使用硅化液对长短玻璃板进行硅化处理，并与0.1 cm间隔条一起组装。
    2. 在50 mL锥形管中混合9 mL系统稀释液、18 mL系统浓缩液、3 mL系统缓冲液、240 µL过硫酸铵（APS，9%）和12 µL TEMED，配制15% PAGE凝胶溶液。
    3. 用30 mL移液器迅速将溶液注入玻璃板之间，在凝胶聚合前插入14孔梳子（厚度0.1 cm），室温直立静置30分钟使其完全聚合。
  7. 从冰上取出合并的RNA样品管，在4 °C下以16,000 × g离心60分钟。
  8. 在此期间，完成15% PAGE凝胶的准备工作：轻轻拔出梳子，用装有无核酸酶H2O的洗瓶冲洗加样孔，并在水槽上方清洁，干燥后将凝胶安装至电泳装置中，上下槽均加入0.5× Tris-硼酸-EDTA（TBE）溶液，并在上样前以450 V预电泳30分钟。
  9. 从离心机中取出离心管（步骤4.6），使用连接真空系统的巴斯德吸管（末端配有10 µL无滤芯吸头）小心吸干RNA沉淀，避免扰动沉淀。
  10. 将含有16个RNA连接产物的沉淀重悬于20 µL无核酸酶的ddH2O中，加入20 µL聚丙烯酰胺凝胶上样液。轻轻弹动混匀，短暂离心2秒后置于冰上。
  11. 将电泳装置中的0.5× TBE缓冲液更换为新鲜缓冲液。
  12. 准备一个含20 bp RNA分子量标记的离心管，两个分别含有两种3'-连接短DNA分子量标记的离心管（补充文件1），以及一个含有RNA连接测试寡核苷酸（即与条形码接头#17连接的产物）的离心管。
  13. 向各离心管（即分子量标记、3'连接短DNA寡核苷酸和RNA连接测试样品）中各加入20 µL聚丙烯酰胺凝胶上样液。
  14. 将16个连接后的RNA样品管和1个RNA连接测试管在90 °C孵育1分钟，随后放回冰上。
  15. 更换电泳装置上下槽中的0.5× TBE缓冲液（即在加样孔液面以下加缓冲液，防止上样时孔间交叉污染），将分子量标记加样于凝胶两端，RNA连接测试样品和两个短DNA分子量标记分别加样于中间孔的两侧，中间孔用于加载合并的16个3'条形码RNA连接产物（见图5）。
  16. 在冷却条件下（即用风扇对玻璃板吹风），以450 V（约35 mA）恒压电泳90分钟，运行15% PAGE凝胶。
  17. 将15% PAGE凝胶从玻璃板中取出，用SYBR Gold染色液（10 µL SYBR Gold溶于25 mL 0.5× TBE中）轻轻喷雾，避光倾斜静置5分钟。
  18. 将凝胶置于蓝光透射仪上（图5），使用尺子对齐19 nt和24 nt的3'接头大小标记短DNA寡核苷酸，切下含有连接miRNA构建体的凝胶区域（图6展示了3'连接及最终构建产物）。同时，单独切下RNA连接测试样品的上条带，用于次日的5'连接测试。
  19. 将两块分别切下的凝胶（即16个RNA样品和测试连接产物）分别放入置于1.5 mL硅化管中的两个0.5 mL凝胶破碎管中，在室温下以16,000 × g离心3分钟，随后分别加入300 µL 400 mM NaCl溶液重悬凝胶碎片，盖紧管盖并用封口膜密封。
  20. 将离心管置于摇床上，在4 °C以1,100 rpm振荡过夜（16–17小时）。

5. 连接5'接头

  1. 将两份独立的碎片化凝胶及其溶液（16个3'端带条形码的样本（条形码#1至#16）和3'端带条形码的测试RNA（条形码#17））分别转移至两个5 µm滤管中，每根滤管置于1.5 mL硅化管内，用封口膜密封，于2,300 × g离心5分钟 g 室温下
  2. 向每个滤液中加入950 µL 100%乙醇，盖紧管盖，倒置混匀，短暂离心2秒，用Parafilm封膜，置于冰上静置1小时。
  3. 新鲜配制50% DMSO水溶液：将1 mL无核酸酶水与1 mL DMSO混合，用铝箔包裹管子，避光、室温保存。
  4. 制备15%的PAGE胶，并按照第4.6节所述步骤进行预电泳。
  5. 将含有3'连接的16个RNA样本和测试RNA连接反应的离心管在16,000 × g 4 °C 下孵育 60 分钟以沉淀连接的 RNA。
  6. 小心移除上清液，避免触碰RNA沉淀，然后真空干燥。
  7. 重悬16个RNA样本及测试RNA的3'连接沉淀，每个样本使用8 µL无核酸酶的ddH₂O2O，避免上下吹打。轻轻振荡离心管以混匀，离心2秒（2,000 × g在室温下孵育，然后将试管置于冰上。
  8. 通过混合500 µL 1 M Tris（pH 7.5）、100 µL 1 M MgCl₂、50 µL 1 M DTT和100 µL 100 mM ATP，配制10x RNA连接酶缓冲液（含ATP）2，将50 µL 20 mg/mL乙酰化BSA、200 µL 10 mM ATP、7 µL 14 M 2-巯基乙醇和143 µL无RN酶水加入1.5 mL离心管中。
  9. 加入2 µL 10x RNA连接酶缓冲液（含ATP）、1 µL 100 µM 5'接头和4 µL 50%水溶性DMSO至各管中。轻弹混匀，室温离心2秒，随后将各管置于90 °C孵育1分钟以变性RNA，再放回冰上。
  10. 加入3 µL 50% DMSO，轻弹混匀，离心使液体沉至管底，向每管中加入3 µL T4 RNA连接酶，轻弹混匀，室温离心2 s，将各管置于37 °C摇床中反应75 min。
    注意：不要上下吹打。
  11. 制备20 nt DNA ladder和两个分别含有5'-连接长度标记长链DNA寡核苷酸的试管（补充文件 1；5'接头-19 nt-3'接头，以及5'接头-24 nt-3'接头），并向每个管中加入20 µL PAA。
  12. 5'接头连接完成后，向两次连接反应中各加入20 µL PAA（即.，16个RNA样本和测试RNA），轻轻弹击混匀，短暂离心后置于90 °C水浴1分钟，随后将试管放回冰上。
  13. 清空凝胶装置的上层和下层储液槽，并在上层储液槽的加样孔水平以下加入新鲜的0.5×TBE溶液。
  14. 在凝胶的一端上样 DNA 分子量标记，将 5' 连接的测试 RNA 样品以及两个尺寸标记用的长链 DNA 寡核苷酸（即 5' 接头-19 nt-3' 接头和 5' 接头-24 nt-3' 接头）加样至邻近即将加载 5' 连接的 16 个 RNA 样品的加样孔周围的位置图6 显示5'端连接及所得构建体）。在450伏电压下电泳90分钟。
  15. 运行结束后，将凝胶从装置和玻璃板中取出，喷洒SYBR Gold溶液（例如，10 µL SYBR Gold溶于25 mL 0.5x TBE中），避光静置5分钟。
  16. 使用5'接头-19 nt-3'接头和5'接头-24 nt-3'接头长度标记的长链DNA寡核苷酸作为大小参照，直接切下凝胶中包含5'连接的16个RNA样本的条带区域图7).
    注意：通过凝胶电泳检测测试性RNA连接效果，以证实5'接头的连接导致条带发生与大小标记物相对应的大小偏移。测试性RNA连接产物不从凝胶中切出；仅切出16个组合RNA样本的连接产物。
  17. 将含有16个连接RNA样品的凝胶条带转移至置于1.5 mL离心管中的0.5 mL凝胶破碎管内，于16,000 × g离心 g 在室温下孵育3分钟，然后加入300 µL 300 mM NaCl和1 µL 100 µM 3' RT/PCR引物（图1B) 加入到管内的碎胶中。
  18. 用封口膜密封试管，置于4 °C冷室中，以1,100 rpm转速振荡过夜（17–18 h）。

6. 条形码标记的5'和3'连接的小非编码RNA及miRNA的逆转录

  1. 将含有破碎凝胶的试管中的溶液用移液器转移至插入1.5 mL硅化无RNase离心管中的5 µm滤管中，短暂离心，使溶液通过滤膜。
  2. 向此滤过溶液中加入950 µL 100%乙醇，倒置混匀，离心2 s，然后置于冰上60 min。
  3. 在4 °C条件下，以16,000 × g 离心1 h，沉淀RNA沉淀物。
  4. 取出离心管，小心移除上清液，避免触碰沉淀，真空干燥沉淀，然后将其重悬于5.6 µL无核酸酶的H2O中。
  5. 在离心管中加入3 µL 5x第一链缓冲液、4.2 µL 10x dNTPs（每种2 mM）和1.5 µL二硫苏糖醇（DTT），配制逆转录反应体系。轻弹混匀，离心2 s。
  6. 将反应体系在90 °C精确孵育30 s，然后将离心管转移至50 °C金属块中孵育2 min。
  7. 向溶液中加入0.75 µL逆转录酶，启动逆转录反应，轻弹混匀，置于50 °C反应35 min。
  8. 将离心管转移至95 °C加热1 min以使酶和cDNA/RNA链变性，然后加入95 µL无RNase的H2O，轻弹混匀，置于冰上2 min。此离心管中含有来自16个RNA样本的cDNA，每个样本在3'端分别带有唯一条形码。

7. 进行检测性 PCR 及大规模扩增

  1. 通过将304 µL无核酸酶水与2O，125 µL 2 M KCl，50 µL 1 M Tris pH 8.0，10 µL 1 M MgCl2，将5 µL的1% Triton X-100和6 µL的1 M 2-巯基乙醇加入可置于冰上保存的离心管中。
  2. 将67 µL无核酸酶的H与第6.8步（上文）制备的cDNA混合，配制一个试点/测试性PCR反应体系2加入10 µL 10x PCR缓冲液、10 µL 10x dNTPs、0.5 µL 100 µM 5' PCR引物、0.5 µL 100 µM 3' PCR引物、10 µL cDNA文库原液和2 µL 50x Taq聚合酶至新的PCR管中。
    注意：在进行PCR扩增之前，需通过建立两个不同的程序文件来设置仪器，具体如下：文件1（File#1）：94 °C 变性45 s，50 °C 退火85 s，72 °C 延伸60 s，共12个循环，最后4 °C 保存；文件2（File#2）：94 °C 变性45 s，50 °C 退火85 s，72 °C 延伸60 s，共2个循环，最后4 °C 保存。
  3. 对于初步/测试性PCR反应，将含有100 µL PCR反应体系的PCR管放入PCR仪中，运行程序文件File#1。
  4. 文件1完成后，打开PCR管，将12 µL反应产物转移至含有3 µL 5x上样缓冲液的1.5 mL微量离心管中。盖紧管盖，并标记 "12 个循环" 在盖子上。
  5. 将PCR管放入热循环仪中，启动程序文件2。
  6. 当文件#2完成后，将12 µL PCR反应产物转移至含有3 µL 5x上样缓冲液的1.5 mL离心管中，并标记 "14 个循环" 在其盖子上。
  7. 再连续进行四次PCR扩增（即每次两个PCR循环），每次扩增结束后转移12 µL PCR产物，依次获得四个不同的试管，分别标记为16、18、20和22个循环。
  8. 加载20 nt大小的DNA标记以及各PCR扩增产物至2.5%琼脂糖凝胶中，在0.5×TBE缓冲液中以120 V电压电泳运行30分钟。
  9. 确定最佳PCR扩增循环次数图8A），依据引物二聚体（下方条带）与扩增的cDNA（上方条带）的存在情况及其比值。
    注意：考虑到16个样本的总RNA投入量可能低于1 ng，引物二聚体的扩增产物通常会比纯化的cDNA更快速且产量更高。因此，合适的PCR循环数通常选择在18至22个循环之间。 图8A，该文库的适宜PCR循环数为20。在 图8B，详细说明了PCR构建体的大小。
  10. 一旦确定了适当的PCR扩增循环数，设置一个阴性PCR对照（无cDNA）和四个100 µL的阳性PCR反应（即.，每份含有12 µL cDNA。
    1. 为简化PCR反应的配制，可预先配制PCR预混液（即., 用于4.5次反应）于1.5 mL离心管中，加入292.5 µL无核酸酶水2O，45 µL 10x PCR 缓冲液，45 µL 10x dNTPs，3.25 µL 3' RT/PCR 引物（图1B）以及 2.25 µL 的 5' PCR 引物（图1B将该离心管颠倒混匀，然后离心使液体聚集于管底。
    2. 将86 µL的PCR预混液分别转移至四个0.5 mL的PCR管中。
    3. 向4个PCR管中各加入12 µL cDNA文库（置于冰上保存），然后各加入2 µL 50x Titanium Taq聚合酶，用移液器吹打混匀。
    4. 通过向反应管中加入 77 µL 无核酸酶的 H₂O 来制备无模板 PCR 反应管2将10 µL 10x PCR缓冲液、10 µL 10x dNTPs、0.5 µL 5' PCR引物、0.5 µL 3' PCR引物和2 µL 50x Taq聚合酶加入一个独立的PCR管中，用移液器吹打混匀。
    5. 使用步骤7.9中确定的PCR循环程序，在热循环仪中设置PCR反应管，并根据需要在热循环仪中设置新的程序以进行扩增。
  11. 制备含溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶（使用0.5×TBE缓冲液），并将每管PCR产物各12 µL转移至含有3 µL 5×上样缓冲液的独立离心管中。
  12. 将3 µL的20 nt ladder与9 µL无核酸酶的H₂O混合，配制20 nt ladder2O 和 3 µL 上样缓冲液。
  13. 上样，120 V 电压下电泳 30 分钟，检查四个不同反应的 PCR 扩增产物量是否相近，并确认无模板对照组无扩增产物（空白）图8C).
  14. 将四份PCR反应液分别合并至两个1.5 mL硅化微量离心管中（即每管含90 µL产物），然后向每管中加入18 µL 5 M NaCl和800 µL 100%乙醇。
    1. 倒置试管以混匀，并于 -20 °C 保存过夜以沉淀。

8. PCR 扩增文库的纯化

  1. 将含有混合阳性PCR反应产物的两个离心管在4 °C条件下，以16,000 × g 离心60分钟。
  2. 60分钟后，弃去上清液，真空干燥DNA沉淀，并将其重悬于19.5 µL的1×缓冲液中，然后加入0.5 µL的PmeI酶。
  3. 在37 °C条件下孵育PmeI 消化反应2小时，以去除在相邻泳道中迁移的任何DNA大小标记物（即19 nt-3'接头、24 nt-3'接头）或RNA载体（即RNA提取载体、RNA 3'连接后载体）等潜在污染物（参见补充文件1中RNA和DNA引物所包含的PmeI酶切位点）。
  4. 将两个消化产物分别上样至2.5%琼脂糖凝胶的三个不同泳道中，使用0.5×TBE电泳缓冲液进行电泳，以避免引物二聚体在单一泳道中过度积累而形成弥散条带。
    1. 向每个消化产物中加入3 µL的5×上样染料，混合两个消化产物后，将16.5 µL分别上样至三个相邻的泳道中。
    2. 在凝胶两端的泳道中加入20 nt DNA Marker，并在150 V电压下电泳90分钟（图8D）。
  5. 为纯化DNA文库，从凝胶中三个相邻泳道切下上方的PCR条带，并将其转移至新的1.5 mL离心管中。
  6. 使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化PCR扩增的文库，并使用荧光计按照制造商说明书对纯化后的DNA产物进行定量。

9. 最终PCR扩增以添加与测序仪兼容的条形码

  1. 按照步骤7.1中所述的方法，配制新鲜的10倍PCR缓冲液混合液。
  2. 设置PCR反应，包括一个阴性对照（无扩增子）和三个PCR反应，每个反应的三个试管中分别加入0.75 ng来自第一轮PCR扩增后纯化的PCR产物，具体如下：
    1. 通过将75 µL的ddH₂O与三个独立的PCR反应体系混合，建立三个独立的PCR反应。2O，10 µL 10x PCR 缓冲液，10 µL 10x dNTPs，1 µL 5' 2nd PCR 引物（即.，引物 i503（图1B)), 3' PCR 2 的 1 µLnd 引物（即引物 i702（图1B)，1 µL PCR产物（即.，0.75 ng 来自凝胶纯化的 1st PCR产物）和2 µL Titanium Taq聚合酶。
    2. 设置阴性PCR对照（即.，无DNA模板）通过混合76 µL ddH₂O2O，10 µL 10x PCR缓冲液，10 µL 10x dNTPs，1 µL 5' 2nd PCR 引物（即.，引物 i503（图1B)), 3' PCR 2 的 1 µLnd 引物（即 i702 引物）图1B），以及 2 µL Taq 聚合酶。
    3. 在已编程的PCR仪上设置四个PCR反应（即一个阴性对照，三个阳性样本），程序如下：72 °C 3 min，95 °C 30 s，随后进行9个循环：95 °C 10 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，接着72 °C 5 min，最后在10 °C下保存。
  3. PCR循环完成后，取10 µL反应混合物，加入3 µL上样染料，并在2.5%琼脂糖凝胶上进行产物分析，如图所示。 图9A，以及20 nt DNA标准marker。
  4. 在验证PCR产物大小后（即.，上端的PCR条带在164 bp处，如图所示 图9B 和 图6 根据最终构建体的大小和细节以及条带分布情况，将PCR产物分装至两个离心管中，每管加入135 µL PCR产物（即.，90 µL + 45 µL）、13.5 µL 5 M NaCl 和 650 µL 100% 乙醇，在 -20 °C 沉淀过夜。
  5. 第二天，将两个PCR管在16,000 × g 4 °C 下孵育 60 分钟。
  6. 将每份沉淀干燥后，用19.5 µL 1× PmeI缓冲液重悬，并加入0.5 µL PmeI，在37 °C摇床中孵育2小时，以进一步去除邻近泳道中可能扩散的大小标记物（即19 nt-3'接头、24 nt-3'接头）或RNA载体（即.、RNA提取载体、RNA 3'末端连接后载体）污染物。
  7. 在2.5%琼脂糖凝胶的三个加样孔中加入消化产物，于150 V电压下电泳分离90分钟。
  8. 切下在164 bp处的上条带（图9C），使用DNA提取试剂盒纯化DNA产物，并用荧光计进行定量。
  9. 将最终的PCR产物在DNA芯片上进行电泳，以验证文库的大小、浓度和纯度，然后进行稀释并使用测序仪分析。
  10. 将FASTQ数据文件转移至RNAworld分析流程，进行接头序列修剪、解复用及与人类基因组的比对，之后再进行miRNA分析，具体步骤如前所述41. 或者，可使用以下提供的脚本 补充文件 3，从FASTQ文件中解复用测序读段，并使用选定的小RNA分析流程进行后续处理。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如上述方案所述，我们描述了同时处理多达16个独立的小细胞外囊泡（sEV）RNA样本（即用于小非编码RNA和miRNA分析）的方法，这些样本在经过3'端加接头处理后，被整合到同一个文库中进行分析。本研究所选用的sEV是通过超速离心法从在泽西海岸大学医学中心（IRB#Pro2018-0425）确诊为三阴性乳腺癌女性患者的45 mL血浆中分离获得，具体方法此前已有描述37,40。分离后，根据MISEV2023指南42，采用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析以及荧光超分辨率纳米成像技术对超速离心获得的sEV进行了验证，随后进行稀释、分装、RNA提取及cDNA文库构建。我们的透射电镜分析显示，所获得的sEV纯度较高（图2），其粒径分布通过纳米颗粒分析仪得到进一步确认（图3）。此外，利用ONi超分辨率纳米成像技术，我们确认了人源四跨膜蛋白CD9、CD81和CD63存在于...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种cDNA文库构建方案，可用于对从小细胞外囊泡（sEVs）中高效分离的非编码RNA（包括微小RNA，miRNA）进行可重复且高灵敏度的下一代测序（NGS）。鉴于从全细胞来源或选择性分离的sEVs中回收的小分子非编码RNA和miRNA数量有限，我们致力于优化cDNA文库构建流程，以实现对sEVs中miRNA载荷的可重复且高灵敏度的分析。

在高效且选择性地分离 sEV-RNA 之前，首先需要进行 RNase-A 处理，以消除所有非 sEV 来源的 RNA 污染物。需要注意的是，该步骤可能无法去除与蛋白质结合的 RNA 序列，同时也有可能降解结构受损的 sEV 中的 RNA。作为第二步，为了最大化 sEV-RNA 的回收率，我们在 TRizol/Qiazol RNA 裂解缓冲液的下层相中加入 4 ng 的 RNA 载体寡核苷酸（即处于可避免被变性 RNase-A 降解的保护环境中），以帮助在后续柱纯化过程中尽量减少 RNA 损失。该 RNA 载体在其 3' 端含有一个 3C 间隔基，可防止其发生 3' 端接头连接，且其 5' 端缺乏磷酸基团，因此预计在后续酶促反应中保持惰性。...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. 是 EValuate Diagnostics, Inc. 的非受雇创始人，在该公司持有少量股权。其他作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Thomas Tuschl博士实验室的支持，感谢他们提供其实验室开发的原始技术，并允许我们使用RNAworld分析流程。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M 巯基乙醇SigmaO3445I-100 
20 nt 分子量标准 Marker Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL 牛血清白蛋白SigmaB8894-5ML 
50x Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
过硫酸铵Fisher Scientific 7727-54-0
蓝光透射仪 - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL 垂直凝胶电泳系统（含玻璃板和梳子）GIBCOV16
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD9170-5VL
Eppendorf 微型离心机 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
带 5 mm 滤膜的滤管IST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand 硅化低吸附微量离心管 1.5 mLFisher Scientific02-681-320
0.5 mL 凝胶破碎管IST Engineering Inc.3388-100
7 cm × 10 cm 凝胶电泳装置 - Mini-sub Cell GT（含凝胶托盘和梳子）Biorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 测序仪 Illumina20047256
Jersey-Cote（硅基溶液）LabScientific, Inc 1188
2 M KClAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge 双转子迷你离心机USA scientific2641-0016
Model V16 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（含玻璃板、梳子和垫片）Ciore Life Science21070010
寡核苷酸IDT订购时确定序列
Owl EasyCast B2 小型电泳系统（含凝胶托盘和梳子）Thermofisher ScientificB2
Qiaquick 凝胶回收试剂盒 Qiagen28704
Qubit 荧光计Thermofisher ScientificQ33238
限制性内切酶 PmeI 及 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
逆转录酶 - Superscript IIIThermoFisher12574026
无 RNase 水 AmbionAM9932
振荡器 - Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE 琼脂糖 Lonza50002
Superscript III 逆转录试剂盒 Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titanium Taq 聚合酶Takara639208
T4 RNA 连接酶 1 NEBM0204S
T4 RNA 连接酶 2 截短型 K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
带加热盖的 PCR 仪Applied Biosystem4359659
1 M Tris，pH 7.5 Invitrogen15567027
1 M Tris，pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel 系统浓缩液、稀释液和缓冲液National DiagnosticsEC-833

参考文献

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